本发明属于生物医药技术领域，本发明公开了一种交联淀粉生物合成重组基因cbii及其应用。
背景技术：
淀粉是仅次于纤维素、目前存在最为普遍、价格最为低廉的光能聚合载体之一；淀粉组成单一、易于储藏、用途广泛，是用于建材、纺织、造纸和石油开采的重要工业原料，尤其是其储藏的化学能易于再转化利用，为此，在战略高度重新认识淀粉方兴未艾。
淀粉来自植物种子(如水稻、小麦和玉米等)、块茎(如马铃薯等)等，因食物成分和淀粉特性等原因，马铃薯淀粉是广泛接受和使用的工业原料；我国马铃薯产区淀粉出粉率(生产每公斤淀粉所需块茎量)为1/(7-8),而发达国家为1/(3-4)，生产效率低下，其原因是我国产区淀粉含量仅为15％-18％。
育种是改良或获得品种的基本途径，其依据的原理是孟德尔和摩尔根的遗传原理，杂交是实现性状决定基因重组的基本途径，在欧美马铃薯杂交育种获得了目前80％以上广泛种植的品种，其中，用于淀粉加工目的的品种的淀粉含量均为20％以上。
在西欧，苏格兰农业科学咨询机构官方(爱丁堡)负责维护的欧洲马铃薯品种数据库，库中收集并详细记载了杂交育种获得品种的相关专利；hzpc、jalving、averis等是西欧主要的育种公司，其育种创制的马铃薯品种agria、desiree、bintje、ladyrosetta等被广泛栽培。
由北美联合培育的russet系列品种广泛应用，由此产生的专利包括pat.no.5,500,365,pat.no.5,387,756,pat.no.5,789,657,pat.no.5,503,999,pat.no.5,589,612,pat.no.5,510,253,pat.no.5,304,730,pat.no.5,382,429,pat.no.5,503,999,pat.no.5,648,249,pat.no.5,312,912,pat.no.5,498,533,pat.no.5,276,268,pat.no.4,900,676,pat.no.5,633,434,pat.no.4,970,168。
近年，在国际市场对淀粉巨大需求的驱动下，高出粉率、高粘度等高品质淀粉更是炙手可热，过去十多年，国际化工巨头、如荷兰avbe和德国basf等纷纷投资于淀粉品质改良的育种研究，在取得了许多育种成果，其中具有代表性的是获得了基因工程改良的马铃薯品种amflora。
amflora块茎淀粉中支链淀粉含量在95％以上，由amflora加工的淀粉，只需传统马铃薯淀粉用量的五分之一，即可达到同样的使用效果；迫于自然主义者的压力，欧盟多年来一直抵制在西欧种植转基因作物，但鉴于amflora淀粉的巨大诱惑，basf公司2010获欧盟授权，批准其在欧洲种植amflora。
淀粉不仅是人类生存所需食物的成分，由淀粉生产的燃料乙醇正在成为动力能源之一，因此，淀粉也是人类活动所需能源的组成部分，鉴于人们对淀粉含有的能量寄予的厚望，未来对淀粉的巨大需求显而易见，大幅增加植物淀粉积累，过去是、今天更是人类面临的重大课题。
淀粉由两类葡萄糖苷聚合物组成,一是葡萄糖alfa-1,4线性连接占绝大部分的直链淀粉,二是在alfa-1,4连接链有多处alfa-1,6分支连接的支链淀粉；直接参与淀粉的生物合成的主要酶有：腺苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶(agpase.ec2.7.7.27))、可溶性淀粉合成酶(sss)、与淀粉粒结合的淀粉合成酶(gbss)、淀粉分支酶(be)、淀粉去分支酶(dbe)。
细菌agpase是由glgc基因编码的同源四聚体，高等植物的agpase是异源四聚体(异源四亚基复合体),两个相同的大亚基和两个相同的小亚基，小亚基(ss)行使agpase的代谢功能，大亚基(ls)主要调控agpase活性,变构因子诱导的异构调控是agpase主要的调控形式。
细菌agpase同源四聚体的单个亚基、植物agpase异源四聚体的小亚基在其以寡聚体状态存在时，其n端的代谢基团行使adp-葡萄糖合成的功能，即以磷酸葡萄糖和atp为底物，合成adp-葡萄糖，adp-葡萄糖是alfa-1,4或alfa-1,6糖苷链延伸的底物。
大肠杆菌k12突变菌株618中agpase亚基g336d突变使其agpase活力提高33％，在35s启动子驱动下，表达618菌株agpase编码基因glgc16马铃薯体内，agpase活力和块茎淀粉含量提高30％以上，表达g336d突变glgc木薯体内，使其agpase活力提高70％，块根淀粉含量提高2倍以上。
研究业已表明，植物agpase小亚基以寡聚体形式存在时表现活性，推动淀粉合成，当两小亚基第82位半胱氨酸间形成分子内二硫键(二聚体)时agpase失活，抑制淀粉合成；众多变构因子影响植物agpase小亚基第82位半胱氨酸的氧化还原状态，使其对调控敏感。
