本发明属于遗传工程的技术领域，具体涉及一种诱导合成鸟苷二磷酸岩藻糖的重组枯草芽孢杆菌及其构建方法与应用。
背景技术：
母乳中含有重要营养成分，生物活性物质，刺激肠道菌群生长的因子。其中，母乳寡糖(humanmilkoligosacchrides,hmos)在许多生理功能上起到了关键的作用，例如促进双歧杆菌生长，病原体感染的抑制作用，和提高免疫反应。母乳寡糖中的藻糖基化的寡糖(foss)由于其生理功能如其作为肠道致病菌的受体类似物的能力、促进免疫调节的能力和减少炎症的能力，已经获得了极大的关注。因为藻糖基化的寡糖是由岩藻糖基转移酶催化进行糖类岩藻糖基化而成，这就需要鸟苷二磷酸岩藻糖(gdp-l-fucose)作为岩藻糖基的供体。随着岩藻糖基化的寡糖的热度越来越高，许多制药公司试图通过化学方法和生物方法合成充足的gdp-l-fucose。在化学合成中，gdp-l-fucose以l-岩藻吡喃糖基四乙酸为起始原料，由hbr、ag2co3、n-四丁铵磷酸二甲苯酯等物质引发的化学反应。gdp-l-fucose是可拉酸的前体，可拉酸是革兰氏阴性菌细胞壁的主要成分，因此，一些肠道细菌如大肠杆菌和沙门氏菌能在体内合成gdp-l-岩藻糖。在生物中发现了两种合成gdp-l-fucose的代谢途径：补救途径和从头途径。
补救途径是在人类的代谢途径中发现的，外源的岩藻糖转移到胞内，由岩藻糖激酶消耗atp磷酸化(ec2.7.1.52)形成岩藻糖-1-磷酸(fuc-1-p)。fuc-1-p结合鸟苷三磷酸(gtp)在岩藻糖-1-磷酸鸟苷酰基转移酶(l-fucose-1-phosphateguanylyltransferase)(ec2.7.7.30)的催化下生成gdp-l-岩藻糖。从头合成途径普遍存在于原核生物和真核生物中，其中gdp-l-fucose是由gdp-甘露糖通过甘露糖脱氢酶(gmd，ec4.2.1.47)和gdp-岩藻糖合成酶(wcag，ec1.1.1.271)催化合成的。其中有代表性的反应方案如下所示：
枯草芽孢杆菌(bacillussubtilis)是一种被广泛用作食品酶制剂及重要营养化学品的生产宿主，其产品被fda认证为“generallyregardedassafe”(gras)安全级别。
因此，如何利用枯草芽孢杆菌，通过生物方法高效合成鸟苷二磷酸岩藻糖，仍是本领域亟待解决的问题。
技术实现要素：
为了解决上述技术问题，本发明的目的在于提供一种诱导合成鸟苷二磷酸岩藻糖的重组枯草芽孢杆菌及其构建方法与应用，构建的重组枯草芽孢杆菌可以高效合成鸟苷二磷酸岩藻糖。
具体的，一方面，本发明提供了一种诱导合成鸟苷二磷酸岩藻糖的重组枯草芽孢杆菌，所述重组芽孢杆菌是通过诱导表达枯草芽孢杆菌168的糖转运蛋白基因，并表达外源岩藻糖激酶和磷酸鸟嘌呤基转移酶基因得到的。
枯草芽孢杆菌168的糖转运蛋白基因是不表达的，通过诱导表达枯草芽孢杆菌168的糖转运蛋白基因，并表达外源岩藻糖激酶和磷酸鸟嘌呤基转移酶基因，提高了外源岩藻糖转移至胞内的效率，增加了胞内岩藻糖的浓度，促进了鸟苷二磷酸岩藻糖的合成。
其中，将枯草芽孢杆菌168的糖转运蛋白基因的启动子替换为诱导型启动子pgrac，来诱导表达枯草芽孢杆菌168的糖转运蛋白基因。诱导型启动子pgrac强化了丙酮酸到草酰乙酸的反应，增加流向草酰乙酸的碳通量，增强了细胞膜对岩藻糖的运输，提高了胞内岩藻糖浓度，促进了鸟苷二磷酸岩藻糖的积累。
所述糖转运蛋白基因如ncbi中geneid:936346所示。
优选的，所述岩藻糖激酶和磷酸鸟嘌呤基转移酶基因为脆弱拟杆菌9343的fkp基因。所述脆弱拟杆菌9343的fkp基因如ncbi上genbank:ay849806.1所示。
第二方面，本发明还提供了一种所述的诱导合成鸟苷二磷酸岩藻糖的重组枯草芽孢杆菌的构建方法，该构建方法包括以下步骤：
(1)构建包含糖转运蛋白基因的上下游序列、pgrac启动子和博来霉素抗性基因序列的替换框，将构建好的替换框转化重组枯草芽孢杆菌168，通过验证，确认糖转运蛋白基因诱导表达成功，得到重组枯草芽孢杆菌big；
(2)构建包含岩藻糖激酶和磷酸鸟嘌呤基转移酶基因的重组质粒，将构建好的重组质粒转化枯草芽孢杆菌big，通过验证，确认岩藻糖激酶和磷酸鸟嘌呤基转移酶表达成功，得到重组枯草芽孢杆菌bigf。
