本发明涉及植物单宁的提取纯化方法，具体涉及一种利用植物提取缩合单宁高聚体的方法。
背景技术：
：：植物多酚(plantpolyphenols)，又称植物单宁(vegetabletannins)，结构复杂多样，种类繁多，根据化学结构的不同，可以分为缩合单宁(condensedtannins)、水解单宁(hydrolysabletannins)、间苯三酚单宁(phlorotannins)及共同含有缩合单宁和水解单宁结构单元的复杂单宁(complextannins)等聚合体大分子多酚，以及黄酮类物质(flavonoids)、酚酸(phenolicacids)等小分子多酚。植物单宁具有的与蛋白质(酶)、多糖、生物碱等生物大分子及重金属盐络合形成复合物的特性，被认为是其在生物地球化学循环中的主要作用机理。具有还原性和捕捉自由基的活性，是其具有抗氧化、抗突变、抗肿瘤、抗癌症等生理活性的主要作用机理。目前关于植物多酚的研究主要集中在食品、生化、医药等领域的小分子多酚，针对大分子多酚，尤其是单宁高聚物的研究较为缺乏。虽然已有研究报告揭示，聚合度是影响缩合单宁化学与生物活性的因素，聚合度越高的植物单宁可能拥有更高的生物活性。但由于现有分离纯化技术的不足，获得聚合度大于5的缩合单宁仍然很困难，大分子植物多酚(单宁聚合度越大，分子量越大)的研究应用一直受到限制。技术实现要素：本发明的目的在于克服现有技术中的不足，提供了一种适用于植物的缩合单宁高聚体的提取方法，能有效提纯植物体中高聚合度的缩合单宁。本发明提供的植物缩合单宁高聚体的提取方法，包括下述步骤：s1将植物样品清洗干净，冷冻干燥处理后粉碎研磨；s2在研磨后的所述植物样品中加入70％丙酮水溶液，然后提取单宁粗提液；s3将所述单宁粗提液萃取去脂，剩余水相部分去除有机溶剂后，再进行冷冻干燥处理,得到单宁粗提物；s4将所述单宁粗提物溶于水后置于第一色谱柱，依次采用蒸馏水、60％甲醇溶液、100％甲醇溶液和70％丙酮溶液进行冲洗；s5收集s4步骤中70％丙酮冲洗的全部洗脱液，置于第二色谱柱，采用三种不同比例组成的丙酮、甲醇和水的混合溶液洗脱三次，分别收集各次洗脱液，即得到不同聚合度峰值的缩合单宁高聚体。上述本发明步骤中，所述步骤s1中的植物样品清洗干净后的冷冻干燥处理的温度在-40至-50℃之间，处理时间大于72h。上述本发明步骤中，所述步骤s1中的植物样品与70％丙酮水溶液的质量体积比为0.2g/ml；所加入的70％丙酮水溶液中含有0.25％的抗坏血酸。上述本发明步骤中，所述步骤s2在研磨后植物样品中加入70％丙酮水溶液后，采用超声提取、离心处理得到上清液，然后通过旋转蒸发处理去除丙酮，得到单宁粗提液。进一步地，所述超声提取、离心处理步骤中的超声提取时间为30min-40min，每次超声提取混合物的离心速率为19000g-20000g，旋转蒸发处理去除丙酮的温度低于30℃，处理过程重复至少三次。上述本发明步骤中，所述步骤s3中的单宁粗提液依次通过正己烷、石油醚萃取去脂，所述单宁粗提液与所述正己烷的体积比为1：1，所述单宁粗提液与所述石油醚的体积比为1：1。上述本发明步骤中，所述步骤s3中萃取去脂后剩余的水相部分先采用旋转蒸发去除有机溶剂，再进行冷冻干燥处理，所述旋转蒸发温度低于30℃，所述冷冻干燥处理温度在-40至-50℃之间，处理时间大于72h。。上述本发明步骤中，所述步骤s4中的所述蒸馏水与植物样品的体积比为0.3-0.5g/ml，所述60％甲醇溶液与植物样品的体积比为0.1-0.2g/ml，所述100％甲醇溶液与植物样品的体积比为0.25-0.5g/ml，所述70％丙酮溶液与植物样品的体积比为0.5-1g/ml。上述本发明步骤中，所述步骤s5中的用于洗脱的三种不同比例的混合液中，所述混合液a为：丙酮:甲醇:水＝10:80:10，所述混合液b为：丙酮:甲醇:水＝20:60:20，所述混合液c为丙酮:甲醇:水＝70:0:30。