本发明属于微生物培养基质
技术领域：
，具体涉及一种芽孢杆菌发酵培养基、发酵方法及应用。
背景技术：
：化学农药大量使用导致食品的农药残留和已经由此造成的环境污染问题，严重威胁人类健康。另外，大量化学农药的使用，容易使植物病原菌、虫产生抗药性，从而降低了防治效果。生物农药因无公害、环境友好、不产生抗性等特点，被认为是化学农药较理想的替代品。芽孢杆菌是植物叶表和根际有益微生物，同时还是植物体内常见的内生细菌。芽孢杆菌通过拮抗作用、竞争作用、诱导抗性等机制达到植物病虫害防治、促进植物生长的作用。现有技术存在的问题是，当前芽孢杆菌菌剂的使用普遍采用发酵后回收芽孢，制备成各种剂型使用，一方面丢弃了发酵液中产生的对病虫害有效的生物活性物质，而且芽孢的萌发需要一定时间，与现场发酵的微生物菌剂相比，使用效果大大降低；且在加工、储藏及使用过程中有效活菌数也有所降低。技术实现要素：为了解决上述技术问题，本发明提供的一种芽孢杆菌发酵培养基、发酵方法，保留芽孢杆菌发酵液，减少了现有芽孢杆菌生产过程中有效活菌数降低的问题。本发明的第一个目的是提供一种芽孢杆菌发酵培养基，由以下质量百分比的组分制成：氮源8-15％、蔗糖8-15％、添加剂0.1-0.5％、消泡剂0.1-0.2％，余量为水；所述氮源为有机氮源与无机氮源的混合物；所述添加剂为酵母提取物、玉米浆干粉、蛋白胨、赖氨酸、吲哚乙酸中的一种或者几种；所述消泡剂为吐温80或者硅类消泡剂。优选的，上述芽孢杆菌发酵培养基中，所述有机氮源为豆粕粉、黄豆粉、豆浆中的一种或几种；所述无机氮源为硝酸铵或者硫酸铵；并且氮源中有机氮源与无机氮源的质量比例为500-1000:1。优选的，上述芽孢杆菌发酵培养基中，所述硅类消泡剂是聚二甲氧基硅烷消泡剂或者聚醚改性硅消泡剂。本发明的第二个目的是提供一种利用上述的芽孢杆菌发酵培养基进行发酵的方法，包括以下步骤：步骤1，按以下质量百分比称取各组分：氮源8-15％、蔗糖8-15％、添加剂0.1-0.5％、消泡剂0.1-0.2％，余量为水；所述氮源为有机氮源与无机氮源的混合物；所述添加剂为酵母提取物、玉米浆干粉、蛋白胨、赖氨酸、吲哚乙酸中的一种或者几种；所述消泡剂为吐温80或者硅类消泡剂；步骤2，混料：将步骤1中称取的氮源、蔗糖、添加剂、水放入发酵设备中，混匀，灭菌，然后加入称取的消泡剂，得到培养液，加热培养液至35℃后，保温20min，然后降温至30℃备用；步骤3，接种：将芽孢杆菌种子加入到步骤2冷却到30℃的培养液中，得到发酵液，芽孢杆菌种子与步骤1中称取的水的体积比例为0.08-0.1:100；步骤4，发酵：对步骤3中的发酵液进行通空气培养，通气量为0.4-1.5vvm，发酵温度为30-37℃，转速为50r/min，培养时间为7-10d，发酵结束后得到的发酵液直接应用或者4℃保藏备用。本发明的第三个目的是提供一种上述的芽孢杆菌发酵培养基在培养多粘类芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌或者地衣芽孢杆菌中的应用。与现有技术相比，本发明的芽孢杆菌发酵培养基、发酵方法及应用，具有以下有益效果：(1)本发明采用特殊的培养基材料、配比，无需预先对培养用的芽孢杆菌种子进行活化及对种子较为严格的无菌保存，对液体培养基、种子处理方式可杀灭培养系统中的非芽孢杂菌，同时提高了芽孢萌发率及芽孢活力。