本发明属于生物工程技术领域，具体涉及人可溶性糖蛋白(sgp130)单克隆抗体及编码基因、制备方法与应用
背景技术：
gp130是一个重要的信号分子，几乎表达于体内各种组织细胞上，参与着体内一些重要的生理过程，其主要的作用之一就是利用胞外区结合il-6-il-6r复合物，向细胞内传导信号。通常情况下人血清中含有的il-6量很少，但在炎症、感染和患有肿瘤或癌症的情况下其含量会大幅上升。在人类的血清中，除了有gp130以外，还有可溶型的gp130(sgp130)，sgp130是gp130的胞外区片段，可能是作为复合物il-6-il-6r的拮抗剂存在于动物体内。研究发现，正常人血浆中sgp130的含量可达410ng/ml。体内的sgp130保留着与配体结合的能力，它可以阻断il-6的反式信号途径，从而减轻炎症反应的发生，在一定程度上可以抑制肿瘤和某些癌症的发展。检测体内sgp130蛋白的表达对于研究治疗肿瘤和癌症的药物具有重要作用。
技术实现要素：
本发明的一个目的是提供一种人可溶性糖蛋白(sgp130)单克隆抗体及其编码基因。
人可溶性糖蛋白130单克隆抗体，所述抗体包括轻链可变区和重链可变区，所述重链可变区的碱基序列和氨基酸序列分别如seqidno.1和seqidno.2所示，所述轻链可变区的碱基序列和氨基酸序列分别如seqidno.3和seqidno.4所示。
所述的人可溶性糖蛋白130单克隆抗体，其为如下a或b所示的蛋白质：
a：重链可变区的碱基序列和氨基酸序列分别由seqidno.1和seqidno.2所示序列组成，且轻链可变区的碱基序列和氨基酸序列分别如seqidno.3和seqidno.4所示列组成的蛋白质；
b：将seqidno.1-4所示的序列经过一个或几个碱基/氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的由a衍生的蛋白质。
所述人可溶性糖蛋白130单克隆抗体的编码基因，为如下1)-3)中任一所示的dna分子：
1)重链可变区的核苷酸序列如seqidno.1所示，且轻链可变区的核苷酸序列如seqidno.3所示的dna分子：
2)与1)限定的dna序列杂交且编码权利要求1或2所述抗体的dna分子；
3)与1)限定的dna分子具有90％以上的同源性且编码权利要求1或2所述抗体的dna分子。
含有本发明所述人可溶性糖蛋白130单克隆抗体的重组表达载体或表达盒或转基因细胞系或重组菌也是本发明的保护范围。
本发明的另一个目的是提供人可溶性糖蛋白130单克隆抗体的应用，所述抗体用于制备特异性结合人可溶性糖蛋白130的产品，或者用于制备治疗癌症的药物，或者，所述抗体用于检测样品中是否含有sgp130。
本发明所述的人可溶性糖蛋白130单克隆抗体的制备方法，采用如下步骤：
1)利用分子克隆的手段构建人可溶性糖蛋白(sgp130)的重组质粒，该重组质粒具有权利要求4所述的编码基因的dna分子序列，转化至宿主菌rosseta(de3)中进行蛋白表达，纯化后，获得高纯度的人可溶性糖蛋白(sgp130)蛋白；
2)将制备好的sgp130抗原腹腔注射至balb/c小鼠体内；
3)重复步骤2)再加强免疫2次后，取血，利用elisa技术检测血清中抗体效价；
4)取抗体效价达到要求106的balb/c小鼠的脾细胞与骨髓瘤细胞进行融合，制备杂交瘤细胞；
5)对分泌sgp130单克隆抗体的杂交瘤细胞进行2～3次的克隆化培养；
6)将步骤5)获得的克隆化培养的杂交瘤细胞扩大培养，获得较高浓度的抗sgp130蛋白的单克隆抗体；
7)利用proteina亲和层析柱对细胞上清单抗进行纯化；
8)特异性检测：利用western-blotting技术对获得的抗体的特异性进行检测；
9)利用pcr技术对制备的单克隆抗体的重链可变区进行基因测序。
具体为：
