RNA检测试剂盒和方法与流程

本发明涉及用于检测核酸的试剂盒和方法，更具体地涉及用于检测rna的试剂盒和方法。
背景技术：
：微rna(microrna)(下文中缩写为“mirna”)是由约22个核糖核苷酸组成的非编码rna。已知mirna调节转录阶段的rna沉默和转录后阶段的基因表达。mirna的这种功能通过与其靶mrna中的互补序列碱基配对来进行。自从首次在秀丽隐杆线虫(c.elegans)中发现mirna以来，已经一种接一种地报道了多种mirna，同时已知其可以在动物、植物和病毒中调节基因表达。此外，已知由mirna基因的突变引起的功能障碍可能造成某些疾病，例如癌症。因此，已经越来越认识到mirna的重要性。由于已知mirna的长度非常短(约22nt)并且比mrna更容易降解，因此分离或检测mirna存在很大困难。用于检测mirna的常规方法包括northern印迹分析；使用微阵列的基于杂交的检测；通过包括rt-pcr的两步法来检测和定量某mirna的方法，其使用与mirna互补结合的茎-环引物，并且随后进行定量pcr；以及包括以下步骤的方法：使用poly(a)聚合酶在mirna的3’末端进行poly(a)加尾，使用poly(t)衔接子作为引物合成cdna，然后使用mirna特异性正向引物和基于poly(t)衔接子的反向引物对mirna进行扩增。然而，上述检测方法的缺点在于，由于互补序列不够长，所以可能发生非特异性扩增，并且由于这些方法通常基于实时pcr，所以需要昂贵的实时pcr系统，并且由于pcr产物具有相似的大小，所以同时检测多种mirna的多重分析受限。另外，在用于mirna检测的常规方法中，由于mirna的长度短，所以使用具有约70至80聚体的长长度的逆转录引物以确保用于pcr扩增的模板的长度。然而，在这种常规检测方法的情况下，由于其长的长度，逆转录引物在反应溶液中的扩散缓慢，因此逆转录反应时间增加，从而导致总反应时间增加。因此，常规检测方法存在的问题是实时pcr中的ct值变大并且反应性降低。技术实现要素：本发明是为了解决包括上述问题在内的多种问题而完成的，本发明的一个目的是提供用于检测小rna分子(包括mirna)的更有效和经济的试剂盒和方法。然而，应该理解，该目的仅是说明性的，并且本发明的范围不受上述目的的限制。根据本发明的一个方面，提供了用于检测rna分子的试剂盒，其包含：短逆转录引物，其由第一杂交寡核苷酸和第一衔接子寡核苷酸构成，所述第一杂交寡核苷酸由与所述rna分子的poly(a)尾杂交的寡(dt)构成，并且所述第一衔接子寡核苷酸连接至所述第一杂交寡核苷酸的5’末端并且为不与所述rna分子杂交的任何核酸序列；延伸引物，其比所述逆转录引物更长并且由第二杂交寡核苷酸和第二衔接子寡核苷酸构成，所述第二杂交寡核苷酸能够与从所述rna分子逆转录的单链cdna的3’末端部分特异性杂交，该3’末端部分为所述单链cdna的除寡(dt)以外的部分，并且所述第二衔接子寡核苷酸连接至所述第二杂交寡核苷酸的5’末端并且具有不与所述单链cdna杂交的任何核酸序列；以及正向引物，其具有在所述第二衔接子寡核苷酸序列内的序列。根据本发明的另一个方面，提供了用于检测rna分子的试剂盒，其包含：用于逆转录的短反向引物，其由第一杂交寡核苷酸和第一衔接子寡核苷酸构成，所述第一杂交寡核苷酸由与在所述rna分子的3’末端的5至9nt的所述rna分子的3’末端部分杂交的核酸序列构成，并且所述第一衔接子寡核苷酸连接至所述第一杂交寡核苷酸的5’末端并且为不与所述rna分子杂交的任何核酸序列；延伸引物，其比用于逆转录的反向引物更长并且由第二杂交寡核苷酸和第二衔接子寡核苷酸构成，所述第二杂交寡核苷酸能够与从所述rna分子逆转录的单链cdna的部分特异性杂交，该部分为所述单链cdna的除对应于所述rna分子的3’末端部分的部分以外的部分，并且所述第二衔接子寡核苷酸连接至所述第二杂交寡核苷酸的5’末端并且具有不与所述单链cdna杂交的任何核酸序列；以及正向引物，其具有在所述第二衔接子寡核苷酸序列内的序列。