琥珀酸酐类化合物、与其相关的基因和蛋白及其制备方法与流程

本申请涉及琥珀酸酐类化合物，还涉及与其相关的基因和蛋白以及其制备方法。

背景技术：

琥珀酸酐(也叫丁二酸酐)类化合物，是一种常用的化学物质，可作为食品添加剂；塑料工业用于制造玻璃纤维增强塑料。有机工业用作合成有机化合物的中间体，如聚乳酸等。琥珀酸酐类化合物的下游产品涵盖了n-羟基丁二酰亚胺、丁二酸单乙酯酰氯、红霉素琥珀酸乙酯、芬布芬、青蒿琥酯、恶丙嗪、曲匹布通等重要产品；同时，琥珀酸酐能与其他化合物组装，提升药物的活性等，表明琥珀酸酐类化合物为重要产品的合成前体和原料。

因此开发新型的琥珀酸酐类衍生物为发现新型材料和医药农药等重要产品提供新型的原材料。

技术实现要素：

本申请之一提供了一种琥珀酸酐类化合物，其分子式如结构式i所示：

本申请之二提供了如本申请之一所述的琥珀酸酐类化合物在制备n-羟基丁二酰亚胺、丁二酸单乙酯酰氯、红霉素琥珀酸乙酯、芬布芬、青蒿琥酯、恶丙嗪和曲匹布通中的至少一种中作为前体，用于制造玻璃纤维增强塑料，作为食品添加剂，以及提高药物活性中的应用。

本申请之三提供了一种制备如本申请之一所述的琥珀酸酐类化合物的方法，所述方法包括发酵含有编i型pks/nrps酶的基因，以及含有编码er酶的基因的异源生物，得到发酵液；通过在异源生物中表达i型pks/nrps酶和er酶来合成如本申请之一所述的琥珀酸酐类化合物；其中，所述i型pks/nrps酶具有如下(i)或(ii)的氨基酸序列：(i)来源于嗜热属(thermomyces)的i型pks/nrps酶的氨基酸序列，优选地，如seqidno.1所示的氨基酸序列；(ii)与(i)中的氨基酸序列的一致性在95％以上，且与(i)中的氨基酸序列具有相同功能的氨基酸序列；优选其氨基酸序列为与(i)中的氨基酸序列的一致性在99％以上，且与(i)中的氨基酸序列具有相同功能的氨基酸序列；所述er酶具有如下(iii)或(iv)的氨基酸序列：(iii)来源于嗜热属(thermomyces)的er酶的氨基酸序列，优选地，如seqidno.2所示的氨基酸序列；(iv)与(iii)中的氨基酸序列的一致性在95％以上，且与(iii)中的氨基酸序列具有相同功能的氨基酸序列；优选其氨基酸序列为与(iii)中的氨基酸序列的一致性在99％以上，且与(iii)中的氨基酸序列具有相同功能的氨基酸序列。其中所述的异源生物的表述是相对于i型pks/nrps酶或er酶的来源生物而言的。如seqidno.1所示的氨基酸序列和如seqidno.2所示的氨基酸序列来源于嗜热踝节菌thermomycesdupontii(talaromycesthermophilusnrrl2155,该菌株保存时该菌株名为talaromycesthermophilus,2014年后国际真菌分类学将此菌株改为thermomycesdupontii，见文献thermophilicfungiinthenewageoffungaltaxonomy,extremophiles,doi:10.1007/s00792-014-0707-0,https://www.researchgate.net/publication/268392182)，而表达这两个基因的生物可以是异源生物酵母。

在一个具体实施方式中，编码所述i型pks/nrps酶的基因连接在能够用于所述异源生物的第一表达载体上；编码所述er酶的基因连接在能够用于所述异源生物的第二表达载体上；所述第一表达载体与所述第二表达载体不相同。