1)获取抗原sgp130蛋白：人源sgp130基因，定位于人类的5号染色体，sgp130的cdna的全长约为1.9kb，由329个氨基酸组成，相对分子质量(mr)约为60kd。利用软件primerpremier5.0设计sgp130蛋白的上游引物和下游引物，利用聚合酶链式反应(pcr)技术扩增获得sgp130蛋白的基因，分别对该目的基因与表达载体pet-28a进行双酶切，然后利用t4-dna连接酶进行酶连，获得重组质粒pet-28a-sgp130，送至基因测序。将测序正确重组质粒pet-28a-sgp130转化至宿主菌rosseta(de3)中，进行蛋白表达。根据聚丙烯凝胶电泳(sds-page)的结果，sgp130蛋白以包涵体的形式表达。将sgp130蛋白的包涵体溶于含有8m尿素的tris-nacl缓冲液中，使用生工蛋白胶回收试剂盒进行纯化，将回收的sgp130蛋白溶于pbs缓冲液中。
2)用pbs将步骤1)获得的sgp130蛋白稀释至1mg/ml，然后与等体积的完全弗氏佐剂(ifc)混合，利用乳化器将混合物乳化至滴水不化后，选取6～8周龄的balb/c小鼠进行腹腔免疫，注射剂量为：100μg/只。
3)重复步骤2)加强免疫两次：第15天，改换成弗式不完全佐剂，注射剂量为：50μg/只；第29天，弗式不完全佐剂，注射剂量为：50μg/只。
4)第三次注射2周后，尾部取血并测定血清效价；利用elisa检测balb/c小鼠血清中的抗体效价，取效价达到要求(高于106)的balb/c小鼠的脾细胞与骨髓瘤细胞进行融合，制备杂交瘤细胞,融合前三天加强免疫一次，直接不加佐剂，免疫剂量50μg/只。
5)融合2周左右，利用elisa法对杂交瘤细胞进行筛选，以骨髓瘤细胞培养上清作为阴性对照，以免疫鼠血清作为阳性对照，包被抗原为sgp130蛋白，获得分泌sgp130蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞。
6)对于5)步骤获得的杂交瘤细胞进行2～3次的克隆化培养，每次克隆化培养约7-10天，在倒置显微镜下观察细胞，标出肉眼可见的只有单个克隆生长的孔，进行抗体检测；将检测结果为阳性细胞再次扩大培养，直至100％孔分泌sgp130蛋白单克隆抗体，建系保存该杂交瘤细胞株。
7)将步骤6)克隆化培养、筛选获得的杂交瘤细胞扩大培养，获得抗sgp130蛋白高浓度细胞上清单抗。
8)将2g左右的proteina填料与10mlph7.0的tris缓冲液混合，倒入层析柱，静置5-10min，使得填料自然沉降，得到无气泡的proteina填料柱；加入10倍柱体积的ph7.0的tris缓冲液，并以合适的流速冲洗柱子；将步骤7)获得高浓度单抗与ph7.0的tris缓冲液按照体积比1:2混合后，用0.45μm滤膜过滤后，加入层析柱中进行亲和层析，然后利用洗脱液(ph4.50.1m柠檬酸溶液加ph8.0的中和液)洗脱抗体，将洗脱液利用pbs透析三次，最后利用超滤浓缩管浓缩抗体溶液，获得高纯度、高浓度的sgp130单克隆抗体。
9)利用pcr技术对制备的单克隆抗体的轻链可变区、重链可变区进行基因测序。
本发明的优点在于：本抗体是完全人源性抗体，具有高特异性、高亲和力和高灵敏度，本发明纯化抗体的方法是利用proteina填料来纯化，得到的单克隆抗体纯度更高。本发明所采用的人源sgp130蛋白制备的单克隆抗体能够为体内sgp130和gp130蛋白的表达水平提供较为准确的检测手段。
附图说明
图1：sgp130蛋白胞外结构域基因克隆的琼脂糖凝胶电泳图；其中，m：markerdl2000；4：空白对照；1-3：sgp130pcr扩增产物。
图2：sgp130蛋白胞外结构域蛋白表达鉴定的聚丙烯酰胺凝胶电泳图；其中，m:marker；1：pet-28a-sgp130诱导前rosseta总蛋白；2：pet-28a-sgp130诱导18h后rosseta总蛋白；3：pet-28a-sgp130诱导18h后破碎上清；4：pet-28a-sgp130诱导18h后破碎沉淀；圆圈所标记为目标蛋白位置。
