一株米曲霉ZA160及其应用的制作方法

本发明属于工业微生物技术领域，尤其涉及一株适用于酱油、酱等调味品的米曲霉(aspergillusoryzae)，还涉及所述米曲霉在制备酱油和/或酱中的用途。

背景技术：

米曲霉是我国传统发酵调味食品——酱油酿造用关键菌种。目前，我国90％的酱油生产企业均采用米曲霉沪酿3.042制曲，为后续发酵过程提供所需的各种酶系，如蛋白水解酶系、淀粉水解酶系、纤维素酶、植酸酶等。

采用沪酿3.042米曲霉制曲，在现有制曲条件下，其所产蛋白水解酶以中性和碱性蛋白酶为主，其他酶系不足，使得原料中各种成分如淀粉质原料不能完全被分解，导致酿造酱油风味不足，特别是甜味不足以及产品色泽不佳。为了维持产品良好的甜味以及消费者喜欢的色泽，往往会通过额外添加甜味剂如蔗糖、三氯蔗糖以及增色剂如焦糖色来提升产品品质，生产出符合消费者口味的产品。但是在日益关注饮食健康问题的今天，额外添加这些添加剂不但会使得生产成本增加，而且还会给消费者留下不好的印象，最终影响了产品的竞争力。

目前酱油的甜味与酱油中的糖类含量有关，而酱油的色泽主要来源于酱油发酵过程中糖类的美拉德反应所产生。因此糖分在酱油生产中有着非常重要的作用。

米曲霉所分泌的淀粉水解酶对酱油的糖分含量有着十分重要的影响。米曲霉所分泌的淀粉水解酶主要有液化酶和糖化酶，它们对酿造酱油生产中的淀粉质原料进行作用，使淀粉质原料分解产生葡萄糖等小分子糖类物质，而这些小分子糖类物质正是形成酱油色、香、味的前提。米曲霉分泌的淀粉酶作用于淀粉产生的葡萄糖除了为米曲霉、酵母菌及其它微生物提供生长所需的碳源之外，部分糖类还可以被乳酸菌、酵母菌等微生物转化成构成酱油风味物质的其它重要成分，例如乳酸、乙醇等。此外，小分子糖类物质除了提供口感上的甜味外，还可以与大豆蛋白质的降解产物氨基酸发生美拉德反应，对酱油的颜色形成发挥着重要作用。总之，淀粉原料降解的生成的糖类物质对酱油的色、香、味均有重大影响。

中国发明专利申请cn106434383a、发明名称为“一株高产真菌淀粉酶的米曲霉菌株”的专利申请公开了一株米曲霉，特点是在液体摇瓶发酵中真菌淀粉酶酶活较高，为2184u/ml，降低了真菌淀粉酶的生产成本。然而该专利文献提到的米曲霉适用于液体发酵及酶制剂生产领域，而酱油及酱的生产是固态培养，米曲霉在固体环境中产酶，固态和液态两种培养方式有着本质上的不同，不适用于酱油及酱等调味品生产领域。

技术实现要素：

本发明的一个目的是提供一株淀粉水解酶酶活高，能充分分解淀粉质原料产生高还原糖的米曲霉菌株。本发明的另一个目的是提供上述米曲霉的培养方法。本发明的第三个目的是提供一种应用上述米曲霉制备高还原糖酱油或酱的方法。通过上述研究目的，从源头上解决现有酱油或酱生产菌株淀粉水解酶酶活不高的局限性，使淀粉质原料充分分解成葡萄糖、果糖等小分子糖类，从色、香、味等全方位提高酱油或酱的品质。

本发明提供一株米曲霉菌株，所述菌株为米曲霉za160，该菌株于2017年5月17日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏地址：广东省广州市先烈中路100号大院59号楼5楼，邮政编码：510075，保藏号为gdmccno：60186。

米曲霉za160的菌落特征如下：在豆汁培养基上，菌落为圆形，在28℃培养5天后菌落直径可达34-39mm；菌丝生长旺盛，营养菌丝从菌落中心向外呈辐射状生长，菌落背面为黄褐色；气生菌丝呈蓬松丝绒状，白色，气生菌丝生长高度从菌落中心向菌落边缘递减，其上附着有分生孢子，培养初期孢子的颜色为黄白色，到了成熟期孢子颜色转变成黄绿色。