细菌agpase取代植物agpase，未见agpase代谢亚基二聚体形成，淀粉合成不受抑制，这也是glgc16马铃薯体内表达提高agpase活力的原因。植物体内agpase编码基因转录、agpase活力和淀粉合成三者中，agpase表达水平和其活力水平变化弹性强提高植物agpase活力是增加淀粉生物合成的途径。
然而，在进一步实验中发现，用patatin启动子驱动glgc16在马铃薯体内表达，虽然转化株系体内的agpase活力显著增强，但块茎淀粉含量和对照无显著差异,即glgc16植物体内表达结果无法再现。其中可能原因包括glgc16自身和启动子等方面。
目前，改变直、支链淀粉的比例，主要是通过对gbss、sss和sbe及dbe等酶的操作来实现的。利用反义rna技术，马铃薯体内表达反义的gbssi，导致gbssi活性下降或丧失，进而导致马铃薯块茎中直链淀粉含量减少70％-100％。
相反，在无直链淀粉的马铃薯块茎中表达gbssi基因，互补直链淀粉合成的缺乏。将含第一个内含子的wxcdna反向连接在wx和玉米adh1启动子并导入水稻中，在转基因水稻胚乳中直链淀粉的含量下降，同时在未成熟的胚乳中内源wxmrna水平也降低了，使淀粉品质发生改变。
反义rna能与其正义mrna互补结合,使其编码的蛋白质不能合成，从而抑制其功能的发挥。反义rna的优势如下:⑴反义rna抑制特异基因表达。⑵低丰度的反义rna同样可以产生高效的阻抑作用。⑶反义rna不能翻译产生蛋白质,具有高的安全性。⑷技术操作简单易行,适用范围广。
gbssi反义rna抑制gbssi的表达,获得减少直链淀粉合成或只合成支链淀粉，但并未增强淀粉生物合成和增加淀粉的积累量。
技术实现要素：
本发明的目的在于克服上述技术存在的缺陷，获得既可抑制直链淀粉合成，又可增强淀粉含量的重组基因，提供一种交联淀粉生物合成重组基因cbii及其应用。
本发明具备以下特征，1)重组基因由gbssip:glgc和gbssip:anti-gbssi两部分组成；2)重组基因植物体内表达可使agpase活力比对照提高50％；3)重组基因植物体内表达可使马铃薯块茎直链淀粉减少至10％(对照为20％)；4)重组基因植物体内表达可减少昼夜周期对淀粉生物合成的调控；5)重组基因植物体内表达可使马铃薯块茎淀粉含量高于对照28％以上，淀粉粘度高于对照55％以上。
其具体技术方案为：
一种交联淀粉生物合成重组基因cbii，其核苷酸序列如seqidno:2所示。
一种交联淀粉生物合成重组基因cbii在淀粉生物合成过程中的应用。
与现有技术相比，本发明的有益效果为：
经体内外多次反复不同宿主基因型实验表明，35s:glgc::gbssi:anti-gbssi植物体内表达可同时提高agpase活力，增加贮藏器官淀粉积累，提高淀粉粘度，且不需在其末端添加转运肽编码序列，克服只有反义gbssi表达不能增加淀粉积累的不足。
附图说明
图1是重组基因cbii示意图。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施例对本发明的技术方案作进一步详细地说明。
本发明从大肠杆菌jm109-3突变株中分离获得了腺苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶编码基因的glgc55(genbank:ay943834)，从马铃薯分离获得了与淀粉粒结合的淀粉合成酶编码基因gbssicdna(dq387451)和其启动子dna。
glgc55编码431个氨基酸组成的agpase亚基(aay18580)，其中有4处特异突变，它们分别是k39e,v71a,i248v和k304e，前两者出现在寡聚亚基n端代谢基团的rossmann折叠区域内，后两者出现在寡聚亚基c端异构调控和寡聚化的lbh基团内。
本发明运用glgc55、gbssicdna和其启动子dna，构建了gbssi:glgc::gbssi:anti-gbssi重组基因，重组基因在目标植物体内表达，可实现提高淀粉生物合成的同时，增加支链淀粉组分的含量。重组基因组成示意如图1所示。
目的glgc获得
按照lee等的方法提取大肠杆菌jm109基因组dna，以其为模板，按照《分子克隆实验指南》p672-683的方法，以glgc-f：5’-gagttagccatggttagtttagag-3’，glgc-r：5’-aaagatctctgaacatacatg-3’.为引物，在95℃预变性4min、95℃变性30sec、53℃退火45sec、72℃延伸1min、反应30个循环、最后72℃延伸10min、4℃保存的反应条件下进行pcr，pcr产物纯化回收(promega；wizardsvgelandpcrclean-upsystem)后，用回收产物和pgem-t载体(promega，pgem-tvectorsystems,a1360)建立连接反应，按照pgem-t载体说明书的方法，将连接产物转化dh5α(takara公司)感受态细胞，将转化后的感受态细胞均匀涂布于含氨苄青霉素的lb固体琼脂平板上，37培养12小时后挑选白色菌落，接种于含有氨苄青霉素的液体lb培养基中，振荡培养12小时。按照《分子克隆实验指南》p19-23的方法，提取菌液质粒dna，充分洗涤后，用ncoi和bglii双酶切鉴定，鉴定正确的单克隆所含质粒为pc-glgc，扩大培养含pc-glgc重组菌，并对pc-glgc中目的glgc测序，测序结果在genbank注册，其注册号为ay943834。
