一种尼莫克汀发酵杂质优化控制方法与流程

本发明属于生物
技术领域：
，具体涉及一种尼莫克汀发酵生产的方法。
背景技术：
尼莫克汀是由蓝灰链霉菌(streptomycescyaneogriseussp.noncyanogenus)产生的十六元大环内酯类抗生素，和阿维菌素与米尔贝霉素一样，表现出很好的抗寄生虫活性。分子量：612.8，化学式：c36h52o8。作为抗寄生虫抗生素，尼莫克汀具有杀虫谱广，易降解，低残留，无抗药性，对人畜无害，环境污染少等优点，并且还可由尼莫克汀合成活性更强的莫西克汀(moxidectin)。现有的专利文献对尼莫克汀发酵过程a1杂质优化控制方法基本没有涉及，而这个杂质在提取工段去除代价较高，在发酵工序进行有效控制，无疑能大大降低成本提高收益。因此我们通过分析研究、开展大量摇瓶实验以及发酵实践探索，对如何控制该杂质掌握了较好的方法，为提取控制好该杂质，并最终使成品a杂质达到ep版要求提供了有利条件。莫西克汀是通过尼莫克汀合成后的产物。a1杂质的命名是源自欧洲药典6.0中对莫西克汀中一个相关杂质a的命名。莫西克汀a杂质的结构式如下：a.r1＝r2＝r3＝r4＝ch3,r5＝r6＝h25-des[(1e)-1,3-dimethylbut-1-enyl]-25-[(1e)-1-methylprop-1-enyl]moxidectin根据其合成反应原理，在合成反应前，a杂质的结构如下r1＝r2＝r3＝r4＝ch3,r5＝r6＝h为了方便称呼，将莫西克汀成品中杂质a在合成前的杂质结构称为a1。技术实现要素：本发明目的是针对现有技术的不足之处，本发明提供了一种尼莫克汀发酵a1杂质优化控制方法，其技术方案如下：为实现本发明目的技术方案为：一种尼莫克汀发酵杂质优化控制方法，所述尼莫克汀发酵杂质为莫西克汀a杂质合成前的结构(a1杂质)，所述方法包括操作：种子罐内种龄控制在60-70小时；和底部搅拌桨叶反装；和/或发酵过程中，发酵140小时后下调发酵罐内搅拌器的转速。种龄是种子培养时间，是从种子罐接种开始到转入发酵罐截止计算的时间。优选地，种子罐内种龄控制在65-66小时。本发明优选技术方案之一为，发酵罐内搅拌器为三档搅拌型，顶部设置四宽桨叶、中部设置四宽桨叶，底部是在水平圆盘上安装6-8个搅拌桨叶。更优选地，发酵罐内搅拌器底部的搅拌桨叶是抛物线形状的叶片，抛物线凸起部朝向搅拌的方向。其中，发酵过程中，发酵140-144小时时，下调发酵罐内搅拌器的转速，下调的幅度为30-40％，同时下调通气量，下调的幅度为25-35％。其中，发酵过程中，发酵260-264小时时，下调发酵罐内搅拌器的转速，下调的幅度为25-30％；同时下调通气量，下调的幅度为20-30％。其中，对于体积为150m3的发酵罐，发酵过程中，接种后10小时内搅拌器转速为15-35rpm，接种后10-140小时内搅拌器转速为30-100rpm。更优选地，对于体积为150m3的发酵罐，发酵过程中，接种后10小时内搅拌器转速为15-35rpm，接种后10-22小时内搅拌器转速为30-80rpm(不含22小时)，接种后22-140小时内搅拌器转速为80-100rpm。其中，发酵过程中，接种后10小时内通气比为1：0.2-0.3，接种后10-140小时通气比为1：0.5-0.7。本发明的有益效果在于：本发明提供的尼莫克汀发酵a1杂质优化控制方法，(1)精细化了种子罐种龄控制，我们采用常规选育菌种用于生产，通过观察和反复研究，将种龄锁定在约66小时转种，利于更好活力种子进入发酵罐之后前期a1杂质控制。(2)通过反复观察和比较，筛选出了优化发酵罐搅拌型式，优化配置的搅拌剪切力小，混合较好，观察菌丝更有活力，利于发酵罐前期a1杂质控制。(3)优化发酵代谢过程关键工艺控制点，a1杂质在前期有效控制的基础上，中后期得到进一步控制和降低。(4)本发明操作不需要调整原有培养基配方，简单、实用、经济、有效。附图说明图1为发酵罐内搅拌器结构简图。图2为底部抛物线形桨叶的安装示意图。图中，1为顶部四宽桨叶，2为中部四宽桨叶，3为底部水平圆盘，301为抛物线形状桨叶，4为搅拌轴。具体实施方式以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。