本发明属于生物提取
技术领域：
，具体涉及一种脱苦罗汉果提取物的提取方法。
背景技术：
：罗汉果，属双子叶植物纲葫芦科罗汉果属植物的果实，主要产于广西、广东、湖南、江西等地。罗汉果的干燥果实为椭圆或圆形，外壳棕褐色或烟熏色，附有大量细小黑色柔毛，比鹅蛋略大。干果较轻，种子、果皮和果肉均可入药。罗汉果的营养价值极高，含有大量的糖类、蛋白质、维生素、脂肪酸、多种人体必需的氨基酸和微量元素。罗汉果的甜味主要来自于罗汉果皂甙（是糖的甜度的300倍），属于天然的甜味剂。但是罗汉果皂甙的甜度很强，入口以后，在口内的停留时间长，口感不好。并且罗汉果皂甙的水溶性也不是很理想，易在水中结成小团状，要使之全部溶解，需要加热以及较长的搅拌时间。罗汉果果实中分离并鉴定出了赛门甙ⅰ、罗汉果甜甙ⅱe、罗汉果甜甙ⅲ、罗汉果甜甙ⅲe、罗汉果甜甙ⅳ、罗汉果甜甙ⅴ、罗汉果甜甙a、罗汉果新甙等葫芦烷素三萜甙类物质，除罗汉果甜甙ⅳ无甜味，罗汉果新甙为苦味外，均为甜味物质，其中罗汉果甜甙ⅴ的甜度最高，相当于蔗糖的300倍，且甜味纯正、无异味、回味感强、热稳定性好，可作为食品、菜肴的甜味剂，是糖尿病人的理想糖代品。罗汉果甜甙ⅴ热稳定性好，在100℃水溶液中稳定，在120℃连续加热12h以上仍不会被破坏，属非发酵物质，利于加工贮存。目前，从罗汉果提取物的制备方法主要有以下两种，一是水提加树脂分离法，将罗汉果破碎后装入提取罐中，加水提取，多次提取后，合并提取液，过滤，上树脂进行吸附分离，用乙醇或甲醇洗脱，洗脱液去醇后，喷雾干燥而成；二是醇提膜分离法，其工艺是将罗汉果破碎，装入提取罐中，加入乙醇进行提取，多次提取后，合并提取液，过滤，将滤液通过膜分离浓缩，浓缩液真空干燥而成。然而上述方法提取的罗汉果提取物中含有罗汉果新甙，导致罗汉果提取物中有强烈的后苦味，且中药味较浓，影响了罗汉果提取物的口感并限制了其作为天然甜味剂的应用。因此研究开发一种脱苦且味道较为纯正的罗汉果提取物的方法非常重要，以利于扩大罗汉果提取物的市场。技术实现要素：本发明所要解决的技术问题：针对目前罗汉果提取物中含有罗汉果新甙，导致罗汉果提取物中有强烈的后苦味，且中药味较浓，影响了罗汉果提取物的口感的问题，提供一种脱苦罗汉果提取物的提取方法。为解决上述技术问题，本发明采用如下所述的技术方案是：一种脱苦罗汉果提取物的提取方法，该制备方法包括如下步骤：（1）按质量比1：3~4，将罗汉果苦果、水进行混合，再利用超临界二氧化碳流体提取，得提取液，按质量比1：2~3，将活性炭、提取液进行混合浸泡，过滤，得滤液，将滤液用水、乙醇溶液进行洗脱，直至无色液体流出，收集洗脱液，将洗脱液进行减压蒸馏，回收乙醇，得蒸馏物，备用；（2）按重量份数计，取50~60份水、20~25份葡萄糖、14~16份琼脂、7~8份蛋白胨、3~4份酵母粉、1~2份磷酸氢二钾、0.5~1份硫酸镁进行混合，高温灭菌，得营养液，按质量比1：3~4，将绿萝的培养土、营养液进行混合发酵2~3d，得发酵物，将发酵物用水稀释，收集上清液；（3）按重量份数计，取30~40份水、10~15份牛肉膏、7~8份蛋白胨、3~4份氯化钠进行混合，高温灭菌，得培养液，按质量比1：2~3，将上清液、培养液放入培养基中进行培养，每隔1~2d向培养基中加入培养液质量1~2%的步骤（1）备用的蒸馏物，培养7~8d，得培养液a；（4）将罗汉果放入粉碎机中粉碎，得粉碎物，按质量比1：3~4：0.8~1，将粉碎物、乙醇溶液、培养液a进行混合，高压处理，得处理液，将处理液进行回流提取，得到提取液a；（5）按质量比1：2~3，将活性炭、提取液a进行混合浸泡，过滤，得滤液a，将滤液a用水、乙醇溶液进行洗脱，直至无色液体流出，收集洗脱液a，将洗脱液a进行超滤，得超滤物，将超滤物进行冷冻干燥，收集干燥物，即得脱苦罗汉果提取物。