在一个具体实施方式中，所述第一表达载体在连接上所述i型pks/nrps酶的基因之前选自pgadt7或pgbkt7。

在一个具体实施方式中，所述第二表达载体在连接上所述er酶的基因之前选自pgadt7或pgbkt7。

在一个具体实施方式中，编码所述i型pks/nrps酶的基因具有如seqidno.3所示的核苷酸序列；和/或编码所述er酶的基因具有如seqidno.4所示的核苷酸序列。i型pks/nrps基因由如下方法得到：通过柱式法提取t.dupontiinrrl2155基因组，操作方法按照天根植物提取试剂盒使用说明。将pks/nrps基因分为三段(每段约4000bp)，设计引物进行pcr，通过酵母同源重组的方法连在捕获质粒prs426上，得到含有目的基因的载体prs426-talth1_004980-t1，通过测序确证目的基因正确无突变；或者也可以分段人工合成得到。er基因如下方法得到：通过柱式法提取t.dupontiinrrl2155基因组，操作方法按照天根植物提取试剂盒使用说明。设计引物进行pcr并纯化片段进行测序，通过测序确证目的基因正确无突变；或者也可以人工合成得到。

在一个具体实施方式中，所述异源生物为酵母菌(saccharomyces)；优选地，所述异源生物为酿酒酵母(saccharomycescerevisiae)。例如，酿酒酵母fy834菌株。

在一个具体实施方式中，所述方法包括如下步骤：

1)将所述i型pks/nrps酶的基因连接到pgadt7载体上，得到第一表达载体；

2)将所述er酶的基因连接到pgbkt7上，得到第二表达载体：

3)将所述第一表达载体和第二表达载体共同转化至酿酒酵母中，获得工程菌株

4)将所述工程菌株接种至培养酿酒酵母的液体培养基(例如，酿酒酵母fy834菌株使用的氨基酸缺陷型液体培养基sd/-leu/-trp)中，在30±2℃200±50rpm培养10-14小时(例如12小时)；按照2％-10％的接种率扩大培养，在30±2℃200±50rpm的条件下发酵4-6天，得到发酵液。

在一个具体实施方式中，所述方法还包括从发酵液中分离提纯得到本申请之一所述的琥珀酸酐类化合物。

在一个具体实施方式中，分离提纯的步骤如下：

a)将所述发酵液浓缩，得到浓缩物；

b)将所述浓缩物与丙酮水溶液混合并进行超声处理，减压浓缩后得到粗提物；

c)所述粗提物与丙酮混合并进行超声处理，减压浓缩后得到褐色的油状丙酮提取浸膏；

d)所述丙酮提取浸膏用凝胶柱色谱分离，过程中的流出液最多每7ml更换一次接样瓶，将接样瓶中组分相同的流出液样品混合，得到凝胶柱色谱分离液；然后对所述凝胶柱色谱分离液进行柱层析，过程中的流出液最多每7ml更换一次接样瓶，将接样瓶中组分相同的流出液样品混合，得到柱层析分离液；然后对所述柱层析分离液进行硅胶柱层析分离，得到橘色粉末状化合物，所述橘色粉末状化合物即为如本申请之一所述的琥珀酸酐类化合物；

在一个具体实施方式中，分离提纯的步骤如下：

a)将所述发酵液旋转蒸发浓缩，得到浓缩物；

b)将所述浓缩物与65-75％的丙酮水溶液混合并在80-120khz下超声处理2-5次，每次10-30min，减压浓缩后得到粗提物；

c)所述粗提物与丙酮混合并在80-120khz下超声处理2-5次，每次30-80min超声处理，减压浓缩后得到褐色的油状丙酮提取浸膏；

d)所述丙酮提取浸膏在流动性为甲醇的条件下进行sephadexlh-20凝胶柱色谱分离，过程中的流出液最多每5ml更换一次接样瓶，将接样瓶中tlc检测rf值为0.35-0.45的流出液样品混合，得到凝胶柱分离液；然后在流动性为5％-15％甲醇水溶液的条件下对所述凝胶柱分离液进行中压rp18柱层析，过程中的流出液最多每5ml更换一次接样瓶，将接样瓶中tlc检测rf值为0.35-0.45的流出液样品混合，得到柱层析分离液，接着对所述柱层析分离液在以体积比为11-9:1的氯仿和丙酮的混合液作为流动性的条件下进行硅胶柱层析分离，得到橘色粉末状化合物，所述橘色粉末状化合物即为如本申请之一所述的琥珀酸酐类化合物。

