编码人胆碱乙酰转移酶或其融合蛋白的核酸序列及其用途的制作方法

本发明属于生物医药领域，涉及一种编码人胆碱乙酰转移酶或其融合蛋白的核酸序列及其用途。本发明还涉及含有该核酸序列的重组载体、含有该重组载体的重组宿主细胞以及一种制备转导肽-人源胆碱乙酰基转移酶融合蛋白的方法。
背景技术：
：1943年发现胆碱乙酰转移酶(cholineacetyltransferase，chat，ec2.3.1.6)，是神经递质乙酰胆碱(acetylcholine，ach)的生物合成酶(nachmansohnd,machadoal.theformationofacetylcholine.anewenzyme:cholineacetylase.jneurophysiol.1943；6:397-403)，特异性反应胆碱能神经元功能状态，也是胆碱能神经系统的标志酶。ach是第一个被确定的神经递质(loewio.pflugersarchgesamtephyiol,1921，189:239-242)，chat作为ach的合成酶，其与ach的分布颇为一致。chat与ach广泛地存在于外周和中枢神经系统。在外周神经系统中，ach是副交感神经的节前和节后纤维，以及交感神经的节前纤维和躯体运动神经纤维的神经递质。在中枢神经系统中，chat与ach在脑内分布广泛，脊髓前角运动神经元、丘脑特异性感觉传入通路第三级神经元、脑干网状结构上行激动系统的各个环节、大脑皮质内、边缘系统内、基底神经节尾状核均属于或存在着胆碱能神经元。由胆碱能神经元发出的纤维广泛投射到中枢神经系统多个部位，主要包括胆碱能躯体运动和内脏运动系统；胆碱能脑干网状结构上行激动系统；胆碱能大脑皮质和边缘系统以及胆碱能小脑系统。通过在神经肌肉接头的ach囊泡量子释放，将中枢和脊髓的运动指令传递到运动单元肌细胞，对于肌肉的力量生成是必需的，因此神经肌肉接头也是肌无力和运动性疲劳产生的一个重要位点。疲劳是一个的世界性的难题。1978年，edwards将疲劳从起因上区分为中枢性疲劳(定位于中枢神经系统)和周围性疲劳(定位于骨骼肌内部或神经肌肉联结的部位)。brooks认为，运动性疲劳表现为运动肌工作能力下降，从周围到中枢各个环节都有可能发生，很难孤立地将其完全区分开。胆碱能神经系统除支配机体运动外、与神经精神功能，如学习与记忆，觉醒与睡眠等密切相关。早老性痴呆(ad)病人的基底前脑胆碱能神经元的特异性丢失，肌萎缩性侧索硬化(als)和亨廷森氏病也是胆碱能神经元受到影响的神经元退行性疾病，此外精神分裂症及婴儿猝死综合症与胆碱能功能障碍也密切相关。脑内chat含量的降低或酶活性的变化直接反应胆碱能神经元功能的变化。因此chat与许多胆碱能神经系统疾病密切相关。增加chat的表达可促进神经递质ach的合成，可以有效地改善学习记忆和老年人因ach分泌不足而引起的各种衰老症状，如老年人胃肠道括约肌、骨骼肌神经肌肉接头及自主神经节前纤维和副交感神经节后纤维ach释放量的不足导致的老年性肌无力和行动迟缓，及胃液及肠液的反流诱发炎症和癌变，以及性功能低下原因等等。chat是分子量为69kd的大分子蛋白，神经细胞合成后，经轴浆转运至突触处生物合成神经递质ach。但是外源给予chat后，chat并不能进入靶细胞内，发挥其生理功能。因此需要有可以引导或携带chat穿透细胞膜的载体，将外源chat引入细胞内。转导肽技术的出现为chat蛋白质分子高效通过血脑屏障治疗神经系统疾病，提供了一条有效的新的治疗途径。转导肽是一种能高效穿过生物膜的蛋白转导结构域(proteintransductiondomain，ptd)，它能将与其共价连接的多肽、蛋白质及dna等分子跨膜导入几乎所有的组织和细胞，包括破骨细胞、外周血单核细胞及原代细胞等常规方法难以转染的细胞，甚至还可以穿过血脑屏障(schwarzesr,dowdysf,trendspharmacolsci.2000,21(2):45-8)。1988年green(cell.1988,55:1179-1188)发现hiv的tat蛋白能够高效地自由的进出细胞。1994年fawell(procnatlacadsciusa.1994jan18；91(2):664-8.)将tat的36aa的区域化学交连到异源蛋白上后，交联蛋白也可转导入细胞内。schwarzesr,etal.(science,1999,285:1569-1572.)将tat的ptd区域短肽与大分子半乳糖苷酶在原核细胞中融合表达后，将融合蛋白在小鼠体内注射，发现有活性的酶分子在体内的各组织中都有表达，尤为重要的是短肽可以携带大分子通过血脑屏障。转导肽是一段富含精氨酸的多肽。tat能自动跨过细胞膜是由于tat蛋白上位于47－57(ygrkkrrqrrr)位的一段多肽的作用。除tat肽外，来自果蝇触角足同源异型转录因子antp的43-58位的多肽序列(derossid,etal.thejournalofbiologicalchemistry.1996,27(30):18188-18193.)