米曲霉za160菌株是以沪酿3.042为出发菌株，通过诱变选育获得的。具体地，本发明所述的米曲霉za160菌株的诱变选育方法如下。

以沪酿3.042为出发菌株，使用公知诱变方法之一对出发菌株进行诱变获得变异菌株，使用双平板培养基对变异菌株进行筛选。即在淀粉-锥虫蓝平板上筛选透明圈比出发菌株大且菌丝生长旺盛的诱变菌株；在脱脂牛奶平板上筛选透明圈不小于出发菌株且菌丝生长旺盛的诱变菌株。挑选同时满足上述双平板筛选条件的菌株进行进一步筛选。

采用与沪酿3.042菌种相同的常规培养方法培养上述挑选出的米曲霉变异菌株种曲，观察米曲霉生长情况，挑选生长速度快，孢子丰富的米曲霉变异菌株种曲，使用常规方法检测其淀粉酶、糖化酶、中性蛋白酶酶活力。选取综合酶活力高的菌株进行进一步筛选。

对上述筛选出的综合酶活力高的菌株采用曲池或者圆盘制曲机制曲，并进行生产试验。筛选出一株生长速度快、成曲孢子丰富、淀粉酶活力最高的菌株。该菌株命名为米曲霉za160，已于2017年5月17日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏地址：广东省广州市先烈中路100号大院59号楼5楼，邮政编码：510075，保藏号为gdmccno：60186。

将米曲霉变异菌株在豆汁培养基上连续传代7代。将第3代、第5代、第7代豆汁斜面菌种按照上述方法制作成种曲，观察记录种曲生长情况，并检测种曲的淀粉酶、糖化酶、中性蛋白酶活力。考察各代之间的酶活力稳定性，若到第7代还未发生回复突变，则表明菌株遗传稳定性良好。

其中，上述双平板培养基分别是淀粉-锥虫蓝培养基和脱脂牛奶培养基。

淀粉-锥虫蓝培养基的配方为：称取10g淀粉，5g硫酸铵，0.5g氯化钾，0.5g七水硫酸镁，0.03g七水硫酸亚铁，0.05g锥虫蓝，50g氯化钠，18g琼脂粉，溶于1000ml蒸馏水中，调节ph5.7～6.5，分装，0.1mpa、121℃灭菌15min。

脱脂牛奶培养基的配方为：称取10g脱脂奶粉，0.36g磷酸二氢钾，0.58g磷酸氢二钠，0.244g硫酸镁，18g琼脂粉，溶于1000ml蒸馏水中，调节ph6.4～6.8，分装，0.1mpa、121℃灭菌15min。

将米曲霉za160菌株的成曲采用发酵罐进行高盐稀态发酵，盐水浓度、发酵温度及发酵周期管理按照常规方法进行。终止发酵时，氨基氮达到1.01g/100ml以上，全氮达到1.78g/100ml以上，还原糖达到12.50g/100ml以上。感官色泽红壮有光泽，酱香浓郁，口感鲜甜、醇厚绵长。

因此，在一方面，本发明提供所述米曲霉za160。

在另一方面，本发明提供所述米曲霉za160在食品发酵中的用途。在一个实施方案中，食品发酵为酱和/或酱油发酵。

在一方面，本发明提供所述米曲霉za160在制曲中的用途。在一个实施方案中，制曲获得的成曲用于制备酱和/或酱油。

在又一方面，本发明提供所述米曲霉za160在制备酱和/或酱油中的用途。

在一方面，本发明提供制备酱和/或酱油的方法，其中将所述米曲霉za160用于制备成曲。

在另一方面，本发明提供米曲霉的培养方法，其中使用所述米曲霉za160作为培养菌株。

本发明提供的米曲霉菌株za160具有生产速度快、孢子丰富、易于培养、遗传性能稳定等优点，此外，该菌株制成的成曲淀粉酶、糖化酶、蛋白酶活力高，发酵过程原料利用率高、淀粉质原料被充分降解，发酵产品糖分含量高、质量好。所述米曲霉菌株za160在酱及酱油酿造方面具有非常大的生产应用价值，应用前景广阔。