所述步骤（1）中超临界二氧化碳流体提取的参数为压力为15~20mpa，温度为55~65℃。所述步骤（1）中减压蒸馏的参数为真空度为13.3pa，温度55~65℃。所述步骤（4）中高压处理为压力为18~28mpa，处理3~8min。所述步骤（4）中回流提取参数为温度30~60℃，提取60~120min。所述步骤（5）中超滤的参数为压力为0.1~0.6mpa，温度40~60℃。本发明与其他方法相比，有益技术效果是：本发明先利用罗汉果苦果中提取苦分物质罗汉果新苷，再利用细菌培养基从绿萝培养土中分离得到的缠绕棒杆菌，它能产生用于苦素代谢作用的酶而不需外加苦素作诱导剂，同时利用培养基进行培养，培养过程中添加所提取得苦分物质，使其具有专一性，能够分解罗汉果中的苦分物质，从而使罗汉果脱苦，提高它的口感，本发明先将罗汉果放入脱苦菌液中除去苦分物质罗汉果新苷，再利用乙醇溶液洗脱，获得含有多种有效成分的罗汉果提取物，以及利用活性炭脱除色素，使制备得到的提取物具有显著的抗疲劳功效，且本发明罗汉果提取物无苦味，无中药味，口味纯正。具体实施方式一种脱苦罗汉果提取物的提取方法，该制备方法包括如下步骤：（1）按质量比1：3~4，将罗汉果苦果、水进行混合，再在压力为15~20mpa，温度为55~65℃下利用超临界二氧化碳流体提取，得提取液，按质量比1：2~3，将活性炭、提取液进行混合，浸泡30~40min，过滤，得滤液，将滤液用水、1.0mol/l乙醇溶液进行洗脱，直至无色液体流出，收集洗脱液，将洗脱液在真空度为13.3pa，温度55~65℃进行减压蒸馏，回收乙醇，得蒸馏物，备用；（2）按重量份数计，取50~60份水、20~25份葡萄糖、14~16份琼脂、7~8份蛋白胨、3~4份酵母粉、1~2份磷酸氢二钾、0.5~1份硫酸镁进行混合，高温灭菌，得营养液，按质量比1：3~4，将绿萝的培养土、营养液进行混合，在温度30~40℃下进行发酵2~3d，得发酵物，将发酵物用水稀释，收集上清液；（3）按重量份数计，取30~40份水、10~15份牛肉膏、7~8份蛋白胨、3~4份氯化钠进行混合，高温灭菌，得培养液，按质量比1：2~3，将上清液、培养液放入培养基中，并在温度25~30℃下进行培养，每隔1~2d向培养基中加入培养液质量1~2%的步骤（1）备用的蒸馏物，培养7~8d，得培养液a；（4）将罗汉果放入粉碎机中粉碎，得粉碎物，按质量比1：3~4：0.8~1，将粉碎物、1.0mol/l乙醇溶液、培养液a进行混合，在压力为18~28mpa下高压处理3~8min，得处理液，将处理液在30~60℃下回流提取60~120min，得到提取液a；（5）按质量比1：2~3，将活性炭、提取液a进行混合，浸泡30~40min，过滤，得滤液a，将滤液a用水、1.0mol/l乙醇溶液进行洗脱，直至无色液体流出，收集洗脱液a，将洗脱液a在压力为0.1~0.6mpa，温度40~60℃进行超滤，得超滤物，将超滤物进行冷冻干燥，收集干燥物，即得脱苦罗汉果提取物。