一种比率型氧传感探针及其制备方法和应用与流程

本发明属于纳米医用材料领域，涉及一种比率型氧传感探针及其制备方法和应用，尤其涉及一种细胞外比率型氧传感探针及其制备方法和应用。

背景技术：

氧气在环境保护、工程工艺、海洋水产、工业和农业等领域都是非常重要的元素或者参数之一，尤其是在生物领域中，氧气是细胞新陈代谢的重要原料之一，更是维持生命活动的能量之源。随着科学研究的不断发展，氧气浓度对于细胞的影响逐渐被我们认识。尽管氧气对于细胞的新陈代谢是必不可少的，但是氧气浓度的升高也会产生一定的毒性。在高浓度氧气环境下，需氧和微量需氧的细胞或者组织会启动自身的保护机制来应对当下的不正常环境。被称为活性氧物质的超氧化物(o2^-)和过氧化氢(h2o2)将会成为细胞新陈代谢的副产物在细胞内不断的积累，因为这些活性氧物质比正常的氧分子更为活泼，最终氧化细胞内大分子进而使细胞凋亡。同样地，如果细胞内的氧浓度低于正常值，将会导致需氧和微量需氧的细胞或者组织缺血性损伤甚至细胞死亡。细胞缺氧也会导致出现各种各样的疾病，例如慢性血管疾病、神经障碍、肺病甚至癌症等等。因此，能够准确而精确的测量细胞内的含氧量对于理解细胞的生物学活力、研究各种疾病的病理学以及诊断和治疗癌症有重大意义。众所周知，细胞呼吸是发生在生物器官和组织内一系列的新陈代谢反应和过程，细胞以此来获得三磷酸腺苷(atp)等能量并排出如二氧化碳等废弃物。尽管检测细胞内的氧含量已经被报道，但是仍旧不能忽视细胞外氧含量的检测，许多生物代谢的过程依然要通过检测细胞外氧含量来研究。在细胞新陈代谢反应过程中，线粒体是支撑需氧呼吸并获得atp的关键性细胞器。然而，细胞呼吸并不是都依靠线粒体，还有一种呼吸类型并不需要线粒体，这种呼吸类型被称为非线粒体氧消耗(non-mitochondrialoxygenconsumption)。而研究非线粒体氧消耗的特征，则需要通过测量细胞外的氧消耗情况。因此，能够准确而精确测量细胞在呼吸过程中的氧气消耗情况对于评估有氧糖酵解率、氧化磷酸化作用和高通量的药物筛选等是非常重要的。

对于光学荧光传感器来说，荧光量子效率高低是衡量传感器优劣的重要标准之一。虽然相对于其他氧传感器如有机染料和芳香环类等，金属卟啉类的氧传感器室温下荧光量子效率要高一些，然而一些金属卟啉类光学氧传感器如粪铂卟啉酮(ptcpk)、粪铂卟啉(ptcp)、粪钯卟啉酮(pdcpk)、中-四(4-羧基苯基)铂卟啉(pttcpp)等，其荧光量子效率的范围仍旧低至0.001到0.0095，仍不能满足人们在实际应用过程中的需求。为了提高传感器的荧光量子效率并赋予其更多的特点，科研工作者们做出了很多努力。vinogradov等设计了树枝状大分子的壳核结构，其内核为疏水环境，可以把传感器包埋在内，以避免传感器在检测时泄露出来，另一方面也可以让氧气容易扩散到壳内并被激发。而树枝状大分子的外壳则连接聚乙二醇等高分子链确保其能够在水中良好的分散，并且阻止内部的探针分子与生物环境之间的相互作用。铂卟啉被包埋在树枝状大分子结构内后，其荧光量子效率达到了0.017到0.073，有效地提高了传感器的荧光量子效率。另外，yanqingtian等设计了一种纳米级的胶束粒子来包覆铂卟啉，其包覆原理与树枝状大分子包埋铂卟啉相同。这种胶束纳米粒子由聚己内酯和聚乙二醇(pcl-b-peg)无定形态的嵌段共聚物组成，是一端为亲水端一端为疏水端的双亲高分子在水中自组装而形成。经过测量，该纳米胶束氧传感器的荧光量子效率达到了0.107-0.111。此外，用胶束包覆氧传感器不仅可以提高其荧光量子效率，而且其光学稳定性也得到进一步提升。