根据本发明的另一个方面，提供了用于检测rna分子的方法，其包括：使用poly(a)聚合酶对从对象获得的样品中的rna分子进行poly(a)加尾，从而制备poly(a)尾rna分子；使用逆转录酶和短逆转录引物对所述poly(a)尾rna分子进行逆转录，所述短逆转录引物由第一杂交寡核苷酸和第一衔接子寡核苷酸构成，所述第一杂交寡核苷酸由与所述poly(a)尾rna分子的poly(a)尾杂交的寡(dt)构成，并且所述第一衔接子寡核苷酸连接至所述第一杂交寡核苷酸的5’末端并且为不与所述poly(a)尾rna分子杂交的任何核酸序列；使所述逆转录酶失活并使通过逆转录产生的dna解链，从而制备从所述poly(a)尾rna分子逆转录的单链cdna；以及将一部分或全部逆转录反应物转移到用于引物延伸和pcr反应的反应器中，所述反应器含有比所述逆转录引物更长的延伸引物、正向引物和热稳定的dna聚合酶，所述延伸引物由第二杂交寡核苷酸和第二衔接子寡核苷酸构成，所述第二杂交寡核苷酸能够与所述单链cdna的3’末端部分特异性杂交，该3’末端部分为所述单链cdna的除寡(dt)以外的部分，并且所述第二衔接子寡核苷酸连接至所述第二杂交寡核苷酸的5’末端并且具有不与所述单链cdna杂交的任何核酸序列，并且所述正向引物具有在所述第二衔接子寡核苷酸内的序列，以及随后在单个步骤中进行引物延伸和pcr反应。根据本发明的另一个方面，提供了用于检测rna分子的方法，其包括：使用逆转录酶和用于逆转录的短反向引物对rna分子进行逆转录，所述用于逆转录的短反向引物由第一杂交寡核苷酸和第一衔接子寡核苷酸构成，所述第一杂交寡核苷酸由与在所述rna分子的3’末端的5至9nt的所述rna分子的3’末端部分杂交的核酸序列构成，并且所述第一衔接子寡核苷酸连接至所述第一杂交寡核苷酸的5’末端并且为不与所述rna分子杂交的任何核酸序列；使所述逆转录酶失活并使通过逆转录产生的dna解链，从而制备从所述rna分子逆转录的单链cdna；以及将一部分或全部逆转录反应物转移到用于引物延伸和pcr反应的反应器中，所述反应器含有比所述用于逆转录的反向引物更长的延伸引物、正向引物和热稳定的dna聚合酶，所述延伸引物由第二杂交寡核苷酸和第二衔接子寡核苷酸构成，所述第二杂交寡核苷酸能够与从所述rna分子逆转录的所述单链cdna的部分特异性杂交，该部分为所述单链cdna的除对应于所述rna分子的3’末端部分的部分以外的部分，并且所述第二衔接子寡核苷酸连接至所述第二杂交寡核苷酸的5’末端并且具有不与所述单链cdna杂交的任何核酸序列，并且所述正向引物具有在所述第二衔接子寡核苷酸内的序列，以及随后在单个步骤中进行引物延伸和pcr反应。具体实施方式术语的定义如本文所用，术语“寡核苷酸”通常是指核苷酸单体单元的聚合物，其是由13至25个核苷酸构成的短的单链核酸分子。在一些情况下，该术语可以指由少于13个核苷酸构成的核酸分子，包括6聚体、7聚体、8聚体、9聚体、10聚体、11聚体和12聚体，或超过25个核苷酸构成的核酸分子。如本文所用，术语“多核苷酸”通常是比如上定义的寡核苷酸更长的核苷酸单元的聚合物，但也可与术语“寡核苷酸”互换使用。多核苷酸包括单链和双链核酸分子两者。如本文所用，术语“rna分子”是指在基因的编码、解码、调节和表达中发挥多种作用的多聚体分子，并且通常与双链dna的区别在于其形成单链，具有连接在核酸单元的戊糖(即核糖)的2’-碳的羟基，并且在其碱基中含有尿嘧啶而不是胸腺嘧啶。rna分子包括编码蛋白质的mrna，构成核糖体的rrna，参与蛋白质翻译的trna，在真核细胞中细胞核的剪接斑点(splicingspeckle)和卡哈尔体(cajalbody)中发现的小rna分子，例如：snrna(小核rna)，其用于处理异质核rna(hnrna)；snorna(小核仁rna)，其用于指导其他rna如rrna、trna和snrna的修饰；sirna(小干扰rna)，这是合成来抑制特定基因的表达的人工rna分子；exrna(细胞外rna或外体rna)，其存在于细胞外分泌的外体中；pirna，其通过与piwi蛋白相互作用形成rna-蛋白质复合物，参与生殖系细胞中逆转录转座子和其他遗传元件的表观遗传和转录后基因沉默；以及微rna(或mirna)，其为约22nt的小rna分子，功能是调节特定基因的表达。