gbssi启动子的获得
按照《分子克隆实验指南》p672-683的方法，ctab方法提取马铃薯基因组dna，并其为模板，以ph-f：5’-tccttccttttagcagtgtatcaat-3’，ph-r：5’-gaacttgatctttgtgggt-3’为引物，设置95℃预变性4min、95℃变性30sec、53℃退火45sec、72℃延伸1min、反应30个循环、最后72℃延伸10min、4℃保存的反应条件进行pcr，pcr产物纯化回收(promega；wizardsvgelandpcrclean-upsystem)后，用回收产物和pgem-t载体(promega，pgem-tvectorsystems,a1360)建立连接反应，按照pgem-t载体说明书的方法，将连接产物转化dh5α(takara公司)感受态细胞，将转化后的感受态细胞均匀涂布于含氨苄青霉素的lb固体琼脂平板上，37培养12小时后挑选白色菌落，接种于含有氨苄青霉素的液体lb培养基中，振荡培养12小时。按照《分子克隆实验指南》p19-23的方法，提取菌液质粒dna，充分洗涤后，《分子克隆实验指南》p237-259的方法，用ncoi和bglii(takara公司)双没切鉴定，鉴定正确的单克隆所含质粒为pg-gbssip，扩大培养含pg-gbssip重组菌，并对pg-gbssip中目的gbssip测序，正确gbssip序列在genbank注册号为ay948720。
gbssicdna的获得
按照rna提取试剂盒(amresco公司，k312-50rxn)说明书，提取马铃薯叶片总rna，以其为模板，以he-f：5’-gccaaacttcactagacacc-3’、he-r：5’-ttgatgggtatgagaagcc-3’为引物，用cdnasynthesis试剂盒(takara公司，6130)说明书完成rt-pcr，pcr产物纯化回收(promega；wizardsvgelandpcrclean-upsystem)后，用回收产物和pgem-t载体(promega，pgem-tvectorsystems,a1360)建立连接反应，按照pgem-t载体说明书的方法，将连接产物转化dh5α(takara公司)感受态细胞，将转化后的感受态细胞均匀涂布于含氨苄青霉素的lb固体琼脂平板上，37培养12小时后挑选白色菌落，接种于含有氨苄青霉素的液体lb培养基中，振荡培养12小时。按照《分子克隆实验指南》p19-23的方法，提取菌液质粒dna，充分洗涤后，用ncoi和ecori双酶切鉴定，鉴定正确的单克隆所含质粒为pg-gbssi，扩大培养含pg-gbssi重组菌，并对pg-gbssi中目的gbssi测序，测序结果在genbank注册，其注册号为dq387451。
重组35s:glgc获得
lb液体培养基分别培养含有pg-glgc和pc-0380的大肠杆菌，分别提取pg-glgc和pc-0380质粒dna，按照《分子克隆实验指南》p237-259的方法，分别建立酶切反应，用ncoi和bglii酶切pg-glgc，纯化回收glgcdna片段；用ncoi和bglii酶切pc-0380，纯化回收pc-0380载体框架dna片段；按照t4dna连接酶(takara公司d2011a)说明书的方法，建立连接反应，将glgc连接于35s启动子下游；按照《分子克隆实验指南》p976-982的方法，将连接产物转化大肠杆菌dh5α(takara公司)感受态细胞。将转化后的感受态细胞均匀涂布于含氨苄青霉素的lb固体琼脂平板上，37培养12小时后挑选菌落，接种于含有氨苄青霉素的液体lb培养基中，振荡培养12小时。按照《分子克隆实验指南》p19-23的方法，提取菌液质粒dna，充分洗涤后，《分子克隆实验指南》p237-259的方法，用ncoi和bglii(takara公司)双没切鉴定，鉴定正确的单克隆所含质粒为pc-glgc，扩大培养含pc-gp重组菌，并对pc-glgc中目的glgc测序，获得序列正确pc-glgc，其中包含重组基因35s:glgc。
gbssip:anti-gbssicdna构建