上述本发明步骤中，所述s4步骤中的所述第一色谱柱选用50×1.0cm的sephadexlh-20凝胶色谱柱，所述s5步骤中的所述第二色谱柱选用15×1.0cm的sephadexlh-20凝胶色谱柱。本发明在植物样品的初步处理过程中采用冷冻研磨方式，可减少有机溶剂的投入量，且提取快速，步骤重复性好；采用超声提取、离心处理、旋转蒸发过程，能够有效实现液相和有机相的分离效果，去除提取液中有机溶剂，萃取过程温度低，有利于保持单宁的生物活性，保证后续过程的进行；采用不同的凝胶色谱柱和不同比例的混合液冲洗处理，能进一步提高植物单宁的纯度，且能得到植物体中不同聚合度的缩合单宁，为目前大分子植物多酚的结构与活性研究领域提供新的途径。附图说明图1为本发明实施例流程框图；图2为本发明实施例检测质谱图。具体实施方式为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例及附图，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例和附图仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。本发明提供的缩合单宁高聚体的提取方法，适合于植物中的缩合单宁高聚体的提取，包括下述步骤：s1将采集的植物样品清洗干净，冷冻干燥处理后粉碎研磨。该步骤中，可选取成熟的植物叶片，清洗干净后置于冻干机内冷冻干燥处理，其冷冻温度控制在-40至-50℃之间，处理时间大于72h；然后研磨均匀，这样既可避免鲜样研磨时长时间接触丙酮，且提取快速，步骤重复性好，同时能够保证植物叶片的粉碎效果，提高有效成分的析出率。s2在研磨后植物样品中加入70％丙酮水溶液，且所加入的70％丙酮水溶液中含有0.25％的抗坏血酸，然后再通过超声提取、离心处理、旋转蒸发而得到单宁粗提液。该步骤中，其植物样品与70％丙酮水溶液的质量体积比为0.2g/ml，然后将上述混合液采用超声提取、离心处理，得到上清液后，再通过旋转蒸发处理去除有机溶剂丙酮，得到单宁粗提液。该步骤选用70％丙酮水溶液，可有效去除植物样品中的杂质，同时，70％丙酮水溶液中含有0.25％的抗坏血酸，可避免植物中单宁类物质在提过程中的氧化反应，提高单宁类物质的活性。所述超声提取、离心处理过程中，超声提取时间可为30min-40min，每次超声提取混合物的离心速率为19000g-20000g，旋转蒸发去除丙酮的温度在30℃以下。该步骤采用超声提取、离心处理并举之举措，可提高提取效率，同时还减少了植物多酚类物质在溶剂中被破坏的几率，旋转蒸发温度在30℃以下可避免温度对植物单宁类物质稳定性的影响。上述超声提取、离心处理过程可至少重复进行三次，能够有效保证液相和有机相的分离效果，然后合并离心所得的上清液后，再进行旋转蒸发处理，可有效去除丙酮。s3将上述s2步骤得到的单宁粗提液进行萃取去脂处理，然后将剩余水相部分去除有机溶剂，再进行冷冻干燥处理,最后得到单宁粗提物。该步骤中，单宁粗提液依次通过正己烷、石油醚萃取去脂，其中单宁粗提液与正己烷的体积比为1：1，单宁粗提液与石油醚的体积比为1：1，每个试剂的萃取均需至少进行2次，可有效去除单宁粗提液中的油脂。萃取去脂后，剩余的水相部分先采用旋转蒸发处理，以去除有机溶剂，再进行冷冻处理。其中旋转蒸发处理的温度低于30℃，冷冻干燥处理温度在-40至-50℃之间，处理时间在72h以上，可充分去除前述步骤中的有机溶剂,进一步纯化单宁粗提物。s4将上述单宁粗提物溶于水后上第一色谱柱，然后依次采用蒸馏水、60％甲醇溶液、100％甲醇溶液和70％丙酮溶液冲洗，可有效分离溶液中的小分子单宁。该步骤中，所述的第一色谱柱选用50×1.0cm的sephadexlh-20凝胶色谱柱，然后分别采用洗脱溶剂蒸馏水、60％甲醇溶液、100％甲醇溶液和70％丙酮溶液冲洗，其中所述的蒸馏水与植物样品的体积比为0.3-0.5g/ml，所述60％甲醇溶液与植物样品的体积比为0.1-0.2g/ml，所述100％甲醇溶液与植物样品的体积比为0.25-0.5g/ml，所述70％丙酮与植物样品的体积比为0.5-1g/ml。