另一方面，具有大的π共轭体系的共聚高分子(conjugatedpolymer,cp)作为一种新的半导体材料和新的研究领域，广泛应用于电子和光子材料，器件应用等方面，并且其稳定的化学物理性质和高的荧光量子效率等特点也受到众多科研工作者的青睐。同时，其无毒、易于小型化等特点更是进一步代替量子点应用于化学传感体系中，尤其在生物领域更为多见。

基于氧传感探针的优势，本领域期望开发更多高荧光效率的氧传感探针材料。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供一种比率型氧传感探针及其制备方法和应用，特别是提供一种细胞外比率型氧传感探针及其制备方法和应用。

为达到此发明目的，本发明采用以下技术方案：

一方面，本发明提供一种比率型氧传感探针，所述比率型氧传感探针包括连接有氧敏感基团的两亲性接枝聚合物和参比探针成分，所述参比探针成分包括参比探针材料分子和/或连接在所述两亲性接枝聚合物上的参比探针基团。

本发明的比率型氧传感探针具有良好氧气敏感特性，具有高的荧光效率，并且将氧传感探针连接在以共价键聚合在高分子中，结构稳定，提高应用效率。

优选地，所述参比探针材料分子为聚集诱导发光材料或具有π共轭体系的共聚高分子中的任意一种或至少两种的组合。

优选地，所述具有π共轭体系的共聚高分子为具有如下所示的结构聚合物中的任意一种或至少两种的组合：

其中r11和r12独立地为取代或未取代的烷基，g为3-200的整数，例如3、5、8、10、15、20、35、50、75、90、100、120、150、180、200、220、240、260、280或300等。

在式i中，所述取代或未取代的烷基为碳原子数为1-10(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9或10)的取代或未取代的烷基，优选正己基。

优选地，所述聚集诱导发光材料为

中的任意一种或至少两种的组合，其中r3、r7、r8、r9和r10独立地选自c1-c8的直链烷基或支链烷基，优选甲基、乙基或丙基，x为cl或br。

优选地，所述参比探针基团为

中的任意一种，其中r7、r8、r9和r10独立地选自c1-c8的直链烷基或支链烷基，优选甲基、乙基或丙基，x为cl或br。

优选地，所述连接有氧敏感基团的两亲性接枝聚合物具有如下式i所示结构：

在式i中，r1、r3、r5和r6独立地为h、c1-c8的烷基或-r-cn，r为c1-c5的亚烷基或不存在；r2为疏水聚合物基团；r4为亲水基团；a为氧敏感基团，n、m、k独立地为大于零的数，l为大于等于零的数。

在式i所示两亲性接枝聚合物中，所述c1-c8的烷基可以为c1、c2、c3、c4、c5、c6、c7或c8烷基，优选甲基或乙基。

优选地，在式i中，r2为中的任意一种，其中r13为h、取代的或未取代的c1-c12的直链烷基或取代的或未取代的c1-c12的支链烷基；q为1-300的整数；例如q可以为2、5、8、10、12、15、18、20、23、25、28、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、130、150、180、200、230、250、280或300。

如上所述取代的或未取代的c1-c12的直链烷基可以是取代的或未取代的c1、c2、c3、c4、c5、c6、c7、c8、c9、c10、c11或c12的直链烷基，例如甲基、乙基或丙基等。

如上所述取代的或未取代的c1-c12的支链烷基可以是取代的或未取代的c1、c2、c3、c4、c5、c6、c7、c8、c9、c10、c11或c12的直链烷基，例如异丙基、异丁基或异戊基等。

优选地，在式i中，r4为中的任意一种，q为1-100的整数，例如1、3、5、7、9、12、15、18、20、22、25、28、30、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95或100，以及3.5、5.5、7.5、10.5、13.5、11.5、20.5、30.5、40.5等小数值。其中在中表示基团的连接位点，*端代表聚合物的延伸端，并不表示基团的连接位点。

优选地，在式i中，所述a为

优选地，所述连接有氧敏感基团的两亲性接枝聚合物为具有以下式a所示结构的聚合物：

其中，n、m、k独立地为大于零的数，l为大于等于零的数。

优选地，连接有参比探针基团的所述两亲性接枝聚合物具有如下式ii所示结构：

在式ii中，r1、r3、r5和r6独立地为h、c1-c8的烷基或-r-cn，r为c1-c5的亚烷基或不存在；r2为疏水聚合物基团；r4为亲水基团；a为氧敏感基团，b为参比探针基团；n、m、k独立地为大于零的数，l为大于等于零的数。

