包含环组氨酸-脯氨酸作为有效成分的用于保护细胞的组合物的制作方法

本发明涉及包含环组氨酸-脯氨酸作为有效成分的用于保护细胞的组合物。

背景技术：

环组氨酸-脯氨酸(cyclohis-pro，chp)是在结构上与促甲状腺激素释放激素(thyrotropin-releasinghormone，trh)相关的自然产生的环二肽。组氨酸-脯氨酸(chp)为分布在动物和人的组织和体液中的缩氨酸，可在血液、精液、胃肠道、小便等中找到，尤其，属于前列腺(prostate)的丰富的代谢产物。组氨酸-脯氨酸具有抗糖尿病、抗肥胖、抗炎症、抗氧化作用等多种生理活性功能。

细胞凋亡(apoptosis)对多细胞生命体的正常发育及功能来说是重要的过程。生理性的细胞凋亡虽然在正常过程中起重要的作用，但非正常的细胞凋亡会引起多种疾病。例如，若细胞凋亡受阻碍，就会导致癌、自身免疫性疾病、炎症性疾病、病毒感染等疾病。

并且，众所周知，细胞凋亡也与阿尔茨海默病、帕金森病、肌萎缩侧索硬化(amyotrophiclateralsclerosis)、卢伽雷病等的神经退行性疾病及大脑局部缺血(cerebralischemia)、创伤性脑损伤(traumaticbraininjury)、脊髓损伤(spinalcordinjury)、脑卒中等的急性疾病有着密切的关系。

但是，对组氨酸-脯氨酸的细胞的保护效果与机制的研究尚未报告。

技术实现要素：

技术问题

因此，本发明人已通过实验确认了环组氨酸-脯氨酸抑制因高浓度的药物处理引起的肾细胞、肝细胞的细胞凋亡并且保护细胞的事实，从而完成了本发明。

本发明的目的为提供包含环组氨酸-脯氨酸或药学上允许的环组氨酸-脯氨酸的盐作为有效成分的细胞保护用药学组合物。

本发明的另一目的为提供包含环组氨酸-脯氨酸或食品学上允许的环组氨酸-脯氨酸的盐作为有效成分且预防或改善肝损伤或肾损伤的保健品。

技术方案

为了实现上述目的，本发明提供包含环组氨酸-脯氨酸或药学上允许的环组氨酸-脯氨酸的盐作为有效成分的细胞保护用药学组合物。

根据本发明的实施例，上述细胞可以为肾细胞或肝细胞。

根据本发明的实施例，上述组合物用于抑制细胞凋亡。

根据本发明的实施例，上述组合物用于抑制因药剂引起的细胞损伤。

根据本发明的实施例，上述药剂为抗癌剂或抗生素，抗癌剂可以为选自由顺铂(cisplatin)、卡铂(carboplatin)、奥沙利铂(oxaliplatin)以及奈达铂(nedaplatin)组成的组中的一种以上的铂类抗癌剂。

并且，本发明提供包含环组氨酸-脯氨酸或食品学上允许的环组氨酸-脯氨酸的盐作为有效成分且用于预防或改善肝损伤或肾损伤的保健品。

根据本发明的实施例，引起上述肝的毒性或肾的毒性的药剂可以为选自由顺铂、庆大霉素及醋氨酚组成的组中的一种以上的抗癌剂或抗生素。

有益效果

已确认了本发明的包含环组氨酸-脯氨酸作为有效成分的细胞保护用药学组合物抑制肾细胞或肝细胞因受到毒性影响而引起的细胞凋亡，因此可作为预防及治疗肾毒性或肝毒性的组合物来使用。

附图说明

图1示出环组氨酸-脯氨酸对因庆大霉素引起的肾细胞(llc-pk1cell)的细胞凋亡的抑制效果：**p<0.01，***p<0.001。chp；环组氨酸-脯氨酸，gm；庆大霉素。

图2示出环组氨酸-脯氨酸对因醋氨酚引起的肝细胞(changlivercell)的细胞凋亡的抑制效果：*p<0.05，***p<0.001。chp；环组氨酸-脯氨酸，apap；醋氨酚。