s5将上述蒸馏水、60％甲醇溶液、100％甲醇溶液洗脱后溶液的回收，收集s4步骤中经过70％丙酮冲洗的全部洗脱液，上第二色谱柱，然后依次采用三种不同比例组成的丙酮、甲醇和水的混合溶液洗脱三次，分别收集各次洗脱物，即得到不同聚合度峰值的缩合单宁高聚体。该步骤中，第二色谱柱选用选用15×1.0cm的sephadexlh-20凝胶色谱柱，所采用的三种不同比例的混合液中，所述混合液a为丙酮:甲醇:水＝10:80:10，所述混合液b为丙酮:甲醇:水＝20:60:20，所述混合液c为丙酮:甲醇:水＝70:0:30。上述三种混合液的用量均应为所洗脱层析柱体积的3-5倍。从上述步骤可以看到，本发明在植物样品的初步处理过程中采用冷冻研磨方式，可减少有机溶剂的投入量，且提取快速，步骤重复性好；采用超声提取、离心处理、旋转蒸发过程，能够有效实现液相和有机相的分离效果，去除提取液中有机溶剂，有利于保持单宁的生物活性，保证后续过程的进行；采用不同的凝胶色谱柱两次冲洗处理，能有效提高所获得的植物体中单宁的纯度，且洗脱时采用三种不同比例的混合液，可进一步得到不同峰值的高聚合度的缩合单宁，为目前大分子植物多酚的结构与活性研究领域提供新的途径。本发明提取流程简单，成本低，容易实现，具有较高的实用价值。下面结合实施例对本发明做进一步详述。实施例：参见图1，本实施例以红树科植物角果木作为实施对象，用于提取红树植物中的缩合单宁高聚体。s1选取适量红树科角果木成熟叶片，投入冻干机内，在-40至-50℃的温度条件下冷冻干燥处理72小时以上，然后用研钵研磨均匀；s2取上述研磨后的样品100g，加入500ml70％丙酮水溶液，超声提取30min后离心处理，离心速率为19000g。然后收集上清液，余下沉淀部分重新加入70％丙酮水溶液，再进行超声提取和离心处理，上述过程共进行三次。合并上述三次离心处理所得的上清液，在不高于30℃的条件下旋转蒸发，以去除有机溶剂--丙酮，得到单宁粗提液约630ml。s3在单宁粗体液中依次加入等体积(630ml)的正己烷、石油醚，萃取去脂，每个试剂至少重复二次，剩下的水相部分在不高于30℃的温度下旋转蒸发去除有机溶剂，再投入冻干机内，在-40至-50℃的温度条件下冷冻干燥处理72小时以上，得到单宁粗提物。s4将上述粗提物中溶于蒸馏水中，然后上50×1.0cm的sephadexlh-20凝胶色谱柱，依次用300ml的蒸馏水、1000ml60％甲醇溶液、400ml100％甲醇溶液、200ml70％丙酮溶液冲洗。s5将上述步骤中采用蒸馏水、60％甲醇溶液、100％甲醇溶液的洗脱液回收，收集70％丙酮溶液的洗脱液，可得到缩合单宁高聚体f，再过15×1.0cm的sephadexlh-20凝胶色谱柱，依次用50ml混合液a→丙酮:甲醇:水＝10:80:10，混合液b→丙酮:甲醇:水＝20:60:20，混合液c→丙酮:甲醇:水＝70:0:30冲洗sephadexlh-20凝胶色谱柱，分别收集得到缩合单宁高聚体f1、f2、f3。检测结果：运用brukerreflexⅲ基质辅助激光解析电离飞行时间质谱对缩合单宁高聚体f、缩合单宁高聚体f1、缩合单宁高聚体f2、缩合单宁高聚体f3的成分进行分析，maldi-tof线性模式质谱图结果显示(参见图2)，缩合单宁高聚体复合物f中，最高可检测到25聚体，而含量最多的是10聚体(峰值在10聚体分子量处出现)；缩合单宁高聚体f1的最高检测值是23聚体，峰值是9聚体；缩合单宁高聚体f2的最高检测值是28聚体，峰值是12聚体；缩合单宁高聚体f3最高检测值高达32聚体，峰值是18聚体。综上所述，本发明上述实施例所示仅为本发明较佳实施例之部分，并不能以此局限本发明，在不脱离本发明精髓的条件下，本领域技术人员所作的任何修改、等同替换和改进等，都属本发明的保护范围。当前第1页12当前第1页12