如无特别说明，实施例中所采用的手段均为本领域常规的技术手段。a1杂质的检测方法和莫西克汀a杂质的检测方法一样，具体为：色谱柱型号：l＝0.15m，φ＝3.9mm；固定相：十八烷基键合硅胶为填充剂(4μm)；柱温：50℃。流动相：乙酸铵的冰醋酸缓冲溶液—乙腈(r)＝400:600。r指“分析纯”。乙酸铵的冰醋酸缓冲溶液的配制方法为：称取7.7g乙酸铵(r)加水(r)溶解并稀释至近400ml时，用冰醋酸(r)调ph为4.8，加水(r)至400ml。r“水”指“纯化水”。流速：2.5ml/min。检测：吸收波长242nm。相对保留值(相对于莫西克丁保留时间＝12min):杂质a1＝约0.5。实施例1150m3发酵罐工艺控制：种龄：66小时参见图1，发酵罐内搅拌器型式：顶部四宽桨叶1+中部四宽桨叶2+底部抛物线反装(现有技术中，桨叶凸起和转动方向相对)，顶部搅拌器约在搅拌轴4的70％高度处；中部四宽桨叶2约设在35％高度处，底部是在水平圆盘上焊接安装8个搅拌桨叶。图2是在水平圆盘上2个抛物线形状桨叶301的安装示意图(其他桨叶未示出)。发酵罐内搅拌器底部的搅拌桨叶是抛物线形状的叶片，抛物线凸起部朝向搅拌的方向，即俯视角度的顺时针方向。发酵过程参数见表1。表1：实施例1发酵参数调速后搅拌剪切力小，混合较好，通过取样观察，观察到菌丝更有活力，利于发酵罐前期a1杂质控制。本实施例共发酵357小时，得到的产品中a1杂质为1.0％(杂质含量指hplc图谱a1杂质面积百分比％)。实施例2150m3发酵罐工艺控制：种龄：65小时。发酵罐搅拌型式：顶部四宽桨叶+中部四宽桨叶+底部抛物线反装。发酵过程参数见表2。表2：实施例2发酵参数培时h通气比vvm转速rpm溶氧％a1杂质比例％种后1:0.2530100101:0.604066161:0.608048221:0.7010046311:0.709060461:0.709068701:0.709076941:0.7090812.61421:0.4956792.01661:0.4956842.21901:0.4956861.92621:0.3739761.82861:0.3739771.63101:0.3739751.53571:0.3739800.8注：本实施例在22小时时提到100rpm，转速提高到100rpm后，电机有一些异响，因此31小时时下调转速。一共发酵357小时，得到的产品中a1杂质为0.8％。对比例1150m3发酵罐，底部抛物线没有反装，发酵357小时后a1杂质比例参见表3。表3对比例1发酵参数培时h通气比vvm转速rpm溶氧％a1杂质比例％种后1:0.3530100121:0.573058381:0.575059621:0.578071861:0.5785652.41101:0.5790622.81341:0.5090602.81581:0.5070602.51821:0.5070622.92301:0.5070594.42581:0.5070633.62781:0.5070633.63261:0.5070663.63421:0.5070653.83571:0.5070654.2对比例2和实施例1相同的150m3发酵罐，种龄是46小时。发酵357小时后a1杂质比例参见表4。表4对比例2发酵参数对比例3和实施例1相同的150m3发酵罐、种龄，发酵过程中基本一直保持80rpm转速发酵357小时后a1杂质比例参见表5。表5对比例3发酵参数培时h通气比vvm转速rpm溶氧％a1杂质比例％种后1:0.3030100141:0.606053381:0.608075621:0.608082861:0.6080873.31101:0.6080802.91341:0.5080812.41821:0.5080902.82061:0.5080882.92301:0.5080863.52541:0.5080833.32781:0.5080853.33081:0.5080923.63261:0.5080913.73501:0.5080953.33571:0.5080933.5本
技术领域：
内的一般技术人员应当认识到，上述实施例仅是用来说明本发明，而并非用作对本发明的限定，只要在本发明的实质精神范围内，对上述实施例的变换、变型都将落在本发明权利要求的范围内。当前第1页12