附图说明

本发明采用以下附图来举例说明本发明的有益效果。应当理解的是，这些仅用于说明本发明的具体实施方案，并不意图限制本发明的范围。

图1为本发明的米曲霉诱变、筛选以及用于酱油发酵生产工艺示意图。

图2为米曲霉za160在豆汁平板生长情况的照片。

图3为米曲霉za160和沪酿3.042分别酿造所得酱油原油的照片。

生物保藏信息

本发明的米曲霉菌株za160，分类命名为aspergillusoryzae，于2017年5月17日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏地址：广东省广州市先烈中路100号大院59号楼5楼，邮政编码：510075，保藏号为gdmccno：60186。

具体实施方式

为了促进对本发明的理解，以下将参考某些实施方式，并且将使用特定语言来描述本发明。然而，应当理解的是，这些具体实施方式不意图限制本发明的范围。所描述的实施方式中的任何改变和进一步的修改，以及本发明的任何进一步应用，均为本领域技术人员通常会想到的。

除非特别说明，否则本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备

除非特别说明，否则本发明实施例所用培养基和试验条件为本领域常规培养基和试验条件。除非特别说明，否则本发明实施例所用试剂均为市购。

下述实施例中，所述百分含量如无特别说明，均为质量百分含量。

实施例1

米曲霉菌株的诱变

将培养成熟的沪酿3.042菌株的孢子制成孢子悬液，并对孢子悬液进行紫外诱变。经过紫外诱变后的孢子悬液按照10倍梯度稀释法，用无菌生理盐水将孢子悬液稀释到10^-1、10^-2、10^-3、10^-4、10^-5、10^-6浓度，制成孢子稀释液。

取0.2ml孢子稀释液涂布于淀粉-锥虫蓝平板培养基上，30℃避光培养4d。在培养过程中观察并记录菌落的生长情况、透明圈形成的快慢、透明圈大小、测量计算圈径比。该过程共观察并记录到108个单菌落，其中菌落生长速度快、圈径比大的菌株有48株。

将上述48株菌株转接到脱脂牛奶平板培养基上，30℃培养箱培养5d。在培养过程中观察并记录菌落的生长情况、透明圈形成的快慢、透明圈大小、测量计算圈径比。该过程观察并记录到菌落生长速度快、圈径比大的菌株有9株，分别编号为za160～za168。

将上述9株菌株转接豆汁斜面培养基，30℃培养箱培养至成熟后置于4℃冰箱保藏备用。

实施例2

种曲制作

将麸皮、脱脂大豆粉、水按一定比例混合拌匀，分装三角瓶后于121℃灭菌30min，制成固体三角瓶培养基，控制该培养基的初始水分为65％。将实施例1中的9株米曲霉斜面菌种挑取1环孢子接种于三角瓶培养基中，32℃培养96h至成熟，制得三角瓶种。

将麸皮、脱脂大豆粉、水按一定比例混合拌匀，分装到种曲机曲盘后于121℃灭菌30min，制成种曲培养基，控制该培养基的初始水分为65％。按0.4％的接种量将上述三角瓶种接种于种曲培养基中，32℃培养72h，得到孢子丰富、色泽鲜绿的种曲。