图3为为了确认实验鼠摄取的环组氨酸-脯氨酸对因顺铂引起的肝毒性起到保护作用而测量谷丙转氨酶(alt)的曲线图。

图4为为了确认实验鼠摄取的环组氨酸-脯氨酸对因顺铂引起的肝毒性起到保护作用而测量谷草转氨酶(ast)的曲线图。

图5为为了确认实验鼠摄取的环组氨酸-脯氨酸对因顺铂引起的肾毒性起到保护作用而测量肌氨酸酐(creatinine)的曲线图。

图6为为了确认实验鼠摄取的环组氨酸-脯氨酸对因顺铂引起的肾毒性起到保护作用而测量血尿素氮(bun)的曲线图。

具体实施方式

以下，对本发明进行详细的说明。

确认了本发明的包含环组氨酸-脯氨酸作为有效成分的用于保护细胞的组合物具有抑制肾细胞或肝细胞的细胞凋亡的效果。

本发明提供包含环组氨酸-脯氨酸或药学上允许的环组氨酸-脯氨酸的盐作为有效成分的用于保护细胞的组合物。根据本发明的实施例，上述环组氨酸-脯氨酸可从前列腺提取物(prostateextract)分离。

化学式1：

本发明的包含环组氨酸-脯氨酸或药学上允许的环组氨酸-脯氨酸的盐作为有效成分的用于保护细胞的组合物可保护肾细胞或肝细胞。

本发明的包含环组氨酸-脯氨酸作为有效成分的组合物可抑制细胞凋亡。

本发明的组合物抑制因药剂引起的细胞损伤，上述药剂可以为抗癌剂或抗生素，具体地，可以为选自由顺铂、卡铂、奥沙利铂以及奈达铂组成的组中的一种以上的如铂类抗癌剂或庆大霉素或醋氨酚等的抗生素。

本发明的药学组合物可额外包含在药学组合物的制造过程中通常使用的适当的载体、赋形剂或稀释剂。在此情况下，上述组合物所包含的上述环组氨酸-脯氨酸、环组氨酸-脯氨酸的盐、提取物或分馏物的含量并不特别受此限制，但是，相对于组合物总重量，可制备成包含0.0001重量百分比至10重量百分比，优选地，包含0.001重量百分比至1重量百分比。

本发明的术语“药学上允许的盐”意味着阳离子与阴离子通过静电引力相结合而成的盐中的药剂学上可使用的形态的盐，通常为金属盐、有机碱盐、无机酸盐、有机酸盐、碱性及酸性氨基酸盐等。例如，金属盐可包括碱金属盐(钠盐、钾盐等)、碱土金属盐(钙盐、镁盐、钡盐等)、铝盐等；有机碱盐可包括三乙胺、吡啶、甲基吡啶、2，6-二甲基吡啶、乙醇胺、二乙醇胺、三乙醇胺、环己胺、二环己基胺、n，n-二苄乙烯二胺等的盐；无机酸盐可包括盐酸、氢溴酸、硝酸、硫酸、磷酸等的盐；有机酸盐包括甲酸、乙酸、三氟乙酸、邻苯二甲酸、反丁烯二酸、二乙酸、果酸、顺丁烯二酸、柠檬酸、琥珀酸、甲磺酸、苯磺酸、p-甲苯磺酸等的盐；碱性氨基酸盐可包括精氨酸、赖氨酸、鸟氨酸等的盐；酸性氨基酸盐可包括天冬氨酸、谷氨酸等的盐。

本发明的组合物优选为药学组合物，上述药学组合物可以口服或非经口给药，在非经口给药的情况下，优选地，选择皮肤外用或腹腔内注射、直肠内注射、皮下注射、静脉注射、肌肉注射或胸部注射等给药方式。

