一种乙酰氨基葡萄糖产量提高的重组枯草芽孢杆菌的制作方法

本发明涉及一种乙酰氨基葡萄糖产量提高的重组枯草芽孢杆菌的，属于遗传工程领域。

背景技术：

乙酰氨基葡萄糖是生物体内的一种单糖，广泛存在于细菌、酵母、霉菌、植物以及动物体内。在人体中，乙酰氨基葡萄糖是糖胺聚糖二糖单元的合成前体，其对修复和维持软骨及关节组织功能具有重要作用。因此，乙酰氨基葡萄糖被广泛作为药物和营养膳食添加来治疗和修复关节损伤。此外，乙酰氨基葡萄糖在化妆品领域也具有诸多应用。目前，乙酰氨基葡萄糖主要采用酸解虾壳或蟹壳中甲壳素生产，此方法产生的废液对环境污染较为严重，而且得到的产品易引起过敏反应，不适宜海鲜过敏的人群服用。

枯草芽孢杆菌(bacillussubtilis)是一种被广泛用作食品酶制剂及重要营养化学品的生产宿主，其产品被fda认证为“generallyregardedassafe”(gras)安全级别。因此，运用代谢工程手段构建重组枯草芽孢杆菌是生产食品安全级乙酰氨基葡萄糖的有效途径。然而，专利申请201510761678.6中构建的重组枯草芽孢杆菌(bsgnkap-pxyla-glms-p43-gna1)存在产量不高、产物转化率较低的缺点。因此，提高乙酰氨基葡萄糖合成途径代谢通量，是提高乙酰氨基葡萄糖产量的亟待解决问题。因此，提高乙酰氨基葡萄糖合成途径代谢通量，是提高乙酰氨基葡萄糖产量亟待解决的问题。目前枯草芽孢杆菌中催化乙酰氨基葡萄糖合成途径的最后一步反应，即6-磷酸乙酰氨基葡萄糖转化为乙酰氨基葡萄糖的酶尚不清楚。据报道在酿酒酵母中表达来自于大肠杆菌的had-like家族的三个磷酸酶后对乙酰氨基葡萄糖的合成都有明显的促进作用；而以大肠杆菌作为宿主菌时只需强化6-磷酸氨基葡萄糖合酶glms与6-磷酸氨基葡萄糖乙酰化酶基因gna1便可达到很高的乙酰氨基葡萄糖产量，很可能是因为其周质空间中存在丰富的磷酸酶可以催化6-磷酸乙酰氨基葡萄糖转化为乙酰氨基葡萄糖。而枯草芽孢杆菌为革兰氏阳性菌，其不存在大肠杆菌那样的周质空间结构，因此推测在重组枯草芽孢杆菌bsgnkap-pxyla-glms-p43-gna1中6-磷酸乙酰氨基葡萄糖转化为乙酰氨基葡萄糖的反应可能为其合成乙酰氨基葡萄糖的限速步骤。枯草芽孢杆菌中有一些组成型启动子其表达强度不会受到环境因素的影响，其中启动子pveg强度较强，具体参见文献guizious等.aparttoolboxtotunegeneticexpressioninbacillussubtilis[j].nucleicacidsresearch,2016,44(15):gkw624。

技术实现要素：

为了解决上述问题，本发明提供了一种高效合成乙酰氨基葡萄糖的重组枯草芽孢杆菌。

本发明的第一个目的是提供一种乙酰氨基葡萄糖产量提高的重组枯草芽孢杆菌，所述重组枯草芽孢杆菌整合表达了磷酸酶基因yqab，并强化表达6-磷酸氨基葡萄糖合酶基因glms。

在本发明的一种实施方式中，所述整合表达磷酸酶基因yqab是以强组成型启动子pveg控制磷酸酶基因yqab表达，通过同源重组替换将其整合在基因组上。

在本发明的一种实施方式中，所述磷酸酶基因yqab表达的氨基酸序列如seqidno.3所示。

在本发明的一种实施方式中，强化表达6-磷酸氨基葡萄糖合酶基因glms是将6-磷酸氨基葡萄糖合酶基因glms的启动子pxyla替换为强组成型启动子pveg。

在本发明的一种实施方式中，所述重组枯草芽孢杆菌是以枯草芽孢杆菌bsgnkap-pxyla-glms-p43-gna1为出发菌株。

在本发明的一种实施方式中，所述枯草芽孢杆菌bsgnkap-pxyla-glms-p43-gna1是以枯草芽孢杆菌168为基础，基因型作如下改造得到的：δnagpδgampδgamaδnagaδnagbδldhδptaδglckδpckaδpyk::lox72，并以木糖诱导启动子pxyla调控表达glms、在质粒上以启动子p43调控表达gna1的重组表达。