在式ii所示两亲性接枝聚合物中，所述c1-c8的烷基可以为c1、c2、c3、c4、c5、c6、c7或c8烷基，优选甲基或乙基。

优选地，在式ii中，r2为其中n1为10-300的整数，例如n1可以为10、12、15、18、20、23、25、28、30、35、40、45、50、55、60、70、80、90、100、130、150、180、200、230、250、280或300；或者式iii中r2为其中n2为10-300的整数，例如n2可以为10、12、15、18、20、23、25、28、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、130、150、180、200、230、250、280或300。

优选地，在式ii中，r4为中的任意一种，q为1-100的整数，例如1、3、5、7、9、12、15、18、20、22、25、28、30、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95或100，以及3.5、5.5、7.5、10.5、13.5、11.5、20.5、30.5、40.5等小数值。其中在中表示基团的连接位点，*端代表聚合物的延伸端，并不表示基团的连接位点。

优选地，在式ii中，所述a为

优选地，在式ii中，所述b为中的任意一种，其中r7、r8、r9和r10独立地选自c1-c8的直链烷基或支链烷基，优选甲基、乙基或丙基，x为cl或br。

优选地，所述连接有参比探针基团的所述两亲性接枝聚合物具有如下式b所示结构的聚合物：

其中b为n、m、k独立地为大于零的数，l为大于等于零的数。

在本发明所述式i和式ii中，所述a基团即氧敏感基团来源于氧探针单体，其作为本发明的比率型氧传感探针中的氧敏感基团，具有良好的氧敏感响应性。在本发明所述式ii中，所述b基团来源于参比探针材料单体，该基团连接于两亲性接枝聚合物上，作为参比探针成分，以获得比率型氧传感探针，提高分析测量准确性。

在本发明中，所述具有π共轭体系的共聚高分子作为参比探针，使得本发明能够获得比率型氧传感探针，提高分析测量准确性。

作为本发明的优选技术方案，本发明所述比率型氧传感探针包括式i所示结构的连接有氧敏感基团的两亲性接枝聚合物，以及作为参比探针成分的具有π共轭体系的共聚高分子。

优选地，所述比率型氧传感探针为通过自组装形成的纳米级探针。

另一方面，本发明提供了如上所述的比率型氧传感探针的制备方法，所述制备方法为：制备连接有氧敏感基团以及任选的连接有参比探针基团的两亲性接枝聚合物，利用所述两亲性接枝聚合物与任选的参比探针材料分子进行自组装得到所述比率型氧传感探针。

优选地，所述制备方法为：制备连接有氧敏感基团以及任选的连接有参比探针基团的两亲性接枝聚合物，利用所述两亲性接枝聚合物与具有π共轭体系的共聚高分子进行自组装得到所述比率型氧传感探针。

优选地，所述连接有氧敏感基团的两亲性接枝聚合物为具有如式i所示结构的聚合物，所述式i所示结构的聚合物的制备方法为：

式iv所示疏水聚合物单体、式v所示亲水聚合物单体、式vi所示烯酸单体以及式vii所示连接有氧敏感基团的单体发生聚合反应得到式i所示聚合物，反应式如下：

其中，r1、r3、r5和r6独立地为h、c1-c8的烷基或-r-cn，r为c1-c5的亚烷基或不存在；r2为疏水聚合物基团；r4为亲水基团；a为氧敏感基团，n、m、k独立地为大于零的数，l为大于等于零的数。

优选地，所述式iv所示疏水聚合物单体为

中的任意一种，其中r13为h、取代的或未取代的c1-c12的直链烷基或取代的或未取代的c1-c12的支链烷基；q为1-300的整数；例如q可以为2、5、8、10、12、15、18、20、23、25、28、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、130、150、180、200、230、250、280或300。

在本发明中，这些疏水聚合物单体可以购买获得也可以自行制备获得。

如上所述取代的或未取代的c1-c12的直链烷基可以是取代的或未取代的c1、c2、c3、c4、c5、c6、c7、c8、c9、c10、c11或c12的直链烷基，例如甲基、乙基或丙基等。

如上所述取代的或未取代的c1-c12的支链烷基可以是取代的或未取代的c1、c2、c3、c4、c5、c6、c7、c8、c9、c10、c11或c12的直链烷基，例如异丙基、异丁基或异戊基等。

优选地，所述式v所示亲水聚合物单体为中的任意一种，q为1-100的整数，例如1、3、5、7、9、12、15、18、20、22、25、28、30、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95或100，以及3.5、5.5、7.5、10.5、13.5、11.5、20.5、30.5、40.5等小数值。其中*端代表聚合物的延伸端，并不表示基团的连接位点。