(2)培养条件简单：对培养设备要求不高，只需具有加热功能的简易移动发酵设备和通气装置，或可调节温度的房间，并达到相应的温度要求，便可实现繁殖培养，方便现场使用。在非无菌密闭条件下，可实现现场规模化扩大培养，既提高了使用效果，也降低了生产成本。在农业微生物菌剂、微生物农药、环保微生物菌剂的现场培养方面具广阔的应用前景。(3)发酵液中有效菌落数高，制备的发酵液直接使用，为芽孢杆菌营养体和芽孢的混合状态，发酵液中产生的活性物质和微生物菌体同时使用，使用效果得到显著提升，避免了发酵液二次加工造成的微生物流失，降低了成本，可以有效防治棉花黄萎病、水稻稻瘟病、豇豆立枯病、西瓜枯萎病、小麦叶锈病和小麦白粉病。(4)首次发现吲哚乙酸对芽孢杆菌的生长具有促进作用。具体实施方式下面结合具体实例对本发明进行详细说明，但不应理解为本发明的限制。下面实例中未注明具体条件的实验方法，均按照本领域的常规方法和条件进行。本发明提供了一种芽孢杆菌发酵培养基，由以下质量百分比的组分制成：氮源8-15％、蔗糖8-15％、添加剂0.1-0.5％、消泡剂0.1-0.2％，余量为水；所述氮源为有机氮源与无机氮源的混合物；所述添加剂为酵母提取物、玉米浆干粉(饲料级)、蛋白胨、赖氨酸、吲哚乙酸中的一种或者几种；所述消泡剂为吐温80或者硅类消泡剂。一种利用上述芽孢杆菌发酵培养基的进行发酵的方法，包括以下步骤：步骤1，按以下质量百分比称取各组分：氮源8-15％、蔗糖8-15％、添加剂0.1-0.5％、消泡剂0.1-0.2％，余量为水；所述氮源为有机氮源与无机氮源的混合物；所述添加剂为酵母提取物、玉米浆干粉、蛋白胨、赖氨酸、吲哚乙酸中的一种或者几种；所述消泡剂为吐温80或者硅类消泡剂；步骤2，混料：将步骤1中称取的氮源、蔗糖、添加剂、水放入发酵设备中，混匀，灭菌，然后加入称取的消泡剂，得到培养液，加热培养液至35℃后，保温20min，然后降温至30℃备用；所述发酵设备的结构包括储液罐和设于储液罐底部的加热器；发酵设备也可以采用现有市售的微生物发酵罐。步骤3，接种：将芽孢杆菌种子加入到步骤2冷却到30℃的培养液中，得到发酵液，芽孢杆菌种子与步骤1中称取的水的体积比例为0.08-0.1:100；步骤4，发酵：对步骤3中的发酵液进行通空气培养，通气量为0.4-1.5vvm，发酵温度为30-37℃，转速为50r/min，培养时间为7-10d，发酵结束后得到的发酵液直接应用或者4℃保藏备用。发酵结束后的发酵液用自来水稀释500倍后，按每亩50kg稀释液的量喷雾至棉花、水稻、豇豆、西瓜、小麦田中，在植物生长期每隔10d使用一次，可以防治棉花黄萎病、水稻稻瘟病、豇豆立枯病、西瓜枯萎病、小麦叶锈病和小麦白粉病。具体包括以下实施例。实施例1一种芽孢杆菌(多粘类芽孢杆菌)发酵培养基，由以下质量百分比的组分制成：氮源8％、蔗糖15％、添加剂0.1％、消泡剂0.1％，余量为水；所述氮源为有机氮源与无机氮源的混合物；所述有机氮源为过了60目筛的豆粕粉；所述无机氮源为硝酸铵；并且氮源中有机氮源与无机氮源的质量比例为1000:1；所述添加剂为吲哚乙酸；所述消泡剂为市售的二甲氧基硅烷消泡剂。