将pg-gbssip和表达载体pet-28(c)分别用ncoi和saci双酶切，目的片段和载体分别回收、纯化后连接，得到重组质粒pe-gp，经psti和xbai双酶切得到约1100bp片段，hindiii单酶切得到1000bp的片段。证明gbssi启动子已经连接到pet-28(c)的多克隆位点mcs上，重组质粒pe-gp。
提取质粒pe-gp，psti和xbai双酶切后回收、纯化小片段，大约为1.1kb。同时用psti和xbai双酶切pc-glgc质粒dna，回收大片段，约13kb。t4连接酶连接16h后转化大肠杆菌jm109感受态细胞中。在涂有iptg/x-gal/kan的固体琼脂平板上挑取白色菌落，提取质粒dna，用psti和xbai双酶切得到的小片段大约有1.2kb，与目的片段大小相符。同时用hindiii酶切鉴定，得到三个片段，大片段与载体大小相当，另两条片段大小分别约为1600bp和900bp，与预期结果相符。证实gbssi启动子连接在pc-glgc载体mcs的psti和xbai之间。得到的重组质粒命名为pc-ggp’。
gbssip:glgc构建
将质粒pg-gbssip用ncoi和psti双酶切，得到gbssip启动子片段，同时将载体pc-glgc用ncoi和psti双酶切,回收、纯化载体骨架dna片段,用t4连接酶连接，再转入宿主菌jm109中，得到重组质粒pc-gpg。pc-gpg经hindiii酶切后得到大小约1000bp左右的片段，同时用bamhi单酶切进一步验证，得到约1200bp的片段，酶切片段大小与预期相符，证明了在重组质粒pc-gpg含有重组基因gbssi:glgc。
gbssip:glgc::gbssip构建
将pg-gbssi和载体pet-28(c)分别用ncoi和saci双酶切，目的片段和载体分别回收、纯化后连接，得到重组质粒pe-gp，经psti和xbai双酶切得到约1100bp片段，hindiii单酶切得到1000bp的片段，获得重组质粒pe-gp。用psti和xbai双酶切质粒pc-gpg和pe-gp，回收、纯化、连接、转化后得到重组质粒命名为pc-pgp’，psti和xbai双酶切和hindiii单酶切鉴定正确。
gbssip:glgc::gbssip:anti-gbssi构建
saci和xbai分别酶切粒pc-pgp’和pg-gbssi，回收、纯化载体和目的片段gbssi，连接转化大肠杆菌jm109，挑取单菌落，培养后提取质粒，用scai和xbai双酶切、psti单酶切鉴定，获得重组质粒pcb2，其中含有目的基因gbssip:glgc::gbssip:anti-gbssi。
重组基因功能检测
按照visser等的方法，以马铃薯无菌苗直径2-4mm茎段为外植体，用农杆菌介导途径转化目的基因35s:glgc和gbssip:glgc于马铃薯体内；pcr阳性转化株系，经过southern杂交(北京美莱博医学科技有限公司,法地高辛标记试剂盒，地高辛杂交检测试剂盒)获得单拷贝插入株系，rt-pcr和northern杂交(北京美莱博医学科技有限公司,法地高辛标记试剂盒，地高辛杂交检测试剂盒)鉴定目的基因是否转录，用yao等的方法测定agpase活力，用淀粉测试盒(bioassay公司，enzychromstarchassaykit)测定块茎淀粉含量，块茎直链淀粉含量按照hovenkamp-hermelink等的方法进行；充分洗净且干燥的淀粉，制成4％(w/v)悬浮液,依据3mm(上海申谊玻璃制品有限公司)毛细管粘度计法测定淀粉粘度。
通过pcr等方法，在体外条件下通过点突变实现本发明所用glgc55编码蛋白质中的4个突变，获得glgc55同样的dna序列；另外，本发明用技术方案中描述的酶切连接获得35s:glgc::gbssi:anti-gbssi重组基因，通过与此不同的其它酶切连接，也可获得重组基因35s:glgc和gbssi:glgc。
以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，本发明的保护范围不限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明披露的技术范围内，可显而易见地得到的技术方案的简单变化或等效替换均落入本发明的保护范围内。
序列表
<110>宁夏大学
<120>一种交联淀粉生物合成重组基因cbii及其应用
<160>1
<170>siposequencelisting1.0
<210>1
<211>6540
<212>dna
<213>人工序列(artificialsequence)
<400>1
tccaccatgttggcaagctgctctagccaatacgcaaaccgcctctccccgcgcgttggc60
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