图3：sgp130单抗检测sgp130蛋白的wb结果图。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明的具体实施方式进行详细的描述，但应当理解本发明的保护范围并不受具体实施方式的限制。
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径获得。
人可溶性糖蛋白130单克隆抗体，所述抗体包括轻链可变区和重链可变区，所述重链可变区的碱基序列和氨基酸序列分别如seqidno.1和seqidno.2所示，所述轻链可变区的碱基序列和氨基酸序列分别如seqidno.3和seqidno.4所示。
所述的人可溶性糖蛋白130单克隆抗体，其为如下a或b所示的蛋白质：
a：重链可变区的碱基序列和氨基酸序列分别由seqidno.1和seqidno.2所示序列组成，且轻链可变区的碱基序列和氨基酸序列分别如seqidno.3和seqidno.4所示列组成的蛋白质；
b：将seqidno.1-4所示的序列经过一个或几个碱基/氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的由a衍生的蛋白质。
所述人可溶性糖蛋白130单克隆抗体的编码基因，为如下1)-3)中任一所示的dna分子：
1)重链可变区的核苷酸序列如seqidno.1所示，且轻链可变区的核苷酸序列如seqidno.3所示的dna分子：
2)与1)限定的dna序列杂交且编码权利要求1或2所述抗体的dna分子；
3)与1)限定的dna分子具有90％以上的同源性且编码权利要求1或2所述抗体的dna分子。
人可溶性糖蛋白130单克隆抗体，用于制备特异性结合人可溶性糖蛋白130的产品，或者用于制备治疗癌症的药物，或者，所述抗体用于检测样品中是否含有sgp130。
实施例1
人可溶性糖蛋白130单克隆抗体的制备方法，具体采用如下步骤：
1)首先获取抗原sgp130蛋白：选取sgp130蛋白作为抗原，其碱基数约为1878bp，蛋白分子量约为60kda。利用引物设计软件primerpremier5.0设计sgp130蛋白的胞外结构域的上游引物：
5’ggaattccatatgcaccatcaccatcaccatgagctgctggacccatgcggctatat3'(加his-tag)(酶切位点ecori)和下游引物：
5'ccgctcgagtcacaccagcacaggcaccacgatagc3'(酶切位点，xhoi)，利用聚合酶链式反应(pcr)技术扩增获得大量sgp130蛋白的胞外结构域的基因(如图1所示)，分别对该目的基因与载体pet-28a进行双酶切，然后利用t4-dna连接酶进行连接，获得重组质粒pet-28a-sgp130，送去基因测序。将测序正确的重组质粒pet-28a-sgp130转化至宿主菌rosseta(de3)中，挑取阳性单克隆菌落，接种于50μg/ml卡纳抗性lb培养基的4ml试管中，37℃，200rpm/min培养过夜；将4ml过夜培养物接种于含有50μg/ml卡纳抗性的100mllb培养基的三角瓶中，37℃，200rpm/min振荡培养2～3h，至菌液od值达到1.0，加入异丙基-β-d-硫代半乳糖苷(iptg)至终浓度1.0mm，将培养条件改为17℃，200rpm/min培养16～18h，收集菌体，重悬于50mlpbs中，超声破碎，进行聚丙烯酰胺凝胶电泳(sds-page)鉴定，结果表明：sgp130蛋白以包涵体的形式表达。将sgp130蛋白的包涵体溶于含有8m尿素的tris-nacl缓冲液中，进行聚丙烯酰胺凝胶电泳(如图2所示)，并使用蛋白胶回收试剂盒进行回收，获得纯化后的抗原蛋白。
2)用pbs将步骤1)获得的sgp130蛋白稀释至1mg/ml，然后与等体积的完全弗氏佐剂(ifc)混合，利用乳化器将混合物乳化至滴水不化；选取6～8周龄的balb/c小鼠进行腹部多点注射免疫，每只小鼠注射剂量为100μg，免疫前三天进行取血当为空白血清。
