一种抗白色念珠菌的哌嗪类衍生物及其制备方法与应用与流程

本发明涉及化合物合成领域，特别涉及一种抗白色念珠菌的哌嗪类衍生物及其制备方法与应用。
背景技术：
：白色念珠菌是在人类中广泛传播的真菌疾病，是现在医院获得性感染最重要的病原之一。该真菌能感染并殖入人体内大范围的微生物环境，包括血管，粘膜表面和主要的内脏器官。作为一个条件性致病菌，白色念珠菌不仅是鹅口疮和阴道炎的病原，而且能在免疫缺陷性病人体内引起严重的系统性感染并导致较高的死亡率。目前最有效的治疗和预防白色念珠菌感染的疾病是局部和系统使用唑类抗真菌药物，该类药物能直接杀死菌体，但随着唑类药物的广泛使用耐药现象也越来越严重。基于这个原因，开发一种具有新型抗菌策略的药物来治疗白色念珠菌感染非常有价值。白色念珠菌有一个很特别的特性，即酵母-菌丝二相性。白色念珠菌酵母态到菌丝态的形态转变是其感染细胞的重要因素。白色念珠菌游离酵母态先进行粘附，并通过形态转变以促进组织入侵，感染了白色念珠菌的病人通常由菌丝态的病原穿入感染组织。在感染期间形态转变突变的缺陷株是无毒的，形态转变对白色念珠菌的致病性非常重要。所以，我们利用白色念珠菌粘附和形态转换在其致病作用当中的重要性来筛查可以抑制该菌株的新型药物。技术实现要素：本发明的首要目的在于克服现有技术的缺点与不足，提供一种抗白色念珠菌的哌嗪类衍生物。本发明的另一目的在于提供上述抗白色念珠菌的哌嗪类衍生物的制备方法。本发明的再一目的在于提供上述抗白色念珠菌的哌嗪类衍生物的应用。本发明的目的通过下述技术方案实现：一种抗白色念珠菌的哌嗪类衍生物，结构式如式i所示：其中，r为2-x、4-x或4-cx3；x为卤族元素，包括f、cl、br和i；2和4表示取代基团所在的位置。所述的r优选为4-cf3、2-cl、2-br或4-br。所述的抗白色念珠菌的哌嗪类衍生物的制备方法，包含如下步骤：(1)将4-羟基咔唑和环氧氯丙烷混匀，于-10℃～10℃下滴加naoh溶液，升温至60℃继续反应，tlc检测反应进程，反应结束后加适量水，用乙酸乙酯萃取，合并有机相，水洗，干燥，过滤，滤液回收，蒸干溶剂，得到环氧化物；(2)将环氧化物和含不同取代基的哌嗪溶于异丙醇中，于0℃～80℃回流反应4～6小时，反应进程用tlc检测，反应完毕将反应体系冷却，蒸干溶剂；纯化，重结晶，得到抗白色念珠菌的哌嗪类衍生物；其中，含不同取代基的哌嗪的用量按其与4-羟基咔唑＝摩尔比1:1配比。步骤(1)中所述的环氧氯丙烷的摩尔用量与所述的4-羟基咔唑的摩尔用量的比值不小于1，从而，4-羟基咔唑能充分利用；优选为所述的环氧氯丙烷的摩尔用量与所述的4-羟基咔唑的摩尔用量的比值为1:1～2:1；更优选为所述的环氧氯丙烷的摩尔用量与所述的4-羟基咔唑的摩尔用量的比值为1.2:1。步骤(1)中所述的naoh溶液的浓度优选为质量百分比40％。步骤(1)中所述的naoh的摩尔用量优选为相当于4-羟基咔唑摩尔量的2倍。步骤(1)中所述的滴加的温度优选为0℃。步骤(1)中所述的tlc检测反应进程的具体步骤优选如下：以硅胶gf254进行薄层色谱，展开剂为石油醚：乙酸乙酯按体积比7：1～3：1得到的混合液，检测至原料点消失。步骤(1)中所述的水用于悬浮分散使用。步骤(1)中所述的干燥优选为使用无水硫酸镁进行干燥。步骤(2)中所述的含不同取代基的哌嗪优选为1-(4-三氟甲基苯基)哌嗪、1-(2-氯苯基)哌嗪、1-(2-溴苯基)哌嗪、1-(4-溴苯基)哌嗪。步骤(2)中所述的回流反应的条件优选为80℃回流反应6小时。步骤(2)中所述的tlc检测反应进程的具体步骤优选如下：以硅胶gf254进行薄层色谱，展开剂为石油醚：乙酸乙酯按体积比4：1得到的混合液，检测至哌嗪化合物点消失。步骤(2)中所述的纯化优选为通过柱层析纯化。所述的柱层析的填料优选为200-300目硅胶。所述的柱层析纯化优选为使用石油醚和乙酸乙酯按体积比6:1配比得到的混合液进行洗脱。步骤(2)中所述的重结晶优选为使用质量百分比95％的乙醇进行重结晶。所述的抗白色念珠菌的哌嗪类衍生物在制备抗白色念珠菌感染的药物中的应用。