检测上述所得种曲的孢子数、淀粉酶、糖化酶、中性蛋白酶活力。同时检测用同样方法制得的沪酿3.042菌株的种曲的孢子数及酶活力。

孢子数测定：参考中华人民共和国行业标准《sb/t10315-1999孢子数测定法》。

淀粉酶活力测定：参考中华人民共和国国家标准《gb/t24401-2009α-淀粉酶制剂》。

糖化酶活力测定：参考中华人民共和国国家标准《gb8276-2006食品添加剂、糖化酶制剂》。

中性蛋白酶活力测定：参考中华人民共和国国家标准《gb/t23527-2009蛋白酶制剂》。

检测结果如表1所示。

表1种曲检测结果

上述表1的结果显示，与出发菌株沪酿3.042相比，本实施例得到了孢子数多、淀粉酶、糖化酶和中性蛋白酶活性高的种曲。

实施例3

圆盘制曲机制曲

将种曲接入由黄豆、小麦按一定比例配制而成的曲料中，按常规方法采用圆盘制曲机制曲，在常规制曲生产过程中无需特别处理，即在沪酿3.042制曲生产工艺的基础上，完全正常生产，得到各个菌株的圆盘成曲。检测圆盘成曲的孢子数、淀粉酶活力、糖化酶活力及中性蛋白酶活力，检测结果见表2。

表2圆盘成曲检测结果

结果表明，米曲霉菌株za160成曲的淀粉酶活力及糖化酶活力最高，淀粉酶酶活力为967u/克干基，糖化酶酶活力为1352u/克干基，比出发菌株沪酿3.042分别提高71.4％和88.8％。

实施例4

米曲霉菌株za160的遗传稳定性

将米曲霉菌株za160在豆汁斜面培养基上连续传代7代，观察并记录各代菌株的生长情况，并将第1代、第4代和第7代斜面种按照实施例2所述的方法制成种曲。检测成曲的孢子数、淀粉酶活力、糖化酶活力及中性蛋白酶活力，判断米曲霉菌株za160的遗传稳定性，检测结果如表3所示。

表3米曲霉菌株za160遗传稳定性种曲检测结果

从上述表3所示的各代菌种制得种曲的孢子数、发芽率及酶活性检测结果来看，第1代、第4代、第7代豆汁斜面菌种所制得的种曲的各项指标均保持稳定。这表明米曲霉菌株za160的遗传稳定性好，非常适合用于工业化生产。

实施例5

米曲霉菌株za160在酱油生产中的应用

将本发明米曲霉菌株za160的成曲加入2倍的盐水进行高盐稀态发酵，发酵温度及发酵周期管理按照常规方法进行，共进行3批次的高盐稀态发酵。发酵结束压榨后所得的酱油进行氨基氮、全氮、还原糖检测，检测结果见表4。

表4米曲霉菌株za160发酵酱油指标检测

结果表明，米曲霉菌株za160发酵酱油的氨基氮达到1.01g/100ml以上，全氮达到1.78g/100ml以上，还原糖达到12.50g/100ml以上。

压榨后剩余的酱渣进行淀粉含量检测，将酱渣淀粉含量检测结果与曲料淀粉含量检测结果进行比较，结果汇总于表5。

表5米曲霉制曲、发酵后曲料、酱渣淀粉含量检测结果

结果表明，米曲霉za160制曲所得曲料在发酵阶段的淀粉利用率比米曲霉沪酿3.042提高了15.4％，淀粉质原料得到更充分降解利用。

本实施例还召集10名有丰富经验的鉴评人员进行感官鉴评。感官鉴评的评价指标包括鲜味、甜味、酸味、咸味、苦涩味和浓厚感，分值为0～4分，分数越高，该项指标越好。感官鉴评结果总结于表6中。

表6米曲霉菌株za160发酵酱油感官鉴评结果

米曲霉菌株za160发酵酱油的感官色泽红壮有光泽(酱油原油照片见图3)，酱香浓郁，口感鲜甜、醇厚绵长。

本文提供的任何和所有实施例或示例性语言的使用仅旨在更好地说明本发明，而不对本发明的范围构成限制，除非另有要求。说明书中的语言不应被解释为指示任何未要求保护的元素对于实施本发明是必要的。

本说明书中引用的所有出版物和专利申请通过引用并入本文，如同每个单独的出版物或专利申请被具体地和单独地指明通过引用并入。此外，本文所述的任何理论、机制、证明或发现旨在进一步增强对本发明的理解，并且不意图以任何方式将本发明限制到这样的理论、机制、证明或发现。尽管已经在附图和前面的描述中详细地示出和描述了本发明，但是本发明应当被认为是说明性的而不是限制性的。