在一个具体实施方式中，分离提纯的步骤如下：

a)将所述发酵液旋转蒸发浓缩，得到浓缩物；

b)将所述浓缩物与65-75％的丙酮水溶液混合并在80-120khz下超声处理2-3次，每次15-25min，减压浓缩后得到粗提物；

c)所述粗提物与丙酮(100％的纯丙酮)混合并在80-120khz下超声处理2-3次，每次55-70min超声处理，减压浓缩后得到褐色的油状丙酮提取浸膏；

d)所述丙酮提取浸膏在流动性为甲醇的条件下进行sephadexlh-20凝胶柱色谱分离，过程中的流出液每4ml至5ml更换一次接样瓶，将接样瓶中tlc检测rf值为0.35-0.45的流出液样品混合，得到凝胶柱分离液，然后在流动性为5％-15％甲醇水溶液的条件下对所述凝胶柱分离液进行中压rp18柱层析，过程中的流出液每4ml至5ml更换一次接样瓶，将接样瓶中tlc检测rf值为0.35-0.45的流出液样品混合，得到柱层析分离液，接着对所述柱层析分离液在以体积比为11-9:1的氯仿和丙酮的混合液作为流动性的条件下进行硅胶柱层析分离，得到橘色粉末状化合物，所述橘色粉末状化合物即为如本申请之一所述的琥珀酸酐类化合物。

在一个具体实施方式中，tlc展开体系为氯仿：丙酮9:1。

本申请之四提供了一种er酶，所述er酶具有如下(iii)或(iv)的氨基酸序列：

(iii)来源于嗜热属(thermomyces)的er酶的氨基酸序列，优选地，如seqidno.2所示的氨基酸序列；

(iv)与(iii)中的氨基酸序列的一致性在98％以上，且与(iii)中的氨基酸序列具有相同功能的氨基酸序列；优选其氨基酸序列为与(iii)中的氨基酸序列的一致性在99.5％以上，且与(iii)中的氨基酸序列具有相同功能的氨基酸序列。

本申请之五提供了一种能够编码如本申请之四所述的er酶的基因。

在一个具体实施方式中，优选所述基因具有如seqidno.4所示的核苷酸序列。

本申请之六提供了根据本申请之四所述的er酶，或本申请之五所述的基因在制备如本申请之一所述的琥珀酸酐类化合物中的应用。

本申请的有益效果：

现有技术认为er酶参与pks聚酮类化合物生物合成，而没有其参与琥珀酸酐类化合物的生物合成的报道。

本申请首次发现了通过将来源于嗜热属菌的i型pks/nrps酶和er酶在酵母中进行共同异源表达，可以得到含有氨基的新型琥珀酸酐类化合物。首次发现i型pks/nrps和er基因参与产生含有伯氨的琥珀酸酐类化合物的新功能，以及琥珀酸酐类化合物可以通过在酵母异源表达高温真菌中的i型pks/nrps酶和er酶来合成制备的新方法。该生物合成制备方法具有污染小、安全可靠以及发酵周期短等方面的优点。

附图说明

图1为pks/nrps(talth1_004980-t1)3段基因pcr琼脂糖凝胶电泳图，其中泳道m为dl5000dnamarker，泳道1、2和3分别为3段基因(每段约4000bp)。

图2为以prs426-talth1_004980-t1扩增talth1_004980-t1的pcr琼脂糖凝胶电泳图，其中泳道为dl15000dnamarker，泳道1为目的条带(11844bp)。