根据本发明的药学组合物还可包括通常使用的赋形剂、分裂剂、甜味剂、润滑剂、增香剂等。上述分裂剂包括淀粉乙醇酸钠、交联聚维酮、交联羧甲基纤维素钠、海藻酸、羧甲基纤维素钙、羟甲基纤维素钠、几丁聚糖、瓜尔胶、低取代羟基丙基纤维素、镁铝硅酸盐、聚克立林钾等。并且，本发明的药学组合物还可包含药学上允许的添加剂，在此情况下，药学上允许的添加剂可使用淀粉、凝胶淀粉、微晶纤维素、乳糖、聚维酮、二氧化硅、磷酸氢钙、乳糖(lactose)、甘露醇、麦芽糖、阿拉伯树胶、预糊化淀粉、玉米淀粉、粉状纤维素、羟丙基纤维素、欧巴代、淀粉乙醇酸钠、巴西棕榈蜡、复合硅酸铝、硬脂酸、硬脂酸镁、硬脂酸铝、硬脂酸钙、白糖、葡萄糖、山梨醇、滑石等。优选地，根据本发明的药剂学上可接受的添加剂相对于上述药学组合物包含0.1～90重量份。

用于口服的固形制剂包括散剂、颗粒剂、片剂、胶囊、软胶囊剂、丸等。悬浮剂、口服溶液剂、乳剂、糖浆剂、喷雾剂等属于用于口服的液体药剂，可包括经常使用的作为单纯稀释剂的水、液体石蜡、此外还有各种赋形剂，例如润湿剂、甜味剂、芳香剂、保鲜剂等。用于非经口给药的制剂各自根据通常的方法通过以散剂、颗粒剂、片剂、胶囊、灭菌水溶液、液体制剂、非水溶剂、悬浮剂、乳液、糖浆、栓剂、喷雾剂等的外用剂及灭菌注射制剂的形态来进行成型化的方式使用，优选地，可制备乳霜、凝胶、补丁、喷雾剂、软膏、石膏、乳液、擦剂、贴剂或泥敷剂等皮肤外用药学组合物来使用，但不限于此。作为非水溶剂、悬浮剂可使用丙二醇(propyleneglycol)、聚乙二醇、如橄榄油的植物油、如油酸乙酯的可注射的酯等。作为栓剂的基质可使用半合成脂肪酸酯(witepsol)、聚乙二醇、吐温(tween)61、可可油脂、甘油三月桂酸酯、甘油明胶等。

本发明的药学组合物的优选给药量可根据体内的活性成分的吸收度、杀菌率及排泄速度、患者的年龄、性别及状态、要治疗的疾病的重症程度而异，但是也可以被相关技术人员适当地选择。但是为了优选的效果，在口服剂的情况下，通常给成人按每1公斤体重每日给药0.0001mg/kg至100mg/kg的本发明的药学组合物为佳，优选地，给药0.001mg/kg至100mg/kg为佳。给药可以每日给药一次或者分多次来给药。上述给药量在任何方面都不限定本发明的范围。本发明的药学组合物基本上没有毒性或副作用，长时间服用时也可以放心使用。

本发明的药学组合物在保护肾细胞方面有明显的效果，选自由肾炎、急性肾盂肾炎、慢性肾盂肾炎、急性肾功能衰竭、肾小管间质纤维化障碍、肾病综合征(nephroticsyndrome)、肾性尿崩症、电解质代谢异常高尿酸血症以及低钠血症组成的组中且对保护肝细胞有明显的效果，因此有效地利用于选自由肝功能衰竭、急性肝炎、慢性肝炎、慢性间质性肝炎、肝性脑病以及酒精性肝病组成的组中且很好地利用于预防及治疗疾病。

本发明的包含环组氨酸-脯氨酸或药学上允许的环组氨酸-脯氨酸的盐作为有效成分的组合物可作为用于预防或治疗因抗癌剂引起的肝毒性或肾毒性的抗癌补助剂来使用。

上述抗癌补助剂可与顺铂、卡铂、奥沙利铂、奈达铂、阿霉素、紫杉酚、他莫昔芬、ckd602(camtobell)、氟尿嘧啶、格列卫、依托泊苷、择泰、长春新碱(oncovin)等现有的抗癌剂并行给药，以减少肝毒性或肾毒性而增加抗癌效果。