在本发明的一种实施方式中，所述枯草芽孢杆菌bsgnkap，是申请号为201510761678.6的专利申请中构建的重组枯草芽孢杆菌bsgnkap。

在本发明的一种实施方式中，是以bsgnkap-pxyla-glms-p43-gna1为出发菌株，通过同源重组在基因组nagab位点以强启动子pveg控制磷酸酶基因yqab表达；并将6-磷酸氨基葡萄糖合酶基因glms的启动子替换为强组成型启动子pveg。

本发明的第二个目的是提供上述重组枯草芽孢杆菌在药物、营养保健品或者化妆品中的应用。

在本发明的一种实施方式中，所述应用是利用所述重组枯草芽孢杆菌生产乙酰氨基葡萄糖。

在本发明的一种实施方式中，所述应用是将生产菌株活化后，以5-10％的接种量转入发酵培养基，35-38℃、500-900rpm条件下培养50-72h。

本发明的有益效果：

本发明通过过表达6-磷酸氨基葡萄糖糖合酶glms，加强6-磷酸氨基葡萄糖糖合成的反应，细胞生长得到恢复，且乙酰氨基葡萄糖的产量及得率均有较大提高，解决了因强化反应后会竞争性的利用胞内细胞壁合成的前体物质6-磷酸氨基葡萄糖，从而导致的对细胞生长产生的不利影响。

本发明提供的重组枯草芽孢杆菌可高效利用葡萄糖合成乙酰氨基葡萄糖，其在3l发酵罐上产量可达到60.5g/l，同时本发明提供的重组枯草芽孢杆菌3l发酵乙酰氨基葡萄糖得率为0.311g/g葡萄糖，生产强度为0.983/l/h，实现了乙酰氨基葡萄糖在重组枯草芽孢杆菌胞外产量的提高，并为进一步代谢工程改造枯草芽孢杆菌生产氨基葡萄糖奠定了基础。

附图说明

图1为不同组成型启动子对调控yqab表达的影响；

图2为不同组成型启动子对调控glms表达的影响。

具体实施方式

种子培养基(g/l)：胰蛋白胨10，酵母粉5，nacl10。

摇瓶发酵培养基(g/l)：胰蛋白胨6，酵母粉12，(nh4)so46，k2hpo4·3h2o12.5，kh2po42.5，caco35，微量元素10ml/l；微量元素溶液按g/l计含有：mnso4·5h2o1.0，cocl2·6h2o0.4，namoo4·2h2o0.2，znso4·7h2o0.2，alcl3·6h2o0.1，cucl2·h2o0.1，h3bo40.05，含5mhcl。

上罐发酵培养基(g/l)：胰蛋白胨20，酵母粉20，k2hpo4·3h2o12.5，kh2po42.5，caco35，微量元素10ml/l；微量元素溶液按g/l计含有：mnso4·5h2o1.0，cocl2·6h2o0.4，namoo4·2h2o0.2，znso4·7h2o0.2，alcl3·6h2o0.1，cucl2·h2o0.1，h3bo40.05，含5mhcl。

乙酰氨基葡萄糖的测定方法：

高效液相色谱(hplc)检测法：agilent1260，rid检测器，hpx-87h柱(bio-radhercules,ca)，流动相：5mmh2so4，流速0.6ml/min，柱温35℃，进样体积为10μl。

乙酰氨基葡萄糖得率的计算：

乙酰氨基葡萄糖得率(yglcnac/glc)＝乙酰氨基葡萄糖产量(g/l)/消耗的葡萄糖(g/l)。

实施例1：构建重组枯草芽孢杆菌bsgny-pxyla-glms-p43-gna1

根据ncbi上公布的枯草芽孢杆菌(bacillussubtilis168购自美国典型微生物保藏中心，atccno.27370)的nagab基因的上下游序列以及磷酸酶编码基因yqab(核苷酸序列如ncbi-geneid:945776)，终止子λt0、强组成型启动子pveg、以及氯霉素抗性基因的序列，构建序列如seqidno.1所示表达盒，将磷酸酶yqab整合到基因组的nagab位点并使用强组成型启动子pveg进行表达。