在本发明中，这些亲水聚合物单体可以购买获得也可以自行制备获得。

优选地，所述式vi所示烯酸单体为甲基丙烯酸、乙基丙烯酸、丙基丙烯酸等，优选甲基丙烯酸。

优选地，所述式vii所示连接有氧敏感基团的单体为

优选地，所述式iv所示疏水聚合物单体、式v所示亲水聚合物单体、式vi所示烯酸单体以及式vii所示连接有氧敏感基团的单体的摩尔比为(1-10):(100-500):(10-100):(0.1-1)，即在该摩尔比中，所述式iv所示疏水聚合物单体的摩尔比例份数为1-10，例如1、1.5、2、2.5、3、3.6、4、4.8、5、5.4、6、6.5、7、7.3、8、8.5、9、9.6或10等；式v所示亲水聚合物单体的摩尔比例份数为100-500，例如100、120、130、150、180、200、230、250、280、300、350、380、400、430、460、490或500等；式vi所示烯酸单体的摩尔比例份数为10-100，例如10、13、15、18、24、28、30、35、37、40、50、60、70、80、90或100等；式vii所示连接有氧敏感基团的单体摩尔比例份数为0.1-1，例如0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9或1等。

优选地，在式i所示结构的聚合物的制备中，所述聚合反应的温度为60-90℃，例如60℃、63℃、65℃、68℃、70℃、73℃、75℃、78℃、80℃、83℃、85℃、88℃或90℃。

优选地，在式i所示结构的聚合物的制备中，所述聚合反应的时间为5-48小时，例如5小时、8小时、10小时、12小时、14小时、16小时、18小时、20小时、22小时、24小时、26小时、28小时、30小时、33小时、36小时、38小时、40小时、44小时或48小时。

优选地，在式i所示结构的聚合物的制备中，所述聚合反应在保护性气体保护下进行，所述保护性气体优选氮气。

优选地，在式i所示结构的聚合物的制备中，所述聚合反应在有机溶剂中进行，所述有机溶剂优选n,n-二甲基甲酰胺(dmf)。

优选地，所述连接有参比探针基团的所述两亲性接枝聚合物为具有式ii所示结构的聚合物，所述式ii所示结构的聚合物的制备方法为：

其中，r1、r3、r5和r6独立地为h、c1-c8的烷基或-r-cn，r为c1-c5的亚烷基或不存在；r2为疏水聚合物基团；r4为亲水基团；a为氧敏感基团，n、m、k独立地为大于零的数，l为大于等于零的数。

优选地，所述式iv'所示疏水聚合物单体为其中r1为h、c1-c8的烷基或-r-cn，r为c1-c5的亚烷基或不存在，n1为10-300的整数，例如n1可以为10、12、15、18、20、23、25、28、30、35、40、45、50、55、60、70、80、90、100、130、150、180、200、230、250、280或300；n2为10-300的整数，例如n2可以为10、12、15、18、20、23、25、28、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、130、150、180、200、230、250、280或300。

在本发明中式ii所示结构的聚合物的制备过程中使用的式v所示亲水聚合物单体、式vi所示烯酸单体以及式vii所示连接有氧敏感基团的单体的限定均与如上所述式i所示结构聚合物制备时使用的单体相同，为了简要起见，在此不再赘述。

优选地，所述式iv'所示疏水聚合物单体、式v所示亲水聚合物单体、式vi所示烯酸单体以及式vii所示连接有氧敏感基团的单体的摩尔比为(1-10):(100-500):(10-100):(0.1-1)，即在该摩尔比中，所述式iv'所示疏水聚合物单体的摩尔比例份数为1-10，例如1、1.5、2、2.5、3、3.6、4、4.8、5、5.4、6、6.5、7、7.3、8、8.5、9、9.6或10等；式v所示亲水聚合物单体的摩尔比例份数为100-500，例如100、120、130、150、180、200、230、250、280、300、350、380、400、430、460、490或500等；式vi所示烯酸单体的摩尔比例份数为10-100，例如10、13、15、18、24、28、30、35、37、40、50、60、70、80、90或100等；式vii所示连接有氧敏感基团的单体摩尔比例份数为0.1-1，例如0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9或1等。

优选地，在式ii所示结构的聚合物的制备中，所述聚合反应的温度为60-90℃，例如60℃、63℃、65℃、68℃、70℃、73℃、75℃、78℃、80℃、83℃、85℃、88℃或90℃。