并且，本发明提供包含环组氨酸-脯氨酸或食品学上允许的环组氨酸-脯氨酸的盐作为有效成分且用于预防或改善肝损伤或肾损伤的保健品。

上述可引起肝损伤或肾损伤的药剂可以为选自由顺铂、庆大霉素及醋氨酚组成的组中的一种以上的抗癌剂或抗生素。

本发明的术语“食品学上允许的盐”表示在阳离子与阴离子通过静电引力来结合而成的盐中的食品学上可使用的形态的盐，关于其种类的具体例包含上述的“药学上允许的盐”的例。

在本发明，术语“保健品(healthfood)”表示相比于普通食品，能够积极地维持健康或有提高效果的食品，保健补品(healthsupplementfood)表示具有健康补助目的的食品。根据情况，功能食品、保健品、保健补品的术语可互用。上述食品为了得到好的效果，可以制备成片剂、胶囊、粉末、颗粒、液相、丸等多种形态。

在本发明，术语“功能食物(functionalfood)”与特殊保健品(foodforspecialhealthuse，foshu)是相同的术语，表示以除供给营养之外能够有效地呈现人体调节功能的方式被加工的医学、医疗效果高的食品。

作为这种保健品的具体例，可制备通过利用上述组合物发挥农产物、畜产物或水产物等的特性来使得进行变形的同时，便于存储的加工食品。

本发明的保健品具有保护肾细胞的效果突出，因此可用于预防及治疗选自由肾炎、急性肾盂肾炎、慢性肾盂肾炎、急性肾功能衰竭、肾小管间质纤维化障碍、肾病综合征(nephroticsyndrome)、肾性尿崩症、电解质代谢异常高尿酸血症以及低钠血症组成的组中的疾病；本发明的保健品具有保护肝细胞的效果突出，因此作为保健品可有效地利用于预防或改善选自由肝功能衰竭、急性肝炎、慢性肝炎、慢性间质性肝炎、肝性脑病以及酒精性肝病组成的组中的疾病。

<实施例1>对环组氨酸-脯氨酸抑制肾细胞凋亡的分析

确认了通过环组氨酸-脯氨酸对因庆大霉素引起的肾细胞的细胞凋亡的抑制效果。

具体地，邀请了缩氨酸专门制造企业(bachem；布本多夫，瑞士)来只制备了目标规格为99％纯度的环组氨酸-脯氨酸。庆大霉素是从西格玛化工公司(sigmachemicalco.，美国密苏里州圣路易斯)购买的，肾细胞(llc-pk1cell)是从美国模式培养物保藏所(americantypeculturecollection；atcc；美国弗吉尼亚州马纳萨斯市)购买的。在肾细胞，使0.1mg/ml、1mg/ml、5mg/ml及10mg/ml的环组氨酸-脯氨酸分别与5mg/ml的庆大霉素同时进行处理并培养了6小时(图1的a部分)。

并且，在肾细胞，对0.1mg/ml、1mg/ml、5mg/ml及10mg/ml的环组氨酸-脯氨酸分别进行预处理并培养了2小时后，添加庆大霉素5mg/ml来进一步培养了4小时(图1的b部分)。使用细胞活性检测试剂盒(cellcountingkit-8；日本同仁化学研究所；日本熊本)分析并使用酶标仪(分子器件；美国加州桑尼维尔)测量了细胞存活率。

结果，庆大霉素引起了肾细胞的细胞凋亡，环组氨酸-脯氨酸浓度依赖性地抑制了因庆大霉素引起的肾细胞的细胞凋亡。尤其，对环组氨酸-脯氨酸在肾细胞进行预处理时，大大地抑制了因庆大霉素引起的细胞凋亡。

<实施例2>对环组氨酸-脯氨酸抑制肝细胞凋亡的分析

确认了环组氨酸-脯氨酸对因醋氨酚(acetaminophen，apap)引起的肝细胞的细胞凋亡的抑制效果。

具体地，醋氨酚是从西格玛化工公司(sigmachemicalco.；美国密苏里州圣路易斯)购买的，肝细胞(changlivercell)是从美国模式培养物保藏所(americantypeculturecollection；atcc；美国弗吉尼亚州马纳萨斯市)购买的。在肝细胞，对0.1mg/ml、1mg/ml、5mg/ml或10mg/ml的环组氨酸-脯氨酸分别与15mm的醋氨酚一起同时进行预处理并培养了24小时(图2的a部分)。