本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：(1)本申请发明人之前的研究已经鉴定出可扩散的信号因子(dsf)群体感应信号及其衍生物可以较强的干扰白色念珠菌酵母态-菌丝态的转变。本次研究也成功合成并筛选出具有抑制白色念珠菌粘附性、菌丝形态转换和致病性的化合物。同时，这些化合物本身毒性较小，不影响白色念珠菌及人类细胞的生长，这些特点有望促进新型抗真菌药物治疗的发展。(2)本发明提供的制备方法的得率高，为75％左右。附图说明图1是哌嗪类衍生物的合成过程图；其中，a为氢氧化钠。图2是哌嗪类衍生物对白色念珠菌粘附于聚苯乙烯上的检测结果图；其中，图(a)为终浓度为100μm的45种合成的哌嗪类衍生物对白色念珠菌细胞粘附的影响结果图；图(b)为22、24、25、26、27和28号共6种化合物在12.5μm到200μm的不同浓度下的抑制率的结果图；氟康唑作为阳性对照；数据显示的是8个生物学重复的平均结果，误差棒反映了标准差。图3是哌嗪类衍生物对白色念珠菌菌丝形成的影响结果图；其中，图(a)是终浓度为100μm的45种合成的哌嗪类衍生物对白色念珠菌菌丝形成的抑制率的测定结果图；图(b)是22、24、25、26、27和28号共6种化合物在50μm到200μm的不同浓度下的抑制效果图；图(c)是dmso、氟康唑、22、24、25、26、27和28号化合物在终浓度为100μm时对菌丝生成抑制的显微镜观察照片图；此数据显示的是3次生物学实验的平均结果，误差棒反映了标准差。图4是哌嗪类衍生物对白色念珠菌的致病性检测结果图；其中，图a是终浓度为100μm的45种合成的哌嗪类衍生物对a549细胞的细胞毒性的检测结果图，图b是终浓度为100μm的45种合成的哌嗪类衍生物对白色念珠菌细胞毒性的影响结果图，图c是25、26、27和28号化合物在3.125μm到100μm的不同浓度下对白色念珠菌细胞毒性的影响结果图；通过检测ldh的释放量来检测细胞的毒性，在检测白色念珠菌的细胞毒性时，将加入了dmso的那一组的ldh释放量作为100％，并由此来规范其他加入哌嗪类衍生物组的ldh释放比例；数据显示的是4个生物学重复的平均结果，误差棒反映了标准差。图5是哌嗪类衍生物对白色念珠菌生长速率的影响结果图；氟康唑作为阳性对照；数据显示的是3个生物学重复的平均结果，误差棒反映了标准差。具体实施方式下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。实施例1哌嗪类衍生物的合成一、如图1所示，哌嗪类衍生物的合成过程如下：(1)首先将4-羟基吲哚、4-羟基咔唑或者4-羟基苯乙酮分别与环氧氯丙烷混合(摩尔比为1：1.2)，0℃时滴加质量(g)体积(ml)比为40％的氢氧化钠水溶液(naoh用量是4-羟基吲哚、4-羟基咔唑或者4-羟基苯乙酮摩尔数的2倍)，滴加完毕，升温至60℃，反应，得到相应的环氧化合物，tlc(薄层色谱，材料为硅胶gf254)检测反应进程，直至原料点消失，展开剂为石油醚：乙酸乙酯按体积比7：1得到的混合液，反应结束后加入水，用乙酸乙酯萃取，合并有机相，水洗，用无水硫酸镁干燥，过滤，滤液回收，蒸干溶剂；(2)得到的产物分别与含不同取代基的哌嗪(用量分别与4-羟基吲哚、4-羟基咔唑或者4-羟基苯乙酮摩尔数一致，具体化合物如表1所示)在异丙醇中高温(80℃)回流反应6小时，反应进程用tlc检测，直至哌嗪点消失，展开剂为石油醚：乙酸乙酯按体积比4：1得到的混合液，反应完毕将反应体系冷却，蒸干溶剂。用柱层析(石油醚：乙酸乙酯＝体积比6：1洗脱，填料是200-300目硅胶)进行纯化，再经质量百分比95％的乙醇重结晶，得到化合物1～45(如表2所示)。化合物通过核磁与质谱鉴定，与所设计结构一致。在活性实验中所有样品均溶解在dmso中，备用。通过该方法得到的化合物的产率为75％左右。表1注：表1中的含不同取代基的哌嗪结构可依据“ge,z.q；ji,q.g.；chen,c.y.；liao,q.；wu,h.l.；liu,x.f.；huang,y.r.；yuan,l.j.