；来自疮疹单病毒dna结合蛋白vp22的267-300序列(elliottc,oharep.cell.1997,88:223-233)均具有与tat肽完全相似的转导功能和转导机制，它们也因此被统称为ptd(fordkg,etal.genetherapy.2001,8:1-4)。然而，目前人胆碱乙酰转移酶或其融合蛋白的表达困难，容易形成包涵体或者表达量极低。国外文献[ae-rikima,amandadoherty_kirbya,gilleslajoiea,r.janerylettb.c,brianh.shiltona.twomethodsforlarge-scalepurificationofrecombinanthumancholineacetyltransferaseprareinexpressionandpurification.2005(40):107-117]中chat的基因工程表达，主要是在chat的n端添加纯化标签，如cbd，6×his等，但表达水平分别为91.5mg/l和66mg/l。因此，尚需要开发更为有效的人胆碱乙酰转移酶或其融合蛋白的制备工艺。技术实现要素：本发明人经过深入的研究和创造性的劳动，发现了一种新的编码人胆碱乙酰转移酶人胆碱乙酰转移酶或其融合蛋白的核酸序列。本发明人惊奇地发现，该核酸序列能够高效地表达人胆碱乙酰转移酶或其融合蛋白，其表达量能够达到1g/l甚至1.25g/l，远远高于现有技术；并且产物的酶活性高，蛋白纯度高，生产强度低。由此提供了下述发明：本发明的一个方面涉及一种分离的核酸序列，其如seqidno:1或seqidno:7所示。本发明还涉及一种分离的核酸序列，其由seqidno:1所示核酸序列、转导肽编码序列组成；优选地，其还包含linker编码序列；优选地，linker编码序列位于seqidno:1所示核酸序列和转导肽编码序列之间。在本发明的一个实施方案中，所述的分离的核酸序列，其中，所述转导肽为反式激活蛋白tat的ptd序列、果蝇同源异型转录因子antp和单纯包疹病毒ⅰ型vp22转录因子的ptd序列或其功能性类似物或片段；优选地，所述转导肽的氨基酸序列如seqidno:4所示；优选地，所述转导肽的编码序列如seqidno:3所示。在本发明的一个实施方案中，所述的分离的核酸序列，其中，所述linker的氨基酸序列为gggs、gg或gs；优选地，所述linker的氨基酸序列如seqidno:6所示；优选地，所述linker的编码序列如seqidno:5所示。本发明的另一方面涉及一种重组载体，其含有本发明中任一项所述的分离的核酸序列；优选地，所述重组载体为重组表达载体。优选地，本发明所述表达载体为原核表达载体或真核表达载体，包括但不限于pet、pbv220、pgex、pcdna或pet15b。本发明的再一方面涉及一种重组宿主细胞，其含有本发明的重组载体；优选地，所述重组宿主细胞为重组的大肠杆菌细胞，例如重组的大肠杆菌bl21细胞。本发明的再一方面涉及一种制备chat蛋白或其融合蛋白的方法，包括使用本发明中任一项所述的分离的核酸序列、本发明的重组载体或者本发明的重组宿主细胞表达chat蛋白或其融合蛋白的步骤。本发明的再一方面涉及本发明中任一项所述的分离的核酸序列、本发明的重组载体或者本发明的重组宿主细胞在制备chat蛋白或其融合蛋白中的用途。在本发明的一个实施方案中，通过将所述核酸分子导入原核表达载体pet15b中，通过原核细胞培养获得与转导肽融合表达的人源chat。本发明的再一方面涉及本发明中任一项所述的分离的核酸序列、本发明的重组载体或者本发明的重组宿主细胞在制备治疗和/预防肌无力、提高抗疲劳能力或增强运动能力的药物中的用途。在本发明的一个实施方案中，所述的用途，其中，所述肌无力疾病为重症肌无力、老年肌肉衰减综合症、肌萎缩性侧索硬化、先天性肌无力综合症或肌营养不良综合征；所述疲劳为运动性疲劳。本发明的再一方面涉及一种药物组合物，其包含有效量的chat蛋白或其融合蛋白，以及一种或多种药学上可接受的辅料，并且所述辅料至少包含吐温80；优选地，所述辅料还包含选自海藻糖、甘露醇和peg4000中的任意一种或者几种。在本发明的一个实施方案中，所述药物组合物为粉针剂例如冻干粉针剂。在本发明的一个实施方案中，所述的药物组合物，其中：吐温80的含量为1％－25％，海藻糖的含量为0％－10％，甘露醇的含量为0％－1％，和/或peg4000的为0％－0.1％。在本发明的一个实施方案中，优选地，吐温80的含量为10％－25％，例如10％－15％、10％－20％、15％－25％、15％－20％、15％－18％、20％－25％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％、20％、21％、22％、23％、24％或25％。在本发明的一个实施方案中，优选地，海藻糖的含量为0％－5％，例如0％、0.5％、1％、2％、3％、4％或5％。