3)重复步骤2)加强免疫两次：第15天，每只小鼠注射剂量为50μg；第29天，每只小鼠注射剂量为50μg，加强免疫用弗式不完全佐剂。
4)第三次注射2周后，尾部取血并测定血清效价；利用elisa检测balb/c小鼠血清中的抗体效价，以空白对照组血清为阴性对照，pbs为空白对照；抗体效价高于106时，表明抗体具有足够的抗体滴度和亲和力，取该balb/c小鼠的脾细胞与骨髓瘤细胞进行融合，制备杂交瘤细胞。
表1elisa检测balb/c小鼠血清中的抗体效价表
5)融合2周左右，利用elisa法对杂交瘤细胞的抗体进行检测和筛选，以杂交瘤细胞培养基作为阴性对照，以免疫鼠血清作为阳性对照，包被抗原为浓度1ug/mlsgp130蛋白；最终获得分泌sgp130蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞。
6)对于步骤5)获得的杂交瘤细胞进行2～3次的克隆化筛选和培养；每次克隆化培养约7-10天，在倒置显微镜下观察细胞，标出肉眼可见的只有单个克隆生长的孔，进行抗体检测；将检测结果为阳性细胞再次扩大培养，直至100％孔分泌sgp130单克隆抗体，建系保存该杂交瘤细胞株。
其中，elisa步骤和结果如下：
(1)包被：用包被缓冲液将本发明制备的sgp130蛋白稀释至1μg/ml，然后包被聚苯乙烯板的反应孔，100μl/孔，4℃过夜。
(2)洗涤：弃去孔内的包被液，用洗涤缓冲液孔洗涤3次反应孔，3×3min(以下简称洗涤)。
(3)封闭：每孔加入200μl的封闭液，37℃封闭2h；尽量弃尽封闭液。
(4)加一抗：每孔加入稀释5倍细胞培养上清，37℃下孵育1h；孵育完毕后弃尽一抗，充分洗涤后甩干。
(5)加二抗：每孔加入100μl用稀释液稀释至一定浓度的hrp-羊抗小鼠igg二抗，37℃下孵育30min；孵育完毕后弃尽酶标二抗，洗涤，甩干。
(6)显色：每孔加入100μl底物tmb，37℃避光反应15min；每孔加入100ml的终止液以终止显色反应。测定450nm的吸光度值(a450)。
表2elisa检测融合细胞上清抗体效价表
实验结果分析：从elisa结果中可以看出阴性的结果(nc)只有0.0515，阳性结果(pc)为over。表中标记的是抗体效价较高的融合细胞株，分别是：a7、b2、b3、c7、c9、e9；这6株细胞株是对sgp130特异性较强、产生抗sgp130抗体较多的细胞株。将这5株细胞株进行进一步的克隆化培养，直至获得特异性更强、100％分泌单克隆抗体的融合细胞株。
7)小鼠腹水法制备单抗：首先，每只balb/c小鼠腹腔注射0.5ml液体石蜡；10天后每只balb/c小鼠腹腔注射1×106/0.5ml的细胞量的无血清dmem培养基稀释的步骤6)克隆化培养、筛选获得的杂交瘤细胞；7天后开始观察balb/c小鼠，若观察到小鼠腹部明显膨大，则可采集其腹水；先将腹水低速离心以除去细胞等杂质，收集上清后再采用高速离心以除去细小颗粒。
8)将2g左右的proteina填料与10mlph7.0的tris缓冲液混合，倒入层析柱，静置5-10min，使得填料自然沉降，得到无气泡的proteina填料柱；加入10倍柱体积的ph7.0的tris缓冲液，并以合适的流速冲洗柱子；将步骤7)获得的高浓度sgp130单抗与ph7.0的tris缓冲液按照体积比1:2混合后，用0.45μm滤膜过滤后，倒入层析柱中进行亲和层析纯化，利用10倍柱体积的ph7.0的tris缓冲液进行洗脱非特异性吸附的杂质，然后利用洗脱液(ph4.50.1m柠檬酸溶液加ph8.0的中和液)洗脱sgp130单体，用pbs将洗脱液透析三次，最后利用超滤浓缩管浓缩抗体溶液，获得高纯度、高浓度的sgp130单克隆抗体。