利用芽孢杆菌发酵培养基进行发酵的方法，包括以下步骤：步骤1，按以下质量百分比称取各组分：氮源8％、蔗糖15％、添加剂0.1％、消泡剂0.1％，余量为水；步骤2，混料：将步骤1中称取的氮源、蔗糖、添加剂、水放入发酵设备中，混匀，121℃灭菌20min，然后加入称取的消泡剂，得到培养液，加热培养液至35℃后，保温20min，然后降温至30℃备用；所述发酵设备的结构包括储液罐和设于储液罐底部的加热器；步骤3，接种：将芽孢杆菌种子加入到步骤2冷却到30℃的培养液中，得到发酵液，芽孢杆菌种子与步骤1中称取的水的体积比例为0.08:100；芽孢杆菌种子无需重新进行活化，直接采用市售的多粘类芽孢杆菌固态菌剂(康蕾，10亿cfu/克)，步骤4，发酵：对步骤3中的发酵液进行通空气培养，通气量为0.4vvm，发酵温度为30-33℃，转速为50r/min，培养时间为7d，发酵结束后得到的发酵液直接应用。实施例1的发酵结束后的发酵液用自来水稀释500倍后，按每亩50kg稀释液的量喷雾至棉花田(新疆建设生产兵团农五师棉花田苗期。花蕾期)、水稻田、豇豆田、西瓜田、小麦田(周口师范学院冬小麦试验田)中，在植物生长期每隔7d使用一次，可以防治棉花黄萎病、水稻稻瘟病、豇豆立枯病、西瓜枯萎病、小麦叶锈病和小麦白粉病，防治有效率在95％以上。实施例2一种芽孢杆菌(枯草芽孢杆菌)发酵培养基，由以下质量百分比的组分制成：氮源15％、蔗糖8％、添加剂0.5％、消泡剂0.2％，余量为水；所述氮源为有机氮源与无机氮源的混合物；所述有机氮源为过了60目筛的黄豆粉；所述无机氮源为硫酸铵；并且氮源中有机氮源与无机氮源的质量比例为500:1；所述添加剂为吲哚乙酸与蛋白胨按照1:10质量比混合后的混合物；所述消泡剂为市售的thix-299聚醚改性硅消泡剂。利用芽孢杆菌发酵培养基进行发酵的方法，包括以下步骤：步骤1，按以下质量百分比称取各组分：氮源15％、蔗糖8％、添加剂0.5％、消泡剂0.2％，余量为水；步骤2，混料：将步骤1中称取的氮源、蔗糖、添加剂、水放入发酵设备中，混匀，121℃灭菌20min，然后加入称取的消泡剂，得到培养液，加热培养液至35℃后，保温20min，然后降温至30℃备用；所述发酵设备的结构包括储液罐和设于储液罐底部的加热器；步骤3，接种：将芽孢杆菌种子加入到步骤2冷却到30℃的培养液中，得到发酵液，芽孢杆菌种子与步骤1中称取的水的体积比例为0.09:100；芽孢杆菌种子无需重新进行活化，直接采用市售的枯草芽孢杆菌固态菌剂(鹤壁市人元生物科技发展有限公司，200亿cfu/克)，步骤4，发酵：对步骤3中的发酵液进行通空气培养，通气量为1.0vvm，发酵温度为35-37℃，转速为50r/min，培养时间为8d，发酵结束后得到的发酵液直接应用。实施例2的发酵结束后的发酵液用自来水稀释500倍后，按每亩50kg稀释液的量喷雾至棉花、水稻、豇豆、西瓜、小麦田中，在植物生长期每隔10d使用一次，可以防治棉花黄萎病、水稻稻瘟病、豇豆立枯病、西瓜枯萎病、小麦叶锈病和小麦白粉病，防治有效率在97％以上。