优选地，在式ii所示结构的聚合物的制备中，所述聚合反应的时间为5-48小时，例如5小时、8小时、10小时、12小时、14小时、16小时、18小时、20小时、22小时、24小时、26小时、28小时、30小时、33小时、36小时、38小时、40小时、44小时或48小时。

优选地，在式ii所示结构的聚合物的制备中，所述聚合反应在保护性气体保护下进行，所述保护性气体优选氮气。

优选地，在式ii所示结构的聚合物的制备中，所述聚合反应在有机溶剂中进行，所述有机溶剂优选n,n-二甲基甲酰胺(dmf)。

在本发明中，所述自组装为将连接有氧敏感基团以及任选的连接有参比探针基团的两亲性接枝聚合物与任选的参比探针材料分子溶于有机溶剂中，得到溶液，而后将该溶液加入去离子水中，透析，得到所述比率型氧传感探针。

优选地，所述有机溶剂为四氢呋喃(thf)、n,n-二甲基甲酰胺(dmf)或二甲基亚砜(dmso)中的任意一种或至少两种的组合，优选四氢呋喃。

优选地，所述有机溶剂与去离子水的体积比为1:5-1:50，例如1:5、1:5.5、1:6、1:6.5、1:7、1:7.5、1:8、1:8.5、1:9、1:9.5、1:10、1:20、1:25、1:30、1:35、1:40、1:45或1:50。在该比例范围内，能够保证具有较好的自组装动力，能够保证形成稳定的纳米体系，而不发生胶束颗粒之间的过度聚集而导致产生沉淀。

在本发明中，n、m、k独立地为大于零的数，例如可以为1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、35、40、50、60、70、80、100、120、150、180、200等整数，也可以为0.5、0.8、1.3、1.7、2.4、2.8、3.5、5.5、8.1、9.5、13.7、15.8、30.4等小数，l为大于等于零的数，例如可以为1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、35、40、50、60、70、80、100、120、150、180、200等整数，也可以为0.5、0.8、1.3、1.7、2.4、2.8、3.5、5.5、8.1、9.5、13.7、15.8、30.4等小数。

另一方面，本发明提供了如上所述的比率型氧传感探针在水溶氧实时监测中的应用。

另一方面，本发明提供了如上所述的比率型氧传感探针在细胞生长监测中的应用。

另一方面，本发明提供了如上所述的比率型氧传感探针在药物筛选中的应用。

本发明通过高分子设计，获得优良的细胞外比率型氧传感探针，具有制备过程简单，无毒性，高量子效率，可溶于水，灵敏度高，响应速度快等优点，广泛适用于水溶氧监测，细菌、细胞生长实时监测及生物成像领域。

相对于现有技术，本发明具有以下有益效果：

本发明通过将氧敏感基团连接在两亲性的接枝聚合物上，并通过连接参比探针基团和/或通过包含参比探针材料分子而得到比率型氧传感探针，使得得到的比率型氧传感探针具有良好氧气敏感特性，具有高的荧光效率，并且将氧传感探针连接在以共价键聚合在高分子中，结构稳定，提高应用效率。

本发明的比率型氧传感探针能在水溶液中进行氧传感并在水溶液中保证较高的荧光强度。在提高氧传感器荧光量子效率、检测水溶液中氧含量的准确性和稳定性的同时，还能保证传感器在水溶液中进行氧传感并在水溶液中保证较高的亮度。可以测量大肠杆菌和海拉细胞以及成骨细胞等在增殖过程中的氧气消耗情况，不同细胞浓度下的氧消耗情况能很好地观察出来。同时，在测试过程中并没有表现出细胞毒性。

本发明的比率型氧传感探针的材料合成简单可控，因为这种传感器可以进行水溶液中氧含量测量，因此可以广泛运用于一些类似于酶标仪等的商用仪器。这在能进行高通量低氧、氧浓度测量以进行更深入的生物理解、疾病诊断和新陈代谢研究等领域具有广泛的应用前景。