在本发明的一个实施方案中，优选地，甘露醇的含量为0％－1％，例如0％、0.1％、0.2％、0.3％、0.4％、0.5％、0.6％、0.7％、0.8％、0.9％或1％。在本发明的一个实施方案中，优选地，peg4000的含量为0％－0.1％，例如0％、0.01％、0.02％、0.03％、0.04％、0.05％、0.06％、0.07％、0.08％、0.09％或0.1％。在本发明的一个实施方案中，所述的药物组合物，其中，所述融合蛋白为chat与转导肽的融合蛋白；优选地，所述转导肽为反式激活蛋白tat的ptd序列、果蝇同源异型转录因子antp和单纯包疹病毒ⅰ型vp22转录因子的ptd序列或其功能性类似物或片段；优选地，所述转导肽的氨基酸序列如seqidno:4所示；优选地，所述转导肽的编码序列如seqidno:3所示。本专利重组表达的chat为未添加纯化标签的重组蛋白，依据重组蛋白的理化性质，采用阳离子交换层析及疏水层析方法设计纯化方案，获得纯度>90％以上的重组蛋白。本发明中，所述百分含量(％)，如果没有特别说明，是指重量百分比含量(wt％)。发明的有益效果本发明取得了下述效果中的一项或者几项：(1)本发明能够高效地表达人胆碱乙酰转移酶或其融合蛋白，其表达量能够达到1g/l甚至1.25g/l，远远高于现有技术。(2)制备的人胆碱乙酰转移酶或其融合蛋白的酶活性高。(3)制备的人胆碱乙酰转移酶或其融合蛋白的蛋白纯度高。(4)制备人胆碱乙酰转移酶或其融合蛋白的工艺的生产强度低。(5)本发明制成的转导肽-chat制剂能够更好地保存chat的酶活性。(6)chat是分子量为69kd的大分子蛋白，因此不能通过血脑屏障。中枢神经系统疾病必须中枢给药，目前中枢给药方法，主要有植入法、移植法、侧脑室注射法、及神经祖细胞脑内移植法等，都存在操作复杂、技术要求高、危险性大(感染、意外事故等)等问题。利用转导肽技术，本发明人成功实现了将人源胆碱乙酰基转移酶(chat)输入机体并高效通过血脑屏障的目的，从而使临床用药更为安全、方便，并使作为肌无力疾病的自我长期用药、预防用药及抗疲劳保健服用成为现实。本发明所述方法与将蛋白引入细胞的传统方法如微注射、穿孔蛋白及脂质体法等相比，转导肽介导的蛋白转导有着显著的优越性。附图说明图1：转导肽-chat诱导表达后柱层析纯化图谱。图2：转导肽-chat融合蛋白柱层析纯化后sds-page电泳分析。泳道1，预染蛋白标志物；泳道2，浓缩液；泳道3－5，洗脱组分a10－a12；泳道6－9，洗脱组分b1－b4；泳道10，洗脱组分b8；泳道11，洗脱组分b10；泳道12，洗脱组分b12。洗脱液，pbs。图3：不同的添加剂对酶活性的影响。图4：老年鼠注射ptd-chat后水迷宫潜伏期的变化。图5：老年鼠注射ptd-chat后避暗实验犯错次数的变化。图6：老年鼠注射ptd-chat后体重的变化。图7：老年鼠注射ptd-chat后前肢抓力的变化。图8：老年鼠注射ptd-chat后转棒时间的变化。图9：老年鼠直肠给予ptd-chat后水迷宫潜伏期的变化。图10：老年鼠直肠给予ptd-chat后避暗实验犯错次数的变化。图11：老年鼠直肠给予ptd-chat后体重的变化。图12：老年鼠直肠给予ptd-chat后前肢抓力的变化。图13：老年鼠直肠给予ptd-chat后转棒时间的变化。本发明涉及的序列信息如下：表1：序列信息seqidno:描述长度1chat核酸序列1893bp2chat氨基酸序列630aa3转导肽核酸序列33bp4转导肽氨基酸序列11aa5linker核酸序列12bp6linker氨基酸序列4aa7编码融合蛋白的核酸序列1938bp8融合蛋白的氨基酸序列645aachat核酸序列：1893bpatggctgcgaaaaccccgtcttctgaagaatctggcctgccgaaactgccggtccctccgctgcagcagaccctggctacgtacctgcagtgcatgcgccacctggttagcgaagaacagttccgtaaatcccaggctattgtacagcagttcggcgcgccgggcggcctgggtgagaccctgcagcaaaaactgctggaacgccaggaaaaaaccgcgaactgggtatctgaatactggctgaacgacatgtatctgaacaaccgtctggctctgccagtaaacagctctccggctgttatctttgctcgccagcactttccgggtactgatgaccagctgcgtttcgcggcatccctgatctccggcgtgctgagctacaaagccctgctggactctcattctatcccaactgactgcgccaaaggccaactgagcggtcagccactgtgcatgaaacagtactacggtctgtttagctcttaccgtctgccgggccacacccaggacactctggtagctcaaaattctagcatcatgccggaaccggaacatgttattgttgcttgctgcaaccagtttttcgtcctggacgttgtcatcaacttccgccgtctgtctgaaggtgacctgtttacccagctgcgtaaaatcgttaagatggcgtctaacgaagatgaacgcctgccgccgatcggcctgctgacctctgatggtcgttccgagtgggctgaagcgcgtaccgttctggtaaaagactccaccaatcgtgattctctggacatgattgagcgctgtatctgtctggtttgtctggacgccccgggtggcgttgaactgtccgatacccaccgcgctctgcaactgctgcacggtggtggttattctaaaaatggtgccaaccgttggtacgataaatccctgcagtttgttgtcggtcgtgacggcacttgcggtgttgtgtgcgaacacagcccgttcgatggtattgtactggtgcaatgcactgaacacctgctgaaacacgttactcagagctctcgtaaactgatccgtgccgattccgtgtccgaactgccggctccgcgtcgcctgcgttggaaatgttccccggaaattcagggccatctggcctcttctgcggaaaagctgcagcgcattgttaagaacctggattttattgtgtacaagttcgacaattatggtaaaaccttcatcaaaaaacagaaatgcagccctgatgcgtttattcaggtggctctgcagctggctttctaccgtctgcaccgtcgcctggttccaacctatgaaagcgccagcatccgccgtttccaggagggccgcgtagacaacattcgttctgctaccccagaggccctggcgtttgttcgtgcggtgacggatcacaaagcggcggtcccggcgtccgaaaaactgctgctgctgaaagacgctatccgtgcacagaccgcgtataccgtcatggcaattacgggtatggcgattgacaaccacctgctggctctgcgtgaactggctcgtgccatgtgcaaagaactgccggaaatgttcatggatgaaacgtacctgatgtctaatcgtttcgtcctgtccaccagccaggtgccgaccacgaccgaaatgttttgctgctatggccctgtcgtgccaaacggttatggcgcgtgctacaaccctcagccggaaacgattctgttctgcatcagcagcttccactcttgtaaagaaacgtcctcttctaaatttgctaaagctgtggaagaatccctgatcgatatgcgtgacctgtgctctctgctgccgccaacggaatccaagccgctggcaacgaaagaaaaagctacccgcccgagccagggtcatcagccttaa(seqidno:1)chat氨基酸序列：630aamaaktpsseesglpklpvpplqqtlatylqcmrhlvseeqfrksqaivqqfgapgglgetlqqkllerqektanwvseywlndmylnnrlalpvnsspavifarqhfpgtddqlrfaaslisgvlsykalldshsiptdcakgqlsgqplcmkqyyglfssyrlpghtqdtlvaqnssimpepehvivaccnqffvldvvinfrrlsegdlftqlrkivkmasnederlppiglltsdgrsewaeartvlvkdstnrdsldmierciclvcldapggvelsdthralqllhgggysknganrwydkslqfvvgrdgtcgvvcehspfdgivlvqctehllkhvtqssrkliradsvselpaprrlrwkcspeiqghlassaeklqrivknldfivykfdnygktfikkqkcspdafiqvalqlafyrlhrrlvptyesasirrfqegrvdnirsatpealafvravtdhkaavpasekllllkdairaqtaytvmaitgmaidnhllalrelaramckelpemfmdetylmsnrfvlstsqvptttemfccygpvvpngygacynpqpetilfcissfhscketssskfakaveeslidmrdlcsllppteskplatkekatrpsqghqp(seqidno:2)转导肽核酸序列：33bptatggtcgtaaaaaacgtcgtcagcgccgtcgc(seqidno:3)转导肽氨基酸序列：11aaygrkkrrqrrr(seqidno:4)linker核酸序列：12bpggtggtggtagc(seqidno:5)linker氨基酸序列：4aagggs(seqidno:6)编码融合蛋白的核酸序列：1938bptatggtcgtaaaaaacgtcgtcagcgccgtcgcggtggtggtagcatggctgcgaaaaccccgtcttctgaagaatctggcctgccgaaactgccggtccctccgctgcagcagaccctggctacgtacctgcagtgcatgcgccacctggttagcgaagaacagttccgtaaatcccaggctattgtacagcagttcggcgcgccgggcggcctgggtgagaccctgcagcaaaaactgctggaacgccaggaaaaaaccgcgaactgggtatctgaatactggctgaacgacatgtatctgaacaaccgtctggctctgccagtaaacagctctccggctgttatctttgctcgccagcactttccgggtactgatgaccagctgcgtttcgcggcatccctgatctccggcgtgctgagctacaaagccctgctggactctcattctatcccaactgactgcgccaaaggccaactgagcggtcagccactgtgcatgaaacagtactacggtctgtttagctcttaccgtctgccgggccacacccaggacactctggtagctcaaaattctagcatcatgccggaaccggaacatgttattgttgcttgctgcaaccagtttttcgtcctggacgttgtcatcaacttccgccgtctgtctgaaggtgacctgtttacccagctgcgtaaaatcgttaagatggcgtctaacgaagatgaacgcctgccgccgatcggcctgctgacctctgatggtcgttccgagtgggctgaagcgcgtaccgttctggtaaaagactccaccaatcgtgattctctggacatgattgagcgctgtatctgtctggtttgtctggacgccccgggtggcgttgaactgtccgatacccaccgcgctctgcaactgctgcacggtggtggttattctaaaaatggtgccaaccgttggtacgataaatccctgcagtttgttgtcggtcgtgacggcacttgcggtgttgtgtgcgaacacagcccgttcgatggtattgtactggtgcaatgcactgaacacctgctgaaacacgttactcagagctctcgtaaactgatccgtgccgattccgtgtccgaactgccggctccgcgtcgcctgcgttggaaatgttccccggaaattcagggccatctggcctcttctgcggaaaagctgcagcgcattgttaagaacctggattttattgtgtacaagttcgacaattatggtaaaaccttcatcaaaaaacagaaatgcagccctgatgcgtttattcaggtggctctgcagctggctttctaccgtctgcaccgtcgcctggttccaacctatgaaagcgccagcatccgccgtttccaggagggccgcgtagacaacattcgttctgctaccccagaggccctggcgtttgttcgtgcggtgacggatcacaaagcggcggtcccggcgtccgaaaaactgctgctgctgaaagacgctatccgtgcacagaccgcgtataccgtcatggcaattacgggtatggcgattgacaaccacctgctggctctgcgtgaactggctcgtgccatgtgcaaagaactgccggaaatgttcatggatgaaacgtacctgatgtctaatcgtttcgtcctgtccaccagccaggtgccgaccacgaccgaaatgttttgctgctatggccctgtcgtgccaaacggttatggcgcgtgctacaaccctcagccggaaacgattctgttctgcatcagcagcttccactcttgtaaagaaacgtcctcttctaaatttgctaaagctgtggaagaatccctgatcgatatgcgtgacctgtgctctctgctgccgccaacggaatccaagccgctggcaacgaaagaaaaagctacccgcccgagccagggtcatcagccttaa(seqidno:7)融合蛋白的氨基酸序列：645aaygrkkrrqrrrgggsmaaktpsseesglpklpvpplqqtlatylqcmrhlvseeqfrksqaivqqfgapgglgetlqqkllerqektanwvseywlndmylnnrlalpvnsspavifarqhfpgtddqlrfaaslisgvlsykalldshsiptdcakgqlsgqplcmkqyyglfssyrlpghtqdtlvaqnssimpepehvivaccnqffvldvvinfrrlsegdlftqlrkivkmasnederlppiglltsdgrsewaeartvlvkdstnrdsldmierciclvcldapggvelsdthralqllhgggysknganrwydkslqfvvgrdgtcgvvcehspfdgivlvqctehllkhvtqssrkliradsvselpaprrlrwkcspeiqghlassaeklqrivknldfivykfdnygktfikkqkcspdafiqvalqlafyrlhrrlvptyesasirrfqegrvdnirsatpealafvravtdhkaavpasekllllkdairaqtaytvmaitgmaidnhllalrelaramckelpemfmdetylmsnrfvlstsqvptttemfccygpvvpngygacynpqpetilfcissfhscketssskfakaveeslidmrdlcsllppteskplatkekatrpsqghqp(seqidno:8)具体实施方式下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述。本领域技术人员将会理解，下面的实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件(例如参考j.萨姆布鲁克等著，黄培堂等译的《分子克隆实验指南》，第三版，科学出版社)或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。实施例1：转导肽-chat融合蛋白重组表达载体的构建根据chat核酸序列(seqidno:1)和转导肽核酸序列(seqidno:3)以及linker核酸序列(seqidno:5)进行全基因(seqidno:7)合成，其两端含有ncoi和bamhi酶切位点，并插入到融合蛋白表达载体pet15b载体(novagen公司)中。得到的重组载体命名为pet15b-ptd-chat。基因测序分析正确。(上海申工生物工程公司)。实施例2：转导肽-chat融合蛋白的表达和纯化将实施例1得到的重组表达载体pet15b-ptd-chat转化大肠杆菌菌株ecoli.bl21(de3)，筛选得到重组菌株，命名为e.colibl21(de3)/pet15b-ptd-chat。以用于下面的蛋白表达和纯化。可以冷冻保存。将上述得到的重组菌株或者将冻存的重组菌株复苏活化后在lb固体培养基平板上均匀涂板后，放入37℃恒温培养箱培养过夜。从平板挑取单菌落接种到lb液体培养基(含amp+，100μg/ml)中，在37℃、220r/min条件下培养过夜作为一级种子。一级种子以体积分数5％的接种量接到5种培养基(含amp+)中，继续培养至一定的细胞浓度(od600约为1.0)，加入适量iptg进行诱导表达，诱导温度为20℃低温过夜诱导。取1ml培养液，在4℃10000r/min条件下离心15min，弃去上清液得到的菌体加入2*样品缓冲液，搅拌均匀，沸水煮3－5min，离心。上清液进行sds-15％page，经考马斯亮蓝染色与脱色后用cs-930双波长扫描仪扫描测定融合蛋白的表达量。westernblotting按常规方法进行电泳和转膜，加入羊抗人chat多克隆抗体(chemiconinternationalco.)，以辣根过氧化物酶标记的兔抗羊igg为二抗，dab(二氨基联苯胺)染色。结果显示融合蛋白转导肽-chat,转导肽-chat均与多克隆抗体结合而呈色,其中转导肽-chat分子量约为72kd，蛋白条带实测值与理论值相符。确定培养方案后，连续发酵培养3批chat菌体，批次分别命名为201303，201305，201307。10l发酵罐发酵培养工程菌，诱导表达。按照下面的实验步骤进行蛋白的提取和纯化：1.菌体破碎破菌缓冲液：10mmpbs，ph7.4,0.2mmdtt。重悬后菌体的ph为7.4。经实验验证在样品ph7.4时，dna不被吸附，只有目的蛋白被吸附。可以有效去除dna。重悬比例：1:15。即1g湿重菌体用15ml破菌缓冲液悬浮。重悬时间：3小时破菌方法(1)仪器：高压均质机均质(2)均质机：品牌：ats型号：ah-basicⅰ(3)均值压力：800bar(4)均质遍数：8遍(5)此条件均质效率达95％。破菌后离心(1)仪器：beckman大容量高速冷冻离心机；(2)离心转速：10000转；(3)温度：4度；(4)离心时间：30min；过滤(1)仪器：台式真空压力泵(2)滤膜大小：0.45μm2.sp琼脂糖柱纯化层析柱(1)填料：sp琼脂糖凝胶(2)填料体积：100ml(3)纯化环境：2-8度层析柜纯化，防止内毒素产生(3)流速：5ml/min(4)层析柱使用前处理：0.5m的naoh平衡5个柱体积，去除内毒素。