本发明涉及一种植物根瘤内生菌的分离培养方法，尤其涉及一种沙棘属植物根瘤内生菌的分离培养方法，属于微生物分离培养技术领域。
背景技术：
植物内生菌（endophyte）是在一定阶段或全部阶段生活于健康植物的组织和器官内部的一大类微生物，他们能与植物形成寄生、共生、腐生等关系。研究发现，不仅从各种植物中可以分离得到内生菌，而且在同一种植物的根、茎、叶、花、果实和种子等中均有内生菌被发现。内生菌数量庞大，种类众多，包括内生真菌、内生细菌和内生放线菌等。植物内生菌具有丰富的生物多样性，对于一种植物而言，从中可分离到的内生真菌或细菌通常为几种至几十种，有的甚至可达几百种。植物内生菌也是一种具有潜在应用价值的新的微生物资源，从植物内生菌中寻找新的生物活性物质成为研究的热点。
沙棘是一种灌木或乔木，为胡颓子科沙棘属的放线菌结瘤植物。有学者用可培养的方法研究了野生沙棘健康的根、茎、叶组织中的内生菌，发现沙棘内生菌具有丰富的多样性。为了探明沙棘根瘤内是否存在多样的内生菌，需要展开进一步的资源调查，收集尽可能多的不同宿主来源的菌株，积累丰富的形态、生理和生化指标，建立和丰富沙棘属植物根瘤内生菌菌株资源库数据库。
对于内生菌多样性的研究，传统的方法主要是应用微生物培养技术，从特定的样品中通过分离、培养等获得微生物的纯培养物，再进行菌株的分类鉴定。但由于培养基与自然环境之间的营养差异较大，所以无法模拟沙棘根瘤内生菌栖息地的原有条件，大量微生物无法培养。传统方法在分离培养沙棘根瘤内生菌时，分别采用pda培养基、牛肉膏蛋白胨培养基和高氏i号培养基等，平板上分离到的内生菌种类和数量较少，不能充分地反映整个植物体内生菌的数量和种类。
技术实现要素：
本发明的目的是一种沙棘属植物根瘤内生菌的分离培养方法，以期得到大量的菌种资源，为以后更进一步的开展内生菌相关研究提供材料。
沙棘根瘤大小、颜色和形状等都会因为沙棘种类的不同，以及沙棘生长生境和时间的不同而有所变化。因此，选取新鲜幼嫩的沙棘根瘤，对沙棘根瘤样品进行表面消毒后，采用根瘤切片法和平板分离法，在不同的培养基上进行不同种类沙棘根瘤内生菌的分离培养。其具体工艺如下：
（1）对沙棘根瘤样品进行表面消毒：取备用的沙棘根瘤样品，依次用流动的自来水冲洗，并用毛笔刷洗掉泥沙等杂质后，用无菌水冲洗3~5次，用75%乙醇表面消毒8~10min、用1%naclo溶液表面消毒5~7min，再用无菌水冲洗3~5次（在整个操作过程中避沙棘根瘤样品表面破损）。
（2）内生菌培养分离：将经消毒处理的沙棘根瘤切片，分别置于不同平板上培养基上，采用不同的培养基，并加入沙棘根浸出液，进行无菌培养，培养温度为25~30℃，培养时间为3~7d；内生真菌采用pda培养基，内生细菌采用牛肉膏蛋白胨培养基，内生放线菌采用高氏i号培养基。培养基与沙棘根浸出液的体积比为1:15~1:20。
上述沙棘根浸出液的制备方法：将沙棘根洗净剪碎，与蒸馏水按1:1~1:1.5的体积比混合，煮沸后文火煎煮0.5~1h，过滤，取清液，121℃灭菌储存备用。
（3）内生菌的纯化：待组织块边缘长出菌落后转接至新鲜的平板，通过划线纯化，即得内生菌单菌落。
本发明相对现有技术具有以下优点：在沙棘根瘤内生菌分离时，培养基中加入沙棘根浸出液后的培养基更加接近内生菌生长的原始营养条件，更适合内生菌的生长。在分离内生菌的过程中，根瘤切片周围很快铺满生长较快的内生菌菌苔；并且在后期菌株的扩大培养中，加入沙棘根浸出液的培养基也能显著促进菌株的生长，显著增加了可培养根瘤内生菌菌株的种类和数量，获得更多的内生菌资源，并且可以缩短内生菌分离培养的时间。
附图说明
图1为未加沙棘根浸出液的沙棘根瘤内生菌培养图（左）及添加沙棘根浸出液的沙棘根瘤内生菌培养图（右）。
具体实施方式
下面通过具体实施例对本发明沙棘根瘤内生菌培养分离的方法及效果做进一步说明。
实施例1
（1）对沙棘根瘤样品进行表面消毒
选取新鲜幼嫩的沙棘根瘤，对沙棘根瘤样品进行表面消毒：取备用的沙棘根瘤样品，依次用流动的自来水冲洗，并用毛笔刷洗掉泥沙等杂质后，用无菌水冲洗3~5次，用75%乙醇表面消毒8~10min、用1%naclo溶液表面消毒5~7min，再用无菌水冲洗3~5次（在整个操作过程中避沙棘根瘤样品表面破损）。