实施例3一种芽孢杆菌(地衣芽孢杆菌)发酵培养基，由以下质量百分比的组分制成：氮源12％、蔗糖10％、添加剂0.3％、消泡剂0.15％，余量为水；所述氮源为有机氮源与无机氮源的混合物；所述有机氮源为豆浆(豆浆是将黄豆与水按照1:10的质量比例混合后，经豆浆机粉碎煮沸20min而成)；所述无机氮源为硫酸铵；并且氮源中有机氮源与无机氮源的质量比例为750:1；所述添加剂为酵母提取物、玉米浆干粉、蛋白胨、赖氨酸、吲哚乙酸按照3:3:3:1:1质量比混合后的混合物；所述消泡剂为市售的thix-299聚醚改性硅消泡剂。利用芽孢杆菌发酵培养基进行发酵的方法，包括以下步骤：步骤1，按以下质量百分比称取各组分：氮源12％、蔗糖10％、添加剂0.3％、消泡剂0.15％；步骤2，混料：将步骤1中称取的氮源、蔗糖、添加剂、水放入发酵设备中，混匀，煮沸灭菌20min，然后加入称取的消泡剂，得到培养液，加热培养液至35℃后，保温20min，然后降温至30℃备用；所述发酵设备的结构包括储液罐和设于储液罐底部的加热器；步骤3，接种：将芽孢杆菌种子加入到步骤2冷却到30℃的培养液中，得到发酵液，芽孢杆菌种子与步骤1中称取的水的体积比例为0.1:100；芽孢杆菌种子无需重新进行活化，直接采用市售的枯草芽孢杆菌固态菌剂(沧州莱森生物技术有限公司，200亿cfu/克)，步骤4，发酵：对步骤3中的发酵液进行通空气培养，通气量为1.5vvm，发酵温度为34-36℃，转速为50r/min，培养时间为10d，发酵结束后得到的发酵液直接应用。实施例3的发酵结束后的发酵液用自来水稀释800倍后，按每亩50kg稀释液的量喷雾至棉花、水稻、豇豆、西瓜、小麦田中，在植物生长期每隔15d使用一次，可以防治棉花黄萎病、水稻稻瘟病、豇豆立枯病、西瓜枯萎病、小麦叶锈病和小麦白粉病，防治有效率在93％以上。实施例4一种芽孢杆菌(枯草芽孢杆菌)发酵培养基，由以下质量百分比的组分制成：氮源12％、蔗糖10％、添加剂0.3％、消泡剂0.15％，余量为水；所述氮源为有机氮源与无机氮源的混合物；所述有机氮源为豆粕粉和黄豆粉按照1:1质量比例混合后的混合物，过60目筛；所述无机氮源为硫酸铵；并且氮源中有机氮源与无机氮源的质量比例为1000:1；所述添加剂为玉米浆干粉；所述消泡剂为市售的吐温80。培养基的发酵方法同实施例1。实施例5一种芽孢杆菌(地衣芽孢杆菌)发酵培养基，由以下质量百分比的组分制成：氮源13％、蔗糖10％、添加剂0.4％、消泡剂0.2％，余量为水；所述氮源为有机氮源与无机氮源的混合物；所述有机氮源为豆粕粉和黄豆粉按照1:1.5质量比例混合后的混合物，过60目筛；所述无机氮源为硫酸铵；并且氮源中有机氮源与无机氮源的质量比例为900:1；所述添加剂为蛋白胨和赖氨酸按1:1质量比混合后的混合物；所述消泡剂为市售的吐温80。培养基的发酵方法同实施例2。实施例6一种芽孢杆菌(多粘类芽孢杆菌)发酵培养基，由以下质量百分比的组分制成：氮源9％、蔗糖8％、添加剂0.5％、消泡剂0.15％，余量为水；所述氮源为有机氮源与无机氮源的混合物；所述有机氮源为豆粕粉和黄豆粉按照1:1质量比例混合后的混合物，过60目筛；所述无机氮源为硝酸铵；并且氮源中有机氮源与无机氮源的质量比例为1000:1；所述添加剂为玉米浆干粉质量比混合后的混合物；所述消泡剂为市售的聚二甲氧基硅烷消泡剂。