缓冲液(1)起始缓冲液：10mmpbs，ph7.4,0.2mmdtt。0.45μm的膜过滤(2)洗脱柱子上的杂蛋白缓冲液：10mmpbsph7.4，0.37mnacl，0.2mmdtt(3)洗脱目的蛋白缓冲液：10mmpbsph7.4，1mnacl，0.2mmdtt(注：调完ph，再加nacl)0.2μm的膜过滤纯化步骤：1.水洗10个柱体积(即1000ml)、流速5ml/min。2.平衡：startbuffer平衡5个柱体积(即500m)、流速5ml/min。3.上样：上样流速5ml/min，目的蛋白结合在层析柱上。4.洗杂：平衡缓冲液洗掉上样时未结合的蛋白，洗涤5个柱体积，即500ml。5.洗掉结合在柱子上的杂蛋白：用洗脱柱子上的杂蛋白缓冲液以洗掉除目的蛋白以外的杂蛋白。5个柱体积，即500ml。6.洗脱目的蛋白：用洗脱目的蛋白缓冲液洗脱，收集目的蛋白。得到转导肽-chat原液。用于下面的实施例3。蛋白保存方法：冻干。用于下面的实施例4－5。获得菌体量(干重)分别为45g/l，40g/l，43g/l，目标蛋白表达量为总蛋白含量的20％，目标蛋白纯度在90％以上，蛋白产量1.25g/l，酶活为4.1±0.1u/mg，产酶水平在5200u/l。废弃标准以上述数据偏差不超过5％作为标准。3批发酵数据如下面的表2。表2：不同批次转导肽-chat的表达参数其中采用比色法测定chat酶活性。反应体系由下列成分组成：0.5mol/l磷酸钠缓冲液(ph7.0)，6.2×10-3mol/l乙酰辅酶a，1.0mol/l的氯化胆碱，7.6×10-4mol/l的甲基硫酸新斯的明，3mol/l的nacl，1.1×10-3mol/l的edta，0.5mol/l的盐酸肌酸酐和6.5mmol/l的dtt各20μl，最后各组加入蒸馏水至0.4ml。置37℃温浴5min后，各管加入200μl样品，37℃水浴继续温浴20min，空白管则加入等量煮沸过的样品。然后将各反应管放入沸水中2min，并加入2.5mmol/l的砷酸钠0.8ml。室温下离心。取1.0ml上清液加入3nmol/l4-pds20μl，25℃温浴15min后于紫外可见分光光度计读324nm的吸光度a值。各管的吸光度a值均减去空白管的吸光度a值。酶活性以nmol/h/mgpr表示。标准管是以0.11mmol/lcoa代替组织匀浆液。蛋白含量测定采用lowry法。由表2可见，使用本发明的chat的基因序列，转导肽-chat融合蛋白的表达水平获得极大提高，可以达到极其显著的1.25g/l。经柱层析纯化制备转导肽-chat融合蛋白，获得纯度>90％的转导肽-chat(参见附图1－2)。其中蛋白质纯度检测是通过蛋白sds-page电泳后，通过软件分析表达条带净含量与总量的比值。此外，本发明的制备转导肽-chat，纯化过程中不需要进一步酶切处理偶联的gst标签，简化了纯化步骤，提高了产率。实施例3：转导肽-chat制剂处方的优化制备的转导肽-chat原液，分别添加不同浓度的海藻糖、甘露醇、peg4000、吐温80、山梨醇或者其他保护剂(蔗糖，pvp，bsa等)后，制成冻干粉针。置于37度恒温箱内，放置1周后，参照前面实施例2中的方法检测转导肽-chat的活性，计算相对活性，进一步设计配方的组成，确定转导肽-chat的制剂配方，明确最优保存方法。每组3个样品，计算平均值。实验设置和结果如下面的表3和附图3。表3：不同浓度保护剂对转导肽-chat的影响其中，相对活性＝(试验后酶活性/试验前酶活性)×100％。实验结果表明：ptd-chat制剂组方中，吐温80(例如含量15％-25％)有明显的保护效果。但是表面活性剂山梨醇、pvp等对于ptd-chat的酶活性有抑制作用(如附图3)。海藻糖、甘露醇，peg4000、蔗糖和/或bsa对酶活性无明显抑制作用，可以添加到制剂配方中。实施例4：转导肽-chat静脉注射老年鼠衰老模型后检测一、实验方法20月龄上海昆明(km)小鼠，维通利华公司提供。小鼠经避暗实验和morrismaze实验进行筛选，以水迷宫游泳寻的时间为主要指标。筛选出实验动物12只，实验组(chat注射组)8只，为游泳寻的时间显著长于正常小鼠的老年鼠，对照组(生理盐水组)4只，为游泳寻的时间显著小于正常小鼠的老年鼠。实验组尾静脉注射转导肽-chat(4mg/kg)，连续注射三天，每天1次，对照组同时给予生理盐水。分别于注射后0，1，2，3，4，5，7，8，11，14，17，18天检测相关指标。二、实验结果1.认知功能的改善采用morris水迷宫实验和回避实验(step-throughtest)检测转导肽-chat对老年鼠认知功能的影响。morrismaze水迷宫实验：将小鼠面向池壁分别放入非平台象限的另外三个象限，记录其在2min内寻找到平台所用时间，即逃避潜伏期。分别于注射后0，1，2，3，4，5，7，8，11，14，17，18天检测。实验结果参见附图4。