（2）内生菌的分离培养
沙棘根浸出液的制备：将沙棘根洗净剪碎，与蒸馏水按1:1体积比混合，煮沸后用文火煮约1h，过滤，取清液，121℃灭菌储存备用。
内生菌的分离培养：用无菌解剖刀将根瘤切成1～2mm薄片，并将它插入三种不同的琼脂培养基上，25℃培养，待瘤片长出菌体后，用接种针将它挑接到平板上进一步纯化。
内生真菌采用pda培养基，在pda培养基中加入沙棘根浸出液（培养基与沙棘根浸出液的体积比为1:20），将平板置于25℃下培养7d。
内生细菌采用牛肉膏蛋白胨培养基，牛肉膏蛋白胨培养基中加入沙棘根浸出液（培养基与沙棘根浸出液的体积比为1:20），将平板置于25℃下培养7d。
内生放线菌采用高氏i号培养基，在培养基中加入沙棘根浸出液（培养基与沙棘根浸出液的体积比为1:20），将平板置于25℃下培养7d。
对照组：所有平板培养基中不加沙棘根浸出液，在相同条件下进行内生菌的分离培养。
（3）内生菌的纯化：待组织块边缘长出菌落后转接至新鲜的平板，通过划线纯化，然后在显微镜下观察并检测其纯度，直到获得内生菌单菌落，斜面保存备用。
根据菌落形态、颜色、边缘状态、透明度、表面干湿度等特征判断分离出的菌落种类并计数。结果见表1。
实施例2
（1）对沙棘根瘤样品进行表面消毒：同实施例1。
（2）内生菌的分离培养：内生菌的分离培养：用无菌解剖刀将根瘤切成1～2mm薄片，并将它插入三种不同的琼脂培养基上，28℃培养，待瘤片长出菌体后，用接种针将它挑接到平板上进一步纯化。
内生真菌采用pda培养基，在pda培养基中加入沙棘根浸出液（培养基与沙棘根浸出液的体积比为1:15），将平板置于28℃下培养5d。
内生细菌采用牛肉膏蛋白胨培养基，牛肉膏蛋白胨培养基中加入沙棘根浸出液（培养基与沙棘根浸出液的体积比为1:15），将平板置于28℃下培养5d。
内生放线菌采用高氏i号培养基，在培养基中加入沙棘根浸出液（培养基与沙棘根浸出液的体积比为1:15），将平板置于28℃下培养5d。
对照组：所有平板培养基中不加沙棘根浸出液，在相同条件下进行内生菌的分离培养。
（3）内生菌的纯化：待组织块边缘长出菌落后转接至新鲜的平板，通过划线纯化，然后在显微镜下观察并检测其纯度，直到获得内生菌单菌落，斜面保存备用。
根据菌落形态、颜色、边缘状态、透明度、表面干湿度等特征判断分离出的菌落种类并计数。结果见表1。
实施例3
（1）对沙棘根瘤样品进行表面消毒：同实施例1。
（2）内生菌的分离培养：内生菌的分离培养：用无菌解剖刀将根瘤切成1～2mm薄片，并将它插入三种不同的琼脂培养基上，30℃培养，待瘤片长出菌体后，用接种针将它挑接到平板上进一步纯化。
内生真菌采用pda培养基，在pda培养基中加入沙棘根浸出液（培养基与沙棘根浸出液的体积比为1:18），将平板置于30℃下培养3d。
内生细菌采用牛肉膏蛋白胨培养基，牛肉膏蛋白胨培养基中加入沙棘根浸出液（培养基与沙棘根浸出液的体积比为1:15），将平板置于30℃下培养3d。
内生放线菌采用高氏i号培养基，在培养基中加入沙棘根浸出液（培养基与沙棘根浸出液的体积比为1:15），将平板置于30℃下培养3d。
对照组：所有平板培养基中不加沙棘根浸出液，在相同条件下进行内生菌的分离培养。
（3）内生菌的纯化：待组织块边缘长出菌落后转接至新鲜的平板，通过划线纯化，然后在显微镜下观察并检测其纯度，直到获得内生菌单菌落，斜面保存备用。
根据菌落形态、颜色、边缘状态、透明度、表面干湿度等特征判断分离出的菌落种类并计数。结果见表1。
上述各实施例中，沙棘根浸出液的制备方法为：将沙棘根洗净剪碎，与蒸馏水按1:1体积比混合，煮沸后用文火煮约1h，过滤，取清液，121℃灭菌储存备用。
表1沙棘根瘤内生菌的分离效果
表1中的结果表明，采用本发明加入沙棘根浸出液后的培养基营养更加接近内生菌生长的原始营养条件，更适合内生菌的生长。获得了更多的内生菌菌株。与不加沙棘根浸出液的培养基相比，可以显著增加可培养根瘤内生菌菌株的种类和数量，获得更多的内生菌资源，并且可以缩短内生菌分离培养的时间。