将构建好的表达盒转化bsgnkap-pxyla-glms-p43-gna1(即专利申请201510761678.6中构建的重组枯草芽孢杆菌bsgnkap)，通过氯霉素抗性平板筛选、菌落pcr验证，确认得到重组枯草芽孢杆菌bsgny-pxyla-glms-p43-gna1。将质粒ptsc(南京农业大学，闫新博士惠赠，ncbiaccessionno.eu864234)转化重组枯草芽孢杆菌bsgny，消除氯霉素抗性。

实施例2：构建重组枯草芽孢杆菌bsgny-pveg-glms-p43-gna1

根据ncbi上公布的枯草芽孢杆菌(bacillussubtilis168购自美国典型微生物保藏中心，atccno.27370)的glms基因的及其上游序列，终止子λt0、强组成型启动子pveg、以及氯霉素抗性基因的序列，构建序列如seqidno.2所示的glms启动子替换框，将glms原有的启动子替换为强组成型启动子pveg。将构建好的替换框转入实施例一中的重组枯草芽孢杆菌bsgny-pxyla-glms-p43-gna1，通过氯霉素抗性平板筛选、菌落pcr验证，确认得到重组枯草芽孢杆菌bsgny-pveg-glms-p43-gna1。将质粒ptsc(南京农业大学，闫新博士惠赠，ncbiaccessionno.eu864234)转化重组枯草芽孢杆菌bsgny-pveg-glms-p43-gna1，消除氯霉素抗性。

实施例3：重组枯草芽孢杆菌bsgny-pveg-glms-p43-gna1发酵生产乙酰氨基葡萄糖

采用实施例2构建得到的重组芽孢杆菌进行3l发酵罐水平的验证，将37℃、220rpm下培养12h的种子以5％的接种量转入上罐发酵培养基，于3l发酵罐、35-37℃、500-900rpm条件下培养52-72h。最终发酵上清液中乙酰氨基葡萄糖含量达到60.5g/l，同时本发明提供的重组枯草芽孢杆菌3l发酵乙酰氨基葡萄糖得率为0.311g/g葡萄糖，生产强度为0.983g/l/h(结果如表1所示)，实现了乙酰氨基葡萄糖在重组枯草芽孢杆菌胞外产量的提高，并为进一步代谢工程改造枯草芽孢杆菌生产氨基葡萄糖奠定了基础。

表1过表达yqab与glms前后细胞生长和乙酰氨基葡萄糖合成情况

对照例1：采用不同组成型启动子调控yqab的表达

由于磷酸酶yqab的表达会对菌体生长产生一定的抑制作用，故利用实施例1的方式构建整合框，并分别使用文献guizious等.aparttoolboxtotunegeneticexpressioninbacillussubtilis[j].nucleicacidsresearch,2016,44(15):gkw624.报道的不同强度的组成型启动子pymda、pfbaa、plepa、prela调控yqab的表达，转化枯草芽孢杆菌后通过同源重组的方式将其整合在重组枯草芽孢杆菌基因组nagab位点，构建得到的重组芽孢杆菌进行摇瓶发酵。培养方式如下：将37℃、220rpm下培养12h的种子以5％的接种量转入摇瓶发酵培养基，两小时后加入木糖进行诱导，于37℃、220rpm条件下培养48h。发酵结果见图1，当启动子的强度减弱时，对细胞生长的影响也会减小，但乙酰氨基葡萄糖的产量也随之降低，所以选择较强的启动子pveg来调控yqab的表达。

对照例2：采用不同组成型启动子替换glms的启动子

采用实施例2的方式构建glms启动子的替换框，利用启动子pymda、pfbaa、plepa替换重组枯草芽孢杆菌bsgny-pxyla-glms-p43-gna1中glms的启动子，构建得到的重组芽孢杆菌进行摇瓶发酵。培养方式同对照例1，发酵结果如图2所示。当glms启动子替换为pveg时，菌体生长得到恢复，且乙酰氨基葡萄糖在摇瓶上的产量达到15.4g/l，对葡萄糖的得率为0.312g/g，而替换为启动子pymda时产量略低于pveg，替换为pfbaa和plepa时产量均较对照有所降低。

虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

序列表

<110>江南大学

<120>一种乙酰氨基葡萄糖产量提高的重组枯草芽孢杆菌

<160>3

<170>patentinversion3.3

<210>1

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<212>dna

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