图3为er(talth1_004946_t1)的pcr琼脂糖凝胶电泳图，其中泳道为dl2000dnamarker，泳道1为目的条带(1230bp)。

图4为pgadt7-talth1_004980-t1表达载体图谱。

图5为pgbkt7-talth1_004946_t1表达载体图谱。

具体实施方式

以下为结合具体实例对本申请进行进一步描述，但本申请的保护范围并不仅限于此。

在没有特别说明的情况下，本申请中使用的试剂和原料均可以市售获得，或者通过常规配制得到。

pdb培养基配方：将200g马铃薯用水煮沸30min后，取上清加入20g无水葡萄糖定容至1l，121℃灭菌20min。

氨基酸缺陷型固体及液体培养基sd/-leu/-trp来源：购自takara公司。

pgadt7质粒载体来源：购自takara公司。

pgbkt7质粒载体来源：购自takara公司。

实施例1t.dupontiinrrl2155pks/nrps基因的获得

采用柱式法提取t.dupontiinrrl2155(菌种由云南省生物资源保护与利用国家重点实验室提供)基因组，将t.dupontiinrrl2155于pdb培养基中45℃培养7天，过滤收集菌丝，加入液氮充分研磨至菌体呈粉末状；基因组的提取方法参照天根植物基因组提取试剂盒说明书。将编码总长为11844bp的pks/nrps基因talth1_004980-t1(如seqidno.3所示，其编码如seqidno.1所示的氨基酸序列)分为3段(每段约4000bp)设计引物进行pcr，其中第一对引物为pks/nrps-f1(如seqidno.5所示)和pks/nrps-r1(如seqidno.6所示)，第二对引物为pks/nrps-f2(如seqidno.7所示)和pks/nrps-r2(如seqidno.8所示)，第三对引物为pks/nrps-f3(如seqidno.9所示)和pks/nrps-r3(如seqidno.10所示)。pcr体系为50μl：5×primestargxlbuffer10μl，dntpmixture(各2.5mm)4μl，primerf1μl，primerr1μl，模板1μl，primestargxldnapolymerase1μl，ddh2o32μl。pcr仪为eppendorf生产，pcr反应温度为：98℃2min，98℃10sec，55℃15sec，68℃4min共计35个循环，68℃5min。pcr产物分别％的琼脂糖凝胶电泳，可见3个约4000bp的pcr产物(见图1)。最后通过酵母的同源重组将3个片段依次连接到质粒prs426上，得到含有完整目的片段的prs426-talth1_004980-t1质粒。

实施例2构建表达载体pgadt7-talth1_004980-t1与pgbkt7-talth1_004946_t1

根据实施例1的测序结果设计构建talth1_004980-t1基因表达载体的引物分别为p1-f(如seqidno.11所示)和引物p1-r(如seqidno.12所示)。

以t.dupontiinrrl2155基因组为模板，设计构建talth1_004946_t1表达载体的引物分别为p2-f(如seqidno.13所示)p2-r(如seqidno.14所示)。

利用长片段高保真酶primestargxl进行扩增，pcr体系为(50μl)：1.talth1_004980-t1：5×primestargxlbuffer10μl，dntpmixture(各2.5mm)4μl，primerf0.5μl，primerr0.5μl，模板0.5μl，primestargxldnapolymerase2μl，ddh2o32.5μl；2.talth1_004946_t1：5×primestargxlbuffer10μl，dntpmixture(各2.5mm)4μl，primerf1μl，primerr1μl，模板1μl，primestargxldnapolymerase1μl，ddh2o32μl。pcr反应温度为：1.talth1_004980-t1：98℃2min，98℃10sec，55℃15sec，68℃3min共计35个循环，68℃10min；2.talth1_004946_t1：98℃2min，98℃10sec，55℃15sec，68℃1min共计35个循环，68℃5min。

pcr产物分别％的琼脂糖凝胶电泳可见talth1_004980-t1条带在11844bp位置(如图2)，talth1_004946_t1条带在1230bp位置(如图3)。将两个目的片段纯化后，通过takara的infusion酶分别与经过ecori和bamhi双酶切的酵母表达载体pgadt7、pgbkt7相连，构建表达载体pgadt7-talth1_004980-t1与pgbkt7-talth1_004946_t1。并测序检测基因序列的正确性。