实施例1一种脱苦罗汉果提取物的提取方法，该制备方法包括如下步骤：（1）按质量比1：3，将罗汉果苦果、水进行混合，再在压力为15mpa，温度为55℃下利用超临界二氧化碳流体提取，得提取液，按质量比1：2，将活性炭、提取液进行混合，浸泡30min，过滤，得滤液，将滤液用水、1.0mol/l乙醇溶液进行洗脱，直至无色液体流出，收集洗脱液，将洗脱液在真空度为13.3pa，温度55℃进行减压蒸馏，回收乙醇，得蒸馏物，备用；（2）按重量份数计，取50份水、20份葡萄糖、14份琼脂、7份蛋白胨、3份酵母粉、1份磷酸氢二钾、0.5份硫酸镁进行混合，高温灭菌，得营养液，按质量比1：3，将绿萝培养土、营养液进行混合，在温度30℃下进行发酵2d，得发酵物，将发酵物用水稀释，收集上清液；（3）按重量份数计，取30份水、10份牛肉膏、7份蛋白胨、3份氯化钠进行混合，高温灭菌，得培养液，按质量比1：2，将上清液、培养液放入培养基中，并在温度25℃下进行培养，每隔1d向培养基中加入培养液质量1%的步骤（1）备用的蒸馏物，培养7d，得培养液a；（4）将罗汉果放入粉碎机中粉碎，得粉碎物，按质量比1：3：0.8，将粉碎物、1.0mol/l乙醇溶液、培养液a进行混合，在压力为18mpa下高压处理3min，得处理液，将处理液在30℃下回流提取60min，得到提取液a；（5）按质量比1：2，将活性炭、提取液a进行混合，浸泡30min，过滤，得滤液a，将滤液a用水、1.0mol/l乙醇溶液进行洗脱，直至无色液体流出，收集洗脱液a，将洗脱液a在压力为0.1mpa，温度40℃进行超滤，得超滤物，将超滤物进行冷冻干燥，收集干燥物，即得脱苦罗汉果提取物。取提取液，加入等量的罗汉果苦甙和罗汉果甜甙，检测苦甙和甜甙的含量变化，以此表征其是否分解罗汉果甜甙和罗汉果苦甙具体检测情况如表1表1检测项目罗汉果苦甙罗汉果甜甙减少的含量（%）720由上可知，实施例1所得到的提取液可以分解罗汉果苦甙，不分解罗汉果甜甙。实施例2一种脱苦罗汉果提取物的提取方法，该制备方法包括如下步骤：（1）按质量比1：3，将罗汉果苦果、水进行混合，再在压力为15mpa，温度为55℃下利用超临界二氧化碳流体提取，得提取液，按质量比1：2，将活性炭、提取液进行混合，浸泡30min，过滤，得滤液，将滤液用水、1.0mol/l乙醇溶液进行洗脱，直至无色液体流出，收集洗脱液，将洗脱液在真空度为13.3pa，温度55℃进行减压蒸馏，回收乙醇，得蒸馏物，备用；（2）按重量份数计，取50份水、20份葡萄糖、14~份琼脂、7份蛋白胨、3份酵母粉、1份磷酸氢二钾、0.5份硫酸镁进行混合，高温灭菌，得营养液，按质量比1：3，将绿萝培养土、营养液进行混合，在温度30℃下进行发酵2d，得发酵物，将发酵物用水稀释，收集上清液；（3）按重量份数计，取35份水、13份牛肉膏、7份蛋白胨、3份氯化钠进行混合，高温灭菌，得培养液，按质量比1：2.5，将上清液、培养液放入培养基中，并在温度25~30℃下进行培养，每隔1.5d向培养基中加入培养液质量2%的步骤（1）备用的蒸馏物，培养7d，得培养液a；（4）将罗汉果放入粉碎机中粉碎，得粉碎物，按质量比1：3：0.9，将粉碎物、1.0mol/l乙醇溶液、培养液a进行混合，在压力为23mpa下高压处理6min，得处理液，将处理液在45℃下回流提取80min，得到提取液a；（5）按质量比1：2，将活性炭、提取液a进行混合，浸泡35min，过滤，得滤液a，将滤液a用水、1.0mol/l乙醇溶液进行洗脱，直至无色液体流出，收集洗脱液a，将洗脱液a在压力为0.4mpa，温度50℃进行超滤，得超滤物，将超滤物进行冷冻干燥，收集干燥物，即得脱苦罗汉果提取物。取实施例所制备的提取液和罗汉果发酵液，检测其中苦甙含量。苦甙含量具体检测情况如表2表2检测项目提取液罗汉果发酵液苦甙含量（%）7.88.27由上可知，实施例2中所制备出的提取液和罗汉果发酵液中的苦甙含量低，几乎可以忽略。