9)sgp130单克隆抗体的特异性检测：利用western-blotting进行检测，将sgp130进行sds-page电泳，根据marker条带割下目的蛋白质位置的胶片，经过转膜、一抗、二抗孵育，ecl显色等步骤，结果显示本发明所述的sgp130单克隆抗体具有很好的特异性，能够很好的检测含有sgp130蛋白的样品(如图3)。
10)sgp130单克隆抗体亚型测定：利用鼠源单克隆抗体亚型鉴定试剂盒，采用elisa检测法对balb/c小鼠腹水纯化的sgp130单克隆抗体进行亚型鉴定，结果表明：sgp130单克隆抗体属于igg1亚类，其轻链为κ链。
表3sgp130单抗亚型的elisa结果
实验结果分析：从抗体亚型鉴定的elisa结果表中可以看出igg1和κ的结果全为over，所以本次发明的抗体重链亚型为igg1；抗体轻链亚型为κ链。
11)利用pcr技术对制备的单克隆抗体的重链可变区和轻链可变区进行基因测序。
实施例2
利用western-blotting技术检测sgp130蛋白，具体操作步骤如下：
1)对含有sgp130蛋白的生物样品，利用15％的聚丙烯酰胺凝胶电泳(sds-page)进行分离，电泳结束后取下page胶，与pvdf膜做成“三明治”形状，用湿转法进行转膜。
2)电转完毕，取下pvdf膜，加入5％脱脂奶粉-tbst(蛋白面朝下)，于37℃摇床摇荡(65rpm)封闭1h，以消除非特异性背景。
3)封闭结束后用tbst洗掉5％脱脂奶粉-tbst，加入一抗：本发明制备的sgp130的单克隆抗体，于脱色摇床摇荡孵育(60rpm)1h或者4℃孵育过夜(12-16h)，使一抗与特异蛋白结合。
4)回收一抗，用tbst在摇床中洗4次(60rpm)，每次洗脱时间5min。
5)加入二抗，于脱色摇床孵育(60rpm)1h，使二抗与一抗充分结合。
6)回收二抗，用tbst在摇床中洗4次(60rpm)，每次洗脱时间5min
7)用ecl显色试剂盒(200μl试剂a/张+200μl试剂b/张)孵育3min。去掉反应液，转移到保鲜膜上，压片显影定影。定影后自然干燥，佳能相机拍照，记录实验结果(如3)。
以上内容是结合具体的优选实施方式对本发明作的进一步详细说明，不能认定本发明的具体实施只局限于这些说明，对于本发明所属技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下还可以做出若干简单推演或替换，都应当视为属于本发明所提交的权利要求书确定的保护范围。
序列表
<110>福州大学
<120>人可溶性糖蛋白130单克隆抗体及编码基因、制备方法与应用
<160>4
<170>siposequencelisting1.0
<210>1
<211>399
<212>dna
<213>人工序列(artificialsequence)
<400>1
ctctagagtcaccatggagttagtttgggcagcagatccaggggccagtggatagacaga60
tgggggtgtcgttttggctgaggagactatgagagtggtgccttggccccagtagtcaac120
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<210>2
<211>133
<212>prt
<213>人工序列(artificialsequence)
<400>2
serglyglyglyleuvalglnproglyglyserleulysleusercys
151015
alaalaserglyphethrphesersertyrglymetsertrpvalarg
202530
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<212>prt
<213>人工序列(artificialsequence)
<400>4
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