优选的，步骤(1)中，替换框的序列如seqidno.1所示。
步骤(2)中，重组质粒的序列如seqidno.2所示。
第三方面，本发明还提供了一种所述重组枯草芽孢杆菌的应用，使用所述重组枯草芽孢杆菌发酵生成鸟苷二磷酸岩藻糖。
优选的，所述发酵是将重组芽孢杆菌种子液以od值为0.1-0.3的接种量接入发酵培养基中，同时加入0.2mmiptg，在35-40℃、200-250rpm条件下培养20-25h。
本发明的有益效果为：
本发明的重组枯草芽孢杆菌，是在枯草芽孢杆菌168的基础上诱导表达了糖转运蛋白基因，并在此基础上表达岩藻糖激酶和磷酸鸟嘌呤基转移酶基因得到的。本发明通过强化了丙酮酸到草酰乙酸的反应，增加流向草酰乙酸的碳通量，增强了细胞膜对岩藻糖的运输，提高了胞内岩藻糖浓度，促进了鸟苷二磷酸岩藻糖的积累，增加了胞内岩藻糖的浓度，促进了鸟苷二磷酸岩藻糖的合成。本发明重组枯草芽孢杆菌的构建方法简单，便于使用，具有很好的应用前景。
附图说明
图1为本发明实施例3得到的鸟苷二磷酸岩藻糖的气质联用色谱图。
具体实施方式
下面结合实施例和附图对本发明进行详细的解释说明。
实施例1
诱导表达糖转运蛋白基因glcp
根据ncbi上公布的枯草芽孢杆菌(bacillussubtilis168购自美国典型微生物保藏中心，atccno.27370)的糖转运蛋白基因glcp的上下游序列、pgrac启动子以及博来霉素抗性基因的序列，构建序列如seqidno.1所示的替换框。
将构建好的替换框电转化枯草芽孢杆菌168的感受态细胞，替换框添加量为100-300ng，电转化条件：电压2.5kv，电击试剂5ms，37℃复苏5h涂布终浓度为10μg/ml博来霉素抗性的lb平板，37℃厌氧培养48h，挑选单克隆若干。
将构建好的替换框转化重组枯草芽孢杆菌168，由于替换框中存在糖转运蛋白基因glcp的上下游序列，与枯草芽孢杆菌168的转运蛋白基因同源，通过同源重组，替换框中的博来霉素抗性基因zeo和pgrac启动子游替换枯草芽孢杆菌168糖转运蛋白基因glcp的启动子。
通过博来霉素抗性平板筛选，菌落pcr验证，测序后确认糖转运蛋白基因(glcp)是否强化表达成功，博来霉素抗性呈阳性的为替换框转化成功的枯草芽孢杆菌，菌落pcr验证有特殊条带的，且测序结果与理论结果一致的为替换框转化重组成功的枯草芽孢杆菌，即糖转运蛋白基因(glcp)诱导表达成功的枯草芽孢杆菌。
确认糖转运蛋白基因(glcp)强化表达成功后，得到重组枯草芽孢杆菌big。
实施例2
外源表达脆弱拟杆菌外源基因
根据ncbi上公布的脆弱拟杆菌(bacteroidesfragilis，atccno.25285)的岩藻糖激酶和磷酸鸟嘌呤基转移酶基因fkp的序列，通过基因fkp和质粒pp43nmk的限制性酶切位点的酶切及连接，构建序列如seqidno.2所示的重组质粒pp43-fkp。
将构建好的重组质粒电转化重组枯草芽孢杆菌big的感受态细胞，重组质粒的添加量为50-300ng，电转化条件：电压2.5kv，电击试剂5ms，37℃复苏5h涂布终浓度为10μg/ml卡那霉素抗性的lb平板，37℃厌氧培养48h，挑选单克隆若干。
通过卡那霉素抗性平板筛选，菌落pcr验证，测序后确认藻糖激酶和磷酸鸟嘌呤基转移酶基因是否表达成功，卡那霉素抗性呈阳性的为转化成功的枯草芽孢杆菌，菌落pcr验证有特殊条带的，且测序结果与理论结果一致的为转化重组成功的枯草芽孢杆菌，即岩藻糖激酶和磷酸鸟嘌呤基转移酶表达成功。
确认脆弱拟杆菌的岩藻糖激酶和磷酸鸟嘌呤基转移酶表达成功，得到重组枯草芽孢杆菌bigf。
实施例3
发酵生产鸟苷二磷酸岩藻糖
将上述重组枯草芽孢杆菌bigf制成种子液，种子液培养基的配方为：胰蛋白胨10g/l、酵母粉5g/l、nacl10g/l；种子液制作方法为：挑取新鲜平板上的单菌落在种子培养基中，培养8-10h。
以od值为0.1的接种量将种子液接入到发酵培养基中，发酵培养基的配方为：初始甘油20g/l、蛋白胨6g/l、酵母粉12g/l、(nh4)so46g/l,k2hpo4·3h2o12.5g/l、kh2po42.5g/l、caco35g/l、微量元素10ml/l；微量元素溶液按g/l计含有：mnso4·5h2o1.0、cocl2·6h2o0.4、namoo4·2h2o0.2、znso4·7h2o0.2、alcl3·6h2o0.1、cucl2·h2o0.1、h3bo40.05，5mhcl，同时加入诱导剂0.2mmiptg，于35℃、200rpm条件下培养20h。