实施例3一种脱苦罗汉果提取物的提取方法，该制备方法包括如下步骤：（1）按质量比1：3.5，将罗汉果苦果、水进行混合，再在压力为17mpa，温度为60℃下利用超临界二氧化碳流体提取，得提取液，按质量比1：2，将活性炭、提取液进行混合，浸泡35min，过滤，得滤液，将滤液用水、1.0mol/l乙醇溶液进行洗脱，直至无色液体流出，收集洗脱液，将洗脱液在真空度为13.3pa，温度60℃进行减压蒸馏，回收乙醇，得蒸馏物，备用；（2）按重量份数计，取55份水、23份葡萄糖、15份琼脂、7份蛋白胨、3份酵母粉、1份磷酸氢二钾、0.7份硫酸镁进行混合，高温灭菌，得营养液，按质量比1：3，将绿萝培养土、营养液进行混合，在温度35℃下进行发酵2d，得发酵物，将发酵物用水稀释，收集上清液；（3）按重量份数计，取35份水、13份牛肉膏、7份蛋白胨、3份氯化钠进行混合，高温灭菌，得培养液，按质量比1：2，将上清液、培养液放入培养基中，并在温度27℃下进行培养，每隔1d向培养基中加入培养液质量1%的步骤（1）备用的蒸馏物，培养7d，得培养液a；（4）将罗汉果放入粉碎机中粉碎，得粉碎物，按质量比1：3：0.9，将粉碎物、1.0mol/l乙醇溶液、培养液a进行混合，在压力为24mpa下高压处理6min，得处理液，将处理液在50℃下回流提取90min，得到提取液a；（5）按质量比1：2，将活性炭、提取液a进行混合，浸泡35min，过滤，得滤液a，将滤液a用水、1.0mol/l乙醇溶液进行洗脱，直至无色液体流出，收集洗脱液a，将洗脱液a在压力为0.4mpa，温度50℃进行超滤，得超滤物，将超滤物进行冷冻干燥，收集干燥物，即得脱苦罗汉果提取物。实施例4一种脱苦罗汉果提取物的提取方法，该制备方法包括如下步骤：（1）按质量比1：4，将罗汉果苦果、水进行混合，再在压力为20mpa，温度为65℃下利用超临界二氧化碳流体提取，得提取液，按质量比1：3，将活性炭、提取液进行混合，浸泡40min，过滤，得滤液，将滤液用水、1.0mol/l乙醇溶液进行洗脱，直至无色液体流出，收集洗脱液，将洗脱液在真空度为13.3pa，温度65℃进行减压蒸馏，回收乙醇，得蒸馏物，备用；（2）按重量份数计，取60份水、25份葡萄糖、16份琼脂、8份蛋白胨、4份酵母粉、2份磷酸氢二钾、1份硫酸镁进行混合，高温灭菌，得营养液，按质量比1：4，将绿萝培养土、营养液进行混合，在温度40℃下进行发酵3d，得发酵物，将发酵物用水稀释，收集上清液；（3）按重量份数计，取40份水、15份牛肉膏、8份蛋白胨、4份氯化钠进行混合，高温灭菌，得培养液，按质量比1：3，将上清液、培养液放入培养基中，并在温度30℃下进行培养，每隔2d向培养基中加入培养液质量2%的步骤（1）备用的蒸馏物，培养8d，得培养液a；（4）将罗汉果放入粉碎机中粉碎，得粉碎物，按质量比1：4：1，将粉碎物、1.0mol/l乙醇溶液、培养液a进行混合，在压力为28mpa下高压处理8min，得处理液，将处理液在60℃下回流提取120min，得到提取液a；（5）按质量比1：3，将活性炭、提取液a进行混合，浸泡40min，过滤，得滤液a，将滤液a用水、1.0mol/l乙醇溶液进行洗脱，直至无色液体流出，收集洗脱液a，将洗脱液a在压力为0.6mpa，温度60℃进行超滤，得超滤物，将超滤物进行冷冻干燥，收集干燥物，即得脱苦罗汉果提取物。对比例：桂林某生态农业有限公司生产的脱苦罗汉果提取物方法：取等量的实施例与对比例所制备的脱苦罗汉果提取物，采用高效液相分析仪检测其的罗汉果甜甙的含量，以此来表征纯度的高低。罗汉果提取物具体检测情况如表3表3检测项目实施例3实施4对比例甜甙含量（%）717451苦甙含量（%）0011.4由上可知，本发明所制备的脱苦罗汉果提取物的甜甙含量高，纯度高，是一种安全且高效的罗汉果提取物，值得推广和使用。当前第1页12