避暗实验：将小鼠面部背向洞口放入明室，同时按下测定按钮。小鼠穿过洞口进入暗室受到电击，计时，记录每只小鼠3min内受电击的次数。每天测验一次，连续测验5d，7，8，11天再次检测。实验结果参见附图5。2.衰老指征的改善通过检测小鼠体重，抓力，转棒时间的变化，以评测小鼠的运动能力和抗疲劳能力。2.1老年鼠注射ptd-chat后体重的变化实验时同时检测小鼠体重的变化，以观测药物的影响。实验结果表明，实验组与对照组体重无明显差异(参见附图6)。2.2老年鼠注射ptd-chat后前肢抓力的变化老年鼠注射ptd-chat后，在大小鼠抓力测定仪上检测小鼠的抓力大小，实验结果参见附图7。2.3老年鼠注射ptd-chat后转棒时间的变化小鼠转棒疲劳仪：动物在旋转的棒上为保持身体平衡不致跌下，需要向转动棒的反方向移动，并保持四肢肌肉协调运动，否则将从棒上落下，此法反映动物的被动活动能力和抗疲劳能力。将小鼠分别放在转棒的不同通道上，设置好“日期”、“转速”、“train”(训练模式)；转速设置为16r/min，按下“启/停”按钮，仪器开始计时，并匀加速运动到设置到的转速后作匀速转动，当任意通道的小鼠落棒时，对应的液晶显示器上的通道将停止计时。统计落棒的时间，并比较对照组和给药组的差异。实验结果参见附图8。三、实验结果分析1)chat多次静脉注射老年痴呆鼠后，可以明显改善认知功能，减少老年鼠的游泳寻的时间，和避暗实验中的犯错次数。2)chat多次静脉注射老年痴呆鼠后，可以明显改善老年鼠的衰老指标，提高了抓力，增加了疲劳转棒时间。3)chat多次静脉注射老年痴呆鼠后，水迷宫的游泳寻的时间和避暗实验中的犯错次数在较长期的时间内，仍能维持长时程记忆。实施例5：转导肽-chat直肠给药于老年鼠衰老模型后的检测一、实验方法21月龄上海昆明(km)小鼠，维通利华公司提供。小鼠经避暗实验和morrismaze实验进行筛选，以水迷宫游泳寻的时间为主要指标。筛选出实验动物8只，实验组(chat直肠给药组)4只，为游泳寻的时间显著长于正常小鼠的老年鼠，对照组(生理盐水组)4只，为游泳寻的时间显著小于正常小鼠的老年鼠。实验组直肠微体积灌注转导肽-chat(16mg/kg)，连续给药三天，每天1次，对照组同时给予生理盐水。分别于注射后0，1，2，3，4，5，8，10，12，15，18，22天检测相关指标。二、实验结果1.认知功能的改善采用morris水迷宫实验和回避实验(step-throughtest)检测直肠给予转导肽-chat对老年鼠认知功能的影响。morrismaze水迷宫实验：将小鼠面向池壁分别放入非平台象限的另外三个象限，记录其在2min内寻找到平台所用时间，即逃避潜伏期。分别于给药后0，1，2，3，4，5，8，10，12，15，18，22天检测。实验结果参见附图9。避暗实验：将小鼠面部背向洞口放入明室，同时按下测定按钮。小鼠穿过洞口进入暗室受到电击，计时，记录每只小鼠3min内受电击的次数。每天测验一次，连续测验5d，7，8，11天再次检测。实验结果参见附图10。2.衰老指征的改善通过检测小鼠体重，抓力，转棒时间的变化，以评测小鼠的运动能力和抗疲劳能力。2.1老年鼠直肠给予ptd-chat后体重的变化实验时同时检测小鼠体重的变化，以观测药物的影响。实验结果表明，实验组与对照组体重无明显差异(参见附图11)。2.2老年鼠直肠给予ptd-chat后前肢抓力的变化老年鼠注射ptd-chat后，在大小鼠抓力测定仪上检测小鼠的抓力大小，实验结果参见附图12。2.3老年鼠注射ptd-chat后转棒时间的变化统计落棒的时间，并比较对照组和给药组的差异。实验结果参见附图13。三、实验结果分析1)chat直肠给药于老年痴呆鼠后，可以明显改善认知功能，减少老年鼠的游泳寻的时间，和避暗实验中的犯错次数。但与对照组相比，避暗实验中的犯错次数无显著差别。2)chat直肠给药于老年痴呆鼠后，衰老指标的抓力和疲劳转棒时间，与对照组相比，抓力在给药后有增加，14天后恢复给药前水平。3)直肠给药可能因药物生物利用度低的原因，虽与对照组相比相关指标有改善，但不如静脉给药效果明显。对比例1：蛋白表达量对比实验采用中国专利公开cn1648135a(申请号200410002513.2)公开的转导肽-chat融合蛋白的核酸序列(其序列2)，按照本发明实施例2相同的方法进行融合蛋白的表达(实验室摇瓶生产)。结果如下面的表4所示。表4：蛋白表达量对比实验结果转导肽-chat的表达量为总蛋白含量的10％，蛋白产量约60mg/l。本发明实现了转导肽-chat的高表达，简化了制备操作过程，提高了产率。另外，本发明chat蛋白的表达体系由原来的融合表达(融合蛋白标签gst)改为非融合表达，避免了后续制备过程中的gst标签的去除。尽管本发明的具体实施方式已经得到详细的描述，本领域技术人员将会理解。根据已经公开的所有教导，可以对那些细节进行各种修改和替换，这些改变均在本发明的保护范围之内。本发明的全部范围由所附权利要求及其任何等同物给出。当前第1页12