发酵结束时，使用气质联用色谱仪测定发酵上清液中的鸟苷二磷酸岩藻糖的含量，鸟苷二磷酸岩藻糖的气质联用色谱图如图1所示，测定的鸟苷二磷酸岩藻糖的含量达到62mg/l。
实施例4
发酵生产鸟苷二磷酸岩藻糖
将上述重组枯草芽孢杆菌bigf制成种子液，种子液培养基的配方为：胰蛋白胨10g/l、酵母粉5g/l、nacl10g/l；种子液的制作方法为：挑取新鲜平板上的单菌落在种子培养基中，培养8-10h。
以od值为0.3的接种量将种子液接入到发酵培养基中，发酵培养基的配方为：初始甘油20g/l、蛋白胨6g/l、酵母粉12g/l、(nh4)so46g/l,k2hpo4·3h2o12.5g/l、kh2po42.5g/l、caco35g/l、微量元素10ml/l；微量元素溶液按g/l计含有：mnso4·5h2o1.0、cocl2·6h2o0.4、namoo4·2h2o0.2、znso4·7h2o0.2、alcl3·6h2o0.1、cucl2·h2o0.1、h3bo40.05、5mhcl，同时加入诱导剂0.2mmiptg，于40℃、250rpm条件下培养25h。
发酵结束时，发酵上清液中鸟苷二磷酸岩藻糖含量达到60mg/l。
对比例1
根据ncbi上公布的枯草芽孢杆菌(bacillussubtilis168购自美国典型微生物保藏中心，atccno.27370)的糖转运蛋白基因glcp的上下游序列、pgrac启动子以及博来霉素抗性基因的序列，构建序列如seqidno.1所示的替换框。
将构建好的替换框转化重组枯草芽孢杆菌168，由于替换框中存在糖转运蛋白基因glcp的上下游序列，与枯草芽孢杆菌168的转运蛋白基因同源，通过同源重组，替换框中的pgrac启动子替换枯草芽孢杆菌168糖转运蛋白基因glcp的启动子。
通过博来霉素抗性平板筛选，菌落pcr验证，测序后确认糖转运蛋白基因(glcp)是否强化表达成功，博来霉素抗性呈阳性的为替换框转化成功的枯草芽孢杆菌，菌落pcr验证有特殊条带的，且测序结果与理论结果一致的为替换框转化重组成功的枯草芽孢杆菌，即糖转运蛋白基因(glcp)强化表达成功的枯草芽孢杆菌。
确认糖转运蛋白基因(glcp)强化表达成功后，得到重组枯草芽孢杆菌big。
用重组枯草芽孢杆菌big发酵生产鸟苷二磷酸岩藻糖，发酵结束时，离心收集获得细胞，超声破碎获得胞内可溶性混合液，其中未检测到鸟苷二磷酸岩藻糖。
对比例2
根据ncbi上公布的脆弱拟杆菌(bacteroidesfragilis，atccno.25285)的岩藻糖激酶和磷酸鸟嘌呤基转移酶基因fkp的序列，构建序列如seqidno.2所示的重组质粒。
将构建好的重组质粒转化枯草芽孢杆菌168。
通过卡那霉素抗性平板筛选、菌落pcr验证，测序后确认藻糖激酶和磷酸鸟嘌呤基转移酶基因是否表达成功，卡那霉素抗性呈阳性的为转化成功的枯草芽孢杆菌，菌落pcr验证有特殊条带的，且测序结果与理论结果一致的为替换框重组成功的枯草芽孢杆菌，即岩藻糖激酶和磷酸鸟嘌呤基转移酶表达成功。
确认脆弱拟杆菌的岩藻糖激酶和磷酸鸟嘌呤基转移酶表达成功，得到重组枯草芽孢杆菌bif。
用重组枯草芽孢杆菌bif发酵生产鸟苷二磷酸岩藻糖，发酵结束时，离心收集获得细胞，超声破碎获得胞内可溶性混合液，其中未检测到鸟苷二磷酸岩藻糖。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明实质内容上所作的任何修改、等同替换和简单改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
序列表
<110>光明乳业股份有限公司
<120>一种诱导合成鸟苷二磷酸岩藻糖的重组枯草芽孢杆菌及其构建方法与应用
<160>2
<170>siposequencelisting1.0
<210>1
<211>3022
<212>dna
<213>人工序列(未知)
<400>1
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