实施例3构建工程菌株fy834/pgadt7-talth1_004980-t1/pgbkt7-talth1_004946_t1

将施实例2中构建的两个表达质粒pgadt7-talth1_004980-t1与pgbkt7-talth1_004946_t1共同转化到酿酒酵母fy834中，涂布于氨基酸缺陷型固体培养基sd/-leu/-trp上，30℃倒置培养2-4天。随机挑去转化子于5ml液体sd/-leu/-trp培养基中扩大培养并提取质粒进行pcr验证，并选取pcr验证为阳性的转化子进行测序验证。结果表明，表达载体pgadt7-talth1_004980-t1与pgbkt7-talth1_004946_t1成功转化至酿酒酵母fy834中。

实施例4工程菌株fy834/pgadt7-talth1_004980-t1/pgbkt7-talth1_004946_t1的表达

将实施例3构建的工程菌株fy834/pgadt7-talth1_004980-t1/pgbkt7-talth1_004946_t1接种至5ml液体sd/-leu/-trp培养基中，30℃200rpm过夜培养；按照5％的接种率扩大培养，30℃200rpm发酵5天。

实施例5琥珀酸酐含氨基衍生物化合物的提取分离应用

以实施例4发酵液为样品组，转化了空载质粒pgadt7和pgbkt7的fy834菌株为对照，对照组与样品组选用相同培养以及相同的处理方法。将发酵液用旋转蒸发仪浓缩，浓缩产物用70％丙酮/水室温100khz超声提取2次，每次20min，减压浓缩得70％丙酮/水粗提物；粗提物用纯丙酮100khz超声提取两次，每次60min，减压浓缩得到褐色油状丙酮提取物浸膏；将样品组与对照组用tlc检测，10％的浓硫酸乙醇溶液进行显色，在样品组中得到一个与对照组存在差异的粉色点。丙酮提取物浸膏经凝胶柱色谱(sephadexlh-20，甲醇为流动相冲洗)，每5ml流出液更换一次接样瓶，并用tlc检测流出液成分，将组分相同的样品进行合并；随后通过中压rp18柱层析(5％-15％甲醇/水为流动相梯度洗脱)，tlc检测流出液成分，合并相同组分；之后合并组份利用硅胶柱层析(氯仿-丙酮10:1)为流动相，得到粉末状化合物。经过对一位核磁共振谱、二维核磁共振谱以及质谱的分析，鉴定化合物为一个新型的琥珀酸酐含氨基衍生物，结构如下：

本申请的琥珀酸酐含氨基衍生物的理化性质：

物化特征为：

外观：无色油脂状物质。

溶解性：溶于氯仿、丙酮、二甲亚砜等，不溶于己烷和水等。

新化合物琥珀酸酐含氨基衍生物的分子式为：c7h11no3，分子量为157；高分辨正离子esi-ms质谱：实测值为158.0817[m+h]⁺,计算值为158.0821(forc7h12no3)。氢谱和碳谱数据(其溶解溶剂为cd3cocd3，400mhz，δ：ppm)：碳谱为：175.4(s,c-1),76.9(s,c-2),40.6(t,c-3),172.0(s,c-4),35.2(d,c-5),16.5(q,c-6),15.7(q,c-7)；氢谱为2.90和2.73(3-h2,d,19.2hz),1.96(h-5,m),0.99(7-h3,d,7.1hz),0.91(6-h3,d,7.1hz)。

序列表

<110>云南大学

<120>琥珀酸酐类化合物、与其相关的基因和蛋白及其制备方法

<130>lha1760721

<160>14

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>3947

<212>prt

<213>嗜热踝节菌(thermomycesdupontii)

<400>1

metalaserlysvalargprogluproilevalileileglythrgly

151015

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202530

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