附图说明

图1为实施例3中自组装得到的p3浓度为0.01-100mg/ml的纳米体系在650nm波长下的荧光强度变化图。

图2a为氧传感探针对氧气的响应曲线图；

图2b为水溶液中不同氧气浓度与氧传感器荧光强度之间的线性拟合图；

图3为本发明的氧传感探针在饱和氧和缺氧条件下的荧光强度变化图；

图4为本发明的比率型氧传感探针在不同大肠杆菌细胞浓度下荧光强度随时间的变化图；

图5a为成骨细胞在不同细胞浓度下的氧消耗情况图；

图5b为海拉细胞在不同细胞浓度下的氧消耗情况图；

图6a为在相同的氧传感探针的浓度(4μg/ml)时不同起始细菌浓度下细胞生长曲线图；

图6b为在不同探针pttfpp浓度下，细胞浓度为1×10⁷cfu/ml的大肠杆菌的细胞生长曲线图。

具体实施方式

下面通过具体实施方式来进一步说明本发明的技术方案。本领域技术人员应该明了，所述实施例仅仅是帮助理解本发明，不应视为对本发明的具体限制。

实施例1

在本实施例中，通过如下流程合成p3所示聚合物：

制备过程具体包括以下步骤：

(1)p1合成过程：

1.14ml(10mmol)苯乙烯，2ml苯甲醚(anisole)，57.2mg(0.4mmol)溴化亚铜混合后加入10mlschlenk管中，液氮冷冻到固体状态后抽真空。抽真空后，将35μl(0.2mmol)引发剂，83.5μl(0.4mmol)n,n,n,n,n-五甲基二亚乙胺(pmdeta)加入schlenk管中。液氮冷冻后抽真空。抽真空后用热溶剂溶解，可以看到有大量气泡冒出。反复冷冻，抽真空，溶解，待没有气泡冒出，充氮气，并抽换气三次后加热至90℃氮气保护下反应10小时。反应结束后，溶液通过中性氧化铝层析柱，用二氯甲烷作洗脱剂，洗脱后的溶液逐滴加入冷的甲醇溶液中，抽滤后即得白色粉末，产率约71％。mn(gpc)＝3792,mn(nmr)＝3200.¹hnmr(400mhz,cdcl3)δ6.89(dd,j＝252.4,49.6hz,1h),4.46(s,1h),3.76(s,1h),2.60–1.12(m,1h).

(2)p2合成过程：

0.3mg(0.1mm)带羟基聚苯乙烯，0.7ml(2mm)三乙胺和10mlthf溶液加入50ml两口瓶中，1.12ml(2mm)甲基丙烯酰氯逐滴加入快速搅拌下的混合溶液中。室温反应24小时后，将混合溶液逐滴加入冷的甲醇中，抽滤后即得白色粉末，产率约80％。mn(gpc)＝3792,mn(nmr)＝3200.¹hnmr(400mhz,cdcl3)δ6.89(dd,j＝252.4,49.6hz,1h),6.10(s,1h),5.57(s,1h),4.46(s,1h),4.10(s,1h),3.76(s,1h),2.30–1.22(m,1h).

(3)聚合物p3合成过程：

100mg(0.031mm)聚苯乙烯单体，400mg(0.4mm)寡聚乙二醇甲醚甲基丙烯酸酯(oegma)，50mg(0.58mm)甲基丙烯酸，5mg(0.005mm)铂卟啉单体os1，10mgaibn1mldmf溶液(超干溶剂)放入10mlschlenk管中，利用传统的方法除氧后，充氮气抽换气三次，加热至70℃搅拌，反应24小时。反应完毕后逐滴加入冰乙醚中，得红色粘稠状聚合物。产率61％。mn(gpc)＝33600,mw(gpc)＝49000,mw/mn＝1.46。¹hnmr(400mhz,cdcl3)δ8.75(s,1h),8.13(s,1h),7.76(s,1h),6.82(d,j＝205.7hz,1h),3.64(s,7h),2.59(dd,j＝255.9,181.7hz,3h).

实施例2

在本实施例中，通过如下流程合成具有π共轭体系的共聚高分子cp：

制备过程具体包括以下步骤：

2.0m碳酸钠水溶液5ml与20mlthf互溶后用氩气除氧30min，再将9.87mg(0.00854mmol)四(三苯基膦)钯、0.104g(0.34mmol)4,7-二溴苯并[c]-1,2,5-噻二唑和0.1266g(0.34mmol)9,9-二己基芴-2,7-二硼酸二(1,3-丙二醇)酯混合后除氧30min后用氩气保护。两种混合液混合后用氩气除氧10min后密封，80℃下冷凝回流24h。反应完全后用二氯甲烷与水萃取并干燥，浓缩后滴入冰甲醇中，得黄色粘稠物。产率约80％。mn(gpc)＝2400,mw(gpc)＝6300,mw/mn＝2.62。¹hnmr(400mhz,cdcl3)δ8.32–7.77(m,1h),2.16(s,1h),1.59(s,1h),1.36–0.57(m,3h)