培养基的发酵方法同实施例3。分别将实施例4-6的发酵结束后的发酵液用自来水稀释800倍后，按每亩50kg稀释液的量喷雾至棉花、水稻、豇豆、西瓜、小麦田中，在植物生长期每隔10d使用一次，可以防治棉花黄萎病、水稻稻瘟病、豇豆立枯病、西瓜枯萎病、小麦叶锈病和小麦白粉病，防治有效率在89％以上。需要说明的是，上述实施例中，通空气培养使用的设备是空压机，可根据实际发酵量选择不同型号的空压机，比如青岛晶科机电设备有限公司的红星活塞式空压机，功率7.5kw；浙江红五环机械股份有限公司的红五环小型固定螺杆空压机，功率7.5-37kw。本发明采用特殊的培养基材料、配比，无需预先对培养用的芽孢杆菌种子进行活化及对种子较为严格的无菌保存。为了验证本发明的效果，我们进行的如下实验：对比例1与实施例1菌种培养基配方及发酵方法均相同，区别仅在于以水替代添加剂的用量。对比例2与实施例2菌种培养基配方及发酵方法均相同，区别仅在于以水替代添加剂的用量。对比例3与实施例2菌种培养基配方及发酵方法均相同，区别仅在于仅使用蛋白胨作为添加剂。对比例4与实施例3菌种培养基配方及发酵方法均相同，区别仅在于仅使用赖氨酸和吲哚乙酸作为添加剂，且赖氨酸和吲哚乙酸的质量比为1:1。对比例5与实施例3菌种培养基配方及发酵方法均相同，区别仅在于仅使用赖氨酸作为添加剂。对比例6与实施例2菌种培养基配方及发酵方法均相同，区别仅在于将购买的枯草芽孢杆菌固态菌剂经牛肉膏蛋白胨培养基活化后再加入到培养液中。分别记录实施例1-3以及对比例1-6制备的发酵液中的芽孢杆菌生物量，结果如表1所示。由表1结果可知，对比例1、对比例2的生物量最低，其他组均较高，说明发酵培养基中添加剂的使用有助于增加芽孢杆菌的生长，而普通培养基中不含添加剂，故生物量较低；实施例1-3、对比例4的中使用的添加剂都含有吲哚乙酸，故生物量较高，比使用蛋白胨等作为添加剂的培养基效果好，说明吲哚乙酸对于促进芽孢杆菌的生长具有重要作用；通过比较对比例2和对比例6的数据，我们发现虽然不使用添加剂，但是市售的芽孢杆菌菌剂经活化后生物量有所增加，说明活化步骤有助于芽孢杆菌的深度繁殖，但是对比例6的效果不如实施例1-3，说明本发明实施例的培养基培养和发酵方法具备显著增加芽孢杆菌生物量的效果。表1不同方法制备的发酵液中芽孢杆菌生物量方法实施例1实施例2实施例3对比例1对比例2生物量(109cfu/ml)2520210.040.05方法对比例3对比例4对比例5对比例6生物量(109cfu/ml)81673需要说明的是，本发明权利要求书中涉及数值范围时，应理解为每个数值范围的两个端点以及两个端点之间任何一个数值均可选用，由于采用的步骤方法与实施例相同，为了防止赘述，本发明的描述了优选的实施例，尽管已描述了本发明的优选实施例，但本领域内的技术人员一旦得知了基本创造性概念，则可对这些实施例作出另外的变更和修改。所以，所附权利要求意欲解释为包括优选实施例以及落入本发明范围的所有变更和修改。显然，本领域的技术人员可以对本发明进行各种改动和变型而不脱离本发明的精神和范围。这样，倘若本发明的这些修改和变型属于本发明权利要求及其等同技术的范围之内，则本发明也意图包含这些改动和变型在内。当前第1页12