；liao,f.,synthesisandbiologicalevaluationofnovel3-substitutedamino-4-hydroxylcoumarinderivativesaschitinsynthaseinhibitorsandantifungalagents,journalofenzymeinhibition&medicinalchemistry,2016,31(2),219-228”进行合成。如以化合物25的合成为例子，具体如下：将4-羟基咔唑9.16g(0.05mol)加入环氧氯丙烷5.55g(0.06mol)中，于0℃下滴加浓度为40％(w/v)的naoh溶液10ml，约1小时滴完，升温至60℃继续反应数小时，tlc检测反应进程，反应结束后加适量水，用乙酸乙酯萃取，合并有机相，水洗，无水硫酸镁干燥。过滤，滤液回收，蒸干溶剂，得砖红色油状物约15g，即为4-(环氧乙烷-2-基)甲氧基-9h-咔唑粗提物，无需纯化。取上述所得环氧化物与11.5g(0.05mol)1-(4-三氟甲基苯基)哌嗪溶于适量的异丙醇中，回流反应6小时，反应进程用tlc检测，反应完毕将反应体系冷却，蒸干溶剂。用柱层析(石油醚：乙酸乙酯6：1洗脱)进行纯化，再经95％乙醇重结晶后，得到化合物25约17.50g，产率75％。表2实施例2效果检测试验1、检测试验(1)粘附性试验白色念珠菌sc5314菌株(美国atcc)于gmm营养液(由6.7g/l的无氨基酸的酵母氮源(ynb)加0.2％的葡萄糖组成，参考文献“anoveldsf-likesignalfromburkholderiacenocepaciainterfereswithcandidaalbicansmorphologicaltransition”中的方法)中培养过夜，将其od600值调到0.5，并依次加入一定终浓度的化合物，混匀，加入到96孔板(聚苯乙烯材质)中，200μl/孔。将培养板静置于37℃中孵育4小时后弃掉上清液，每孔加入50μl浓度为质量体积比0.5％的结晶紫进行染色，室温作用45min。将结晶紫弃掉，并用冰的去离子水洗10次，然后用200μl浓度为体积百分比75％的乙醇溶解结晶紫，室温放置30min，随后用酶标仪检测od590值。(2)菌丝形成试验白色念珠菌sc5314菌株在gmm营养液中30℃培养至其od600值为2.0，用gmm营养液稀释20倍。化合物按照一定终浓度加入到0.5ml稀释好的菌液中，稍微震荡混匀，然后放置在37℃水浴锅中作用4个小时，并以氟康唑、bdsf(b.cenocepaciadiffusiblesignalfactor，一种从洋葱伯克氏菌中分离出的可自由扩散的信号分子，化学名称为顺式-2-十二碳烯酸，购买得到)和dmso为对照。作用结束后，离心(5000rpm、10min)，将上清液弃掉，加入40μl新鲜的gmm营养液进行重悬，于zeissaxioplan2显微镜下观察菌丝的形成。(3)白色念珠菌生长曲线分析白色念珠菌sc5314菌株在gmm培养基中30℃培养过夜，将其od600值调到0.05，加入化合物使其终浓度为100μm。以300μl/孔加入到10×10无菌蜂窝微孔板(bioscreen-c自动生长曲线分析仪中配适使用)里面，将培养板放置到bioscreen-c自动生长曲线分析仪中30℃中度震摇培养，仪器每半个小时自动检测一次每孔的od600值，连续监测48h。(4)细胞毒性实验细胞毒性实验通过人肺癌a549细胞释放的乳酸脱氢酶ldh含量来检测。a549细胞在含10％(v/v)胎牛血清的高糖培养基dmem中，以1×104个细胞/孔的浓度于96孔板中培养过夜。待细胞长满到80％的时候，弃去培养液，用pbs(0.01m、ph7.4)清洗细胞三次。白色念珠菌sc5314菌株在30℃摇床于含0.2％(w/v)葡萄糖的gmm培养液中培养过夜，离心收集菌体，用pbs清洗三次，以108cfu/ml的浓度分散在含1％(v/v)fbs的dmem细胞维持液中，加入一定浓度的化合物。相互作用后加入到96孔细胞板里，于细胞培养箱中作用8h。同时设置dmso以及不加化合物的作为对照孔。