实施例3

对实施例1制备得到的聚合物在水溶液中形成胶束的能力进行考察，由于p3中含有荧光团os1，因此其cmc可以由其在水溶液中胶束形成过程中荧光的强度决定。在未形成胶束时，荧光团的荧光发射会被水淬灭而获得较弱的荧光。一旦胶束形成，荧光强度将会极大地增强。通过测试p3在水溶液0.01mg/ml到100mg/ml浓度下的荧光强度变化，通过荧光强度突变点判断p3的cmc。以浓度和650nm波长下的荧光强度值作为横坐标和纵坐标作图得到图1，由图1中荧光强度突变点即图1中两条直线的交点得出p3的cmc值为0.35μg/ml。

实施例4

在该实施例中，利用实施例1制备得到的聚合物p3与实施例2制备得到的聚合物cp自组装得到比率型氧传感探针，自组装方法如下：

配制cp浓度为1mg/ml的thf溶液，取200μl将5mg双亲高分子溶解。完全溶解后将混合液缓慢注射到急速搅拌的1ml水溶液中得到澄清透明的胶束溶液。胶束溶液装入透析袋透析3天，每12小时换一次水。透析完毕后用直径0.45μm的水系过滤膜过滤，以过滤掉未被包覆的cp沉淀和形成的大颗粒。得到的传感器胶束溶液浓度用紫外可见分光光度计检测其310和545nm处的吸收值，并用已经建立的os1和cp标准曲线计算。制备好的胶束溶液储存在棕色玻璃瓶中并存放在4℃冰箱中保存以备后续工作使用。经检测，包覆好的os1浓度为0.039mg/ml(相当于37μm)，双亲高分子浓度约2.5mg/ml。

os1在p3中的荧光量子效率(η)通过利用390nm的光激发pttfpp在二氯甲烷中的量子效率(η＝0.088)进行计算，计算公式如下所示。

其中，ηr和ηs是标准荧光量子效率和样品的荧光量子效率。ar和as是标准样品和测试样品在激发波长下的洗手。ir和is是标准样和测试样发射强度的积分，nr和ns是各样品溶剂的折射系数。水和二氯甲烷的折射系数分别是1.333和1.424，最终的量子效率通过测量吸收值在0.03至0.09范围的四组数据的平均值而得到，标准差小于10％，最终得到os1在p3中的荧光量子效率η＝0.16438。

cp的荧光量子效率通过聚合物荧光光谱积分对比硫酸奎宁在1.0n硫酸中的荧光光谱(激发波长为365nm)，在修正的折射系数下运用方程(1)，得到其荧光量子效率η＝0.55，荧光量子效率高。

实施例5

在本实施例中对实施例4制备得到的比率型氧传感探针的氧传感性能进行测试，氮气和氧气的混合气体被用作调节溶液中氧气浓度。混合气体通过定制内嵌数字气体流量控制器进行精准控制。所有的传感测量都在大气压(760mmhgor101.3kpa)下进行。23℃时，在氧分压为21.4kpa的空气饱和条件下，水中的溶解氧浓度为8.58mg/ml。

图2a为氧传感探针对氧气的响应曲线图，从图中可以明显观察到，气体从氮气改变为氧气的过程中，参比探针cp的荧光强度几乎不变，表现出极好的稳定性；同时，氧传感器(os1)的荧光强度则逐渐减弱，当气体变为纯氧气时，荧光强度最低，表现出其对氧气相当敏感。

图2b为水溶液中不同氧气浓度与氧传感器荧光强度之间的线性拟合图。图中可以看出，氧气浓度和氧传感器荧光强度之间具有良好的线性关系，因此本传感器可以通过荧光强度变化精确检测水中溶解氧含量的多少。

实施例6

在本实施例中对实施例4制备得到的比率型氧传感探针的响应时间进行测试，方法如下：

3ml的os1胶束溶液置于石英比色皿中，在激发光为405nm时，3秒测量传感器650nm峰值的发射。为了改变缓冲液中溶解氧的浓度，通过小管和针头将管路中的气体通入缓冲液中。通气孔安装在比色皿上方以针管插入及让气体排出。氧气和氮气气流速率设置为50立方厘米/分钟。测量开始后将100％氧气和100％氮气进行快速切换。如图3所示，从氮气条件下通入氧气，达到95％变化时的时间t95为30s，达到99％变化的时间t95为36s。相反，氧气条件下通入氮气，t95-r为162s，t99-r为222s。响应时间比pttfpp物理混合在phema阵列的t90＝50s及物理混合在聚苯乙烯阵列的t90＝84s都要快很多。说明本发明制备得到的比率型氧传感探针在在氧传感方面是很理想的材料。通过重复性测试发现os1是十分稳定的，七次重复性测试，其荧光强度并没有改变。