并且，在肝细胞，在对0.1mg/ml、1mg/ml、5mg/ml及10mg/ml的环组氨酸-脯氨酸分别进行预处理并培养24小时后，添加15mm的醋氨酚，进一步培养了24小时(图2的b部分)。使用细胞活性检测试剂盒来分析并使用酶标仪来测量了细胞存活率。

结果，醋氨酚引起了肝细胞的细胞凋亡，环组氨酸-脯氨酸浓度依赖性地抑制了因醋氨酚引起的肝细胞的细胞凋亡。尤其，在肝细胞对环组氨酸-脯氨酸与醋氨酚同时进行处理时，大大地抑制了因醋氨酚引起的细胞凋亡。

<实施例3>对摄取环组氨酸-脯氨酸的动物模型中因顺铂引起的肝损伤的抑制效果分析

<3-1>环组氨酸-脯氨酸的摄取及顺铂的给药

为了测量环组氨酸-脯氨酸对实验鼠的肝毒性的保护效果，从韩国科泰克(coretechco.，ltd.)购买了sd小鼠，并在规定条件下(温度：23±3℃、相对湿度：55±10％、一周期：12小时)进行了饲养。5只作为一组并在笼子里自由供给了水和食物，而且在实验前经过一个星期驯化后在实验中使用。顺应期间结束后，分为5个组来进行了如下表1的实验。

表1

第1组摄取水并设定为阴性对照组，第2组摄取水后设定为因给药顺铂导致的肝损伤的对照组，第3组以饮水方式摄取1mg/l的环组氨酸-脯氨酸，第4组以饮水方式摄取5mg/l的环组氨酸-脯氨酸，第5组以饮水方式摄取10mg/l的环组氨酸-脯氨酸并在一个星期后，设定为对因给药顺铂导致的肝损伤的保护效果组。以饮水方式每2日更换1次供给环组氨酸-脯氨酸。

<3-2>测量对小鼠的肝功能的保护效果

为了确认环组氨酸-脯氨酸对肝功能的保护效果，首先给小鼠分浓度给药了环组氨酸-脯氨酸一个星期后，给药顺铂，过24小时后确认了肝功能。为了测量谷丙转氨酶与谷草转氨酶，从小鼠的腹动脉采集了血液后，通过离心分离器只把血清分离后，利用自动分析器(automaticanalyzer；hitachi7180；日本东京)来进行了测量。

结果，如图3及图4所示，阴性对照组与因顺铂引起的肝损伤组实施了验证t并验证了其显著性，统计学上呈现出显著的差异(#p<0.05，###p<0.0005)。

并且，因顺铂引起的肝损伤组与给药环组氨酸-脯氨酸组之间利用方差分析(anova)的显著差来进行多重比较，并利用图基事后检验法来做了个别比较，在统计学上呈现出显著的差异(*p<0.05，**p<0.005)。

给小鼠给药顺铂就会引起肝损伤，可以确认谷丙转氨酶及谷草转氨酶增加。并且，确认了摄取环组氨酸-脯氨酸的小鼠因顺铂增加的谷丙转氨酶及谷草转氨酶明显减少。

因此，环组氨酸-脯氨酸有效减少能确认血中肝功能数据的谷丙转氨酶及谷草转氨酶浓度，包含环组氨酸-脯氨酸作为有效成分的药学组合物对保护肝细胞效果显著，所以更好地使用于由肝病组成的疾病的预防及治疗。

<实施例4>对摄取环组氨酸-脯氨酸的动物模型中因顺铂引起的肾损伤的抑制效果分析

<4-1>环组氨酸-脯氨酸的摄取及顺铂的给药

为了测量环组氨酸-脯氨酸对实验鼠的肾毒性的保护效果，从韩国科泰克购买了icr小鼠，在规定条件下(温度：23±3℃、相对湿度：55±10％、一周期：12小时)进行了饲养。5只作为一组并在笼子里自由供给了水和食物，而且在实验前经过一个星期驯化后用于实验了。在顺应期间结束后，分为3个组来进行了如下表2的实验。