(5)小鼠感染试验动物试验采用的是balb/c小鼠(购于广东省实验动物中心)，试验是按照美国国立卫生研究院的健康指导中实验动物的护理和使用条例(nih8023号出版物,1978年修订)来进行的。6–8周龄的雄性小鼠被随机分配到不同的组，每组8只，称重。白色念珠菌sc5314以5×108cfu/ml的浓度分散在含pbs中，将终浓度为100μm的化合物27和28号加入到含菌的pbs溶液中，尾静脉注射，100μl/10g，同时注射1×pbs(ph7.4、0.01m)，100μm氟康唑分别作为阴性、阳性对照。2、实验结果(1)哌嗪类衍生物抑制白色念珠菌的粘附因为粘附是白色念珠菌感染的第一步，所以我们先检测了哌嗪类衍生物是否能够抑制白色念珠菌粘附到聚苯乙烯上。如图2所示，45个化合物中，有11个化合物的粘附抑制料率超过75％(图2a)。其中22、24、25-28号化合物的效果特别突出。我们继续检测了这种抑制能力是不是浓度依赖性的，所以我们选择了在12.5μm到200μm浓度下检测这些化合物的抑制效果，结果显示这些化合物在12.5μm的浓度下的抑制率都超过了65％(图2b)，结果说明哌嗪类衍生物能有效的抑制白色念珠菌的粘附。(2)哌嗪类衍生物抑制白色念珠菌菌丝形成白色念珠菌酵母态到菌丝态的形态转变对其致病性非常重要。我们在体外检测了这些化合物对白色念珠菌形态转变的影响。白色念珠菌在30℃摇床于gmm培养液中培养以保持其酵母形态，培养液以一定比例稀释后在37℃培养，以促进菌丝形成。培养液中加或者不加化合物，经过4h的孵化，加入dmso的阴性对照组中绝大多数的细胞都形成了菌丝，而大多数加入化合物组的菌丝形成减少了(图3)。其中13个化合物的菌丝抑制率在100μm终浓度时至少超过了50％(图3a)，22、24、25-28号化合物抑制了菌丝形成呈现出浓度依赖性(图3b)。进一步在显微镜下观察菌丝形成，可以看到22、24、25、26、27和28号化合物在100μm的浓度下对白色念珠菌菌丝形成的影响(图3c)，可见，这几个化合物都能抑制菌丝生成。(3)哌嗪类衍生物减弱了白色念珠菌的致病性为了研究哌嗪类衍生物是否能影响白色念珠菌的致病性，我们检测了哌嗪类衍生物在有和无白色念珠菌的情况下对细胞和小鼠的毒性影响。正如我们预期，在加入了一些哌嗪类衍生物之后，白色念珠菌在细胞上的毒性降低了(图4)。根据ldh实验结果可知，当终浓度为100μm时，8、23、24、35、37、38、39、40和42号化合物有很高的细胞毒性，而其他的化合物没有或者有极低的细胞毒性(图4a)。当细胞中加入白色念珠菌时，相同浓度下有的哌嗪类衍生物几乎完全抑制了白色念珠菌的毒性(图4b)。所以我们选择25、26、27、28号化合物进行3.125μm到100μm浓度下对白色念珠菌的毒性抑制作用(图4c)。考虑到22、24、25-28号化合物在抑制生物膜和菌丝形成中有较好的效果，而化合物22和24在抑制白色念珠菌细胞毒性上没有效果，我们接下来主要分析了25-28号化合物在不同浓度下对白色念珠菌细胞毒性的抑制效果。结果显示，这四个化合物都不会影响白色念珠菌的生长效率(图5)，即在不杀死真菌的情况下能降低白色念珠菌的致病性，这说明它们有望作为新型的抗真菌药物使用。小鼠感染试验结果同样显示，小鼠在感染了白色念珠菌30d之内100％死亡，但是在加入了27和28号化合物之后死亡率分别是29％和14％(表3)。我们可以看出28号化合物是新型抗白色念珠菌药物的候选者之一。表3老鼠感染模型中化合物对白色念珠菌致病性的影响化合物存活率(％)dmso0氟康唑10027712886总的来说，我们合成了一系列哌嗪类衍生物，并筛选了他们对抗真菌病原体的能力。它们当中的一些化合物显示出了很好的抑制白色念珠菌细胞粘附、菌丝形成和致病性的特性，但是它们对白色念珠菌细胞本身以及人体细胞没有毒性。实验结果显示，这些化合物中的有些化合物可能被开发为新型抗白色念珠菌感染的药物。上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。当前第1页12