实施例7

在该实施例中，考察本发明的氧传感探针对细胞呼吸中氧浓度的响应性，方法如下：

大肠杆菌培养：将单菌落大肠杆菌置于液态lysogenybroth(lb)培养基。其中，lb培养基由10g胰蛋白胨，5g酵母膏和10g氯化钠溶于蒸馏水。通过测量600nm处的光学强度(od600)来估计培养基中的大肠杆菌密度。特别是od600在0.1至1之间时与大肠杆菌表现为良好的线性特征。通过uv-vis光谱校准，在od600为1的时候表现为1.0×10⁸cfu/ml。通过一夜的培养，细菌的密度已经决定，用新鲜的lb培养基进行适当的稀释以获得适当的大肠杆菌浓度。

细胞呼吸测试：运用jm109大肠杆菌来对细胞进行研究。传感器溶液直接加到细胞培养基中，然后荧光信号将运用405nm激光激发后直接收集荧光。cp发射峰在527nm，os1的峰在650nm，测试温度保持在37℃。ps(聚苯乙烯)与poegma(聚甲基丙烯酸寡聚乙二醇酯)共聚物对一些包含大肠杆菌和hela细胞学等细胞有不渗透性。为了避免培养基中的氧气与大气中的氧气进行交换，在lb培养基上方运用一层矿油将空气隔绝。

图4所示为胶束氧气测试，在测试前20分钟，荧光强度的下降归因于温度效应。这对很多有机荧光素来说是很正常的，随着温度的升高荧光强度随之下降，温度稳定后，荧光强度也变稳定。不论是否含有细菌，在测试中的参比探针cp的荧光强度都不会发生变化。而os1的荧光强度在有细菌的情况下，荧光强度随着时间的变化而变强，这都归因于细菌消耗了氧气。在氧气完全消耗后，高细胞浓度下的os1的荧光强度达到最大，但是之后又轻微的下降。同时，在不同细胞浓度下测试了细胞呼吸。结果表明细胞浓度越高氧气消耗越快。对于细胞浓度在2×10⁷cfu/ml，溶解氧在15分钟内消耗完毕。通过大肠杆菌氧气消耗速率以及初始细胞浓度计算。略受初始细胞密度的影响下，单细胞的氧消耗率为油封下2.98×10^-15-5.95×10^-15molcfu^-1s^-1，无油封下1.78×10^-15-4.46×10^-15molcfu^-1s^-1。

哺乳动物细胞培养：成骨细胞和海拉细胞需用液态dmem培养基培养，其中含有10v/v％fbs，然后在37℃，5％co2氛围下培养。海拉是悬浮细胞系，可以很好地计算细胞浓度，图5a为成骨细胞在不同细胞浓度下的氧消耗情况，图5b为海拉细胞在不同细胞浓度下的氧消耗情况，图5a和图5b显示越高的细胞浓度氧气消耗越快。

实施例8

在本实施例中，考察本发明的氧传感探针的细胞毒性，方法如下：

在os1浓度为4μg/ml的情况下，以1×10⁶-1.5×10⁸cfu/ml细胞浓度进行细菌生长测试，结果如图6a所示。由于培养基中的大肠杆菌密度是通过测量600nm处的光学强度(od600)来估计，因此600nm处不同的光学强度(od600)也就代表了培养基中不同的大肠杆菌密度。图6a中w/osensor表示大肠杆菌在没有氧传感器情况下的生长曲线，w/sensor则表示大肠杆菌在有氧传感器情况下的生长曲线。监测了不同大肠杆菌密度(不同od值，od值分别为0.055，0.06，0.07，0.09，0.13)下，有和没有氧传感器情况下大肠杆菌的生长曲线。实验结果发现，氧传感器的存在与否并不影响大肠杆菌的生长。另外，运用1×10⁷cfu/ml浓度细胞在4-20μg/mlos1浓度下对细菌进行细菌生长测试，结果如图6b所示，结果表明，两种毒性测试方式都显示传感器胶束对细菌生长没有影响。本传感器在1-4μg/ml就能表现出很好的传感性能。

本发明通过上述实施例来说明本发明的比率型氧传感探针及其制备方法和应用，但本发明并不局限于上述实施例，即不意味着本发明必须依赖上述实施例才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明所选用原料的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。