表2

第1组摄取水后设定为阴性对照组，第2组摄取水后设定为对因给药顺铂导致的肾损伤的对照组，第3组每日摄取1mg/l的环组氨酸-脯氨酸一个星期，并设定为对因给药顺铂导致的肾损伤的保护效果组。

<4-2>测量对小鼠的肾功能的保护效果

为了确认环组氨酸-脯氨酸对肾功能的保护效果，首先使用1ml注射器，在每天给小鼠口服浓度为1mg/kg的环组氨酸-脯氨酸后，给药顺铂，经过72小时后确认了肾功能。为了测量肌氨酸酐，从小鼠心脏采集了血液，通过离心分离器只把血清分离后，利用全自动生化分析仪(bs-390，中国迈瑞生物医学电子有限公司，mindraybio-medicalelectronicsco.,ltd.,)来进行了测量。图5示出了其结果。上述实验结果通过与经过顺铂处理的肝损伤组不同的实验组之间实施验证t来验证其显著性，统计学上呈现出显著的差异(#p<0.05，##p<0.005)。

如图5所示，给小鼠给药顺铂就会导致肾损伤并可确认肌氨酸酐增加。并且，确认了摄取环组氨酸-脯氨酸的小鼠因顺铂而增加的肌氨酸酐明显减少。

因此，有效减少能确认环组氨酸-脯氨酸的血中肾功能数据的肌氨酸酐的浓度，包含环组氨酸-脯氨酸作为有效成分的药学组合物对保护肾细胞效果显著，所以更好地使用于由肾疾病组成的疾病的预防及治疗。

<实施例5>对摄取环组氨酸-脯氨酸的小鼠中因顺铂引起的肾损伤的抑制效果测量

<5-1>环组氨酸-脯氨酸的摄取及顺铂的给药

为了测量环组氨酸-脯氨酸对小鼠的肾毒性的保护效果，从韩国科泰克购买了icr小鼠，在规定条件下(温度：23±3℃、相对湿度：55±10％、一周期：12小时)进行了饲养。5只作为一组并在笼子里自由供给了水和食物，而且在实验前经过一个星期驯化后在实验中使用。顺应期间结束后，分3个组来进行了如下表3的实验。

表3

1组取水后设定为摄阴性对照组，2组摄取水后设定为对因给药顺铂导致的肾损伤的对照组，3组每日口服1mg/kg的环组氨酸-脯氨酸一个星期后，设定为对因给药顺铂导致的肾损伤的保护效果组。

<5-2>测量对小鼠的肾功能的保护效果

为了确认环组氨酸-脯氨酸对肾功能的保护效果，首先每日口服浓度为1mg/kg的环组氨酸-脯氨酸一个星期，给药顺铂，经过24小时后确认了肾功能。为了测量血尿素氮，从小鼠心脏采集血液，通过离心分离器只把血清分离后，利用全自动生化分析仪来进行了测量。

最终，如图6所示，上述实验结果通过与因顺铂引起的肝损伤组不同的实验组之间实施验证t来验证了其显著性，统计学上呈现出显著的差异(#p<0.05)。

给小鼠给药顺铂就会导致肾损伤，因此可以确认血尿素氮增加。并且，确认了摄取环组氨酸-脯氨酸的小鼠因顺铂而增加的血尿素氮明显减少(图6)。

因此，有效减少可确认环组氨酸-脯氨酸的血中肾功能数据的血尿素氮的浓度，包含环组氨酸-脯氨酸作为有效成分的药学组合物对保护肾细胞效果显著，所以更好地使用于由肾疾病组成的疾病的预防及治疗。确认了根据本发明的环组氨酸-脯氨酸对作为抗癌剂的顺铂抑制及减少肝损伤或肾损伤具有优秀的效果，可作为用于预防及治疗由抗癌剂引起的肝损伤或肾损伤的药学组合物或保健品来有效使用。

以上，对本发明重点查看了其优选实施例。本发明所属技术领域的普通技术人员可在不脱离本发明的本质特性的范围内以变形的实施方式体现本发明。因此，所公开的实施例，应从说明的观点来进行理解，而不是限定的观点。本发明的范围由发明要求保护范围来体现，而不是上述说明，应理解的是，与发明要求保护范围等同的范围内的所有不同之处均属于本发明的范围。