如本文所用，术语“待扩增的rna分子”是指在从对象获得的样品中存在的各种rna分子中，待通过pcr扩增进行扩增和检测的rna分子。这种待扩增的rna分子可用作标志物，通过其扩增和检测来确定某种疾病的存在和严重程度，或者对特定治疗剂的敏感性或抗性。如本文所用，术语“有义链”是指双链dna分子的一个单链核酸分子，其取向与读取目的基因的方向相同，并且术语“反义链”是指与有义链互补的另一个单链核酸分子。然而，无论基因被读取的方向如何，其核酸序列首先已知的链也可以定义为“有义链”，而与其互补的链可以定义为“反义链”。如本文所用，术语“pcr(聚合酶链式反应)”或“核酸扩增反应”是指使用热稳定的dna聚合酶扩增某种靶核酸分子的反应。使用除了dna聚合酶还含有能够与靶核酸特异性杂交的寡核苷酸引物(正向引物和反向引物)、脱氧核苷酸(dntp)混合物、二价离子如mg2+等的反应缓冲液进行pcr。通过pcr反应产生的dna分子在本文中称为“扩增产物”。如本文所用，术语“引物延伸”是指非链式反应，其中使用dna聚合酶和与模板核酸互补并且终止于模板核酸的5’末端的引物延伸具有有限长度的模板核酸。通过引物延伸产生的dna分子在本文中称为“延伸产物”。如本文所用，术语“引物”是指与模板dna互补杂交并用于启动pcr反应或引物延伸的寡核苷酸或多核苷酸。使用选自有义链(其方向与读取待扩增的核酸分子的方向相同)的正向引物(或有义引物)或选自反义链(其与有义链互补)的反向引物(或反义引物)进行pcr反应。通常使用单一延伸引物进行引物延伸。如本文所用，术语“衔接子”是指添加到对应于某rna的有义dna的5’末端以特异性识别所述rna的寡核苷酸，或者连接在用于rna逆转录的逆转录引物的5’末端的寡核苷酸。在这种情况下，衔接子可用作引物序列以扩增经延伸的cdna，并且在后一种情况下，衔接子可用于校准当引物仅由能够与rna杂交的核酸序列组成时呈现的低tm值。可以将衔接子设计成除了用于延伸的寡核苷酸引物之外，对待扩增的模板核酸和其他引物没有同源性，因此可以设计成使非特异性扩增最小化。如本文所用，术语“杂交寡核苷酸”是指能够与rna或从rna逆转录的cdna互补杂交的核酸分子。如本文所用，术语“通用引物”是指能够扩增任何种类核酸的引物。可以使用添加用于逆转录和引物延伸的衔接子寡核苷酸的核酸序列来制备通用引物。在这种情况下，优点在于可以使用单一引物组，从而降低试剂盒的生产成本。如本文所用，术语“正向引物”是指以与读取目的基因相同的方向(5’至3’方向)取向的引物。相反，术语“反向引物”是指与读取目的基因的方向相反取向的引物。如本文所用，术语“ct值(阈值循环)”是指用于在指数期范围内实时测量扩增产物的实时pcr的循环数，此时测量的荧光强度显著提高至远高于实时pcr中的基线水平的程度。其反映了靶rna的初始模板的量。本发明的公开内容本发明提供了用于检测rna的试剂盒和方法，其通过在逆转录过程中采用短逆转录引物使得逆转录引物能够在反应溶液中快速扩散，因此可以缩短逆转录反应时间。就此而言，本发明使得可以提高整体pcr反应速率并稳定且快速地检测靶rna。本发明还提供了用于检测rna的试剂盒和方法，其通过使用比逆转录引物长得多的延伸引物对在逆转录过程之后获得的单链cdna进行延伸反应，从而可以确保足够的模板长度用于pcr扩增。根据本发明的一个方面，提供了用于检测rna分子的试剂盒，其包含：短逆转录引物，其由第一杂交寡核苷酸和第一衔接子寡核苷酸构成，所述第一杂交寡核苷酸由与样品中rna分子的poly(a)尾杂交的寡(dt)构成，并且所述第一衔接子寡核苷酸连接至所述第一杂交寡核苷酸的5’末端并且为不与所述rna分子杂交的任何核酸序列；延伸引物，其比所述逆转录引物更长并且由第二杂交寡核苷酸和第二衔接子寡核苷酸构成，所述第二杂交寡核苷酸能够与从所述rna分子逆转录的单链cdna的3’末端部分特异性杂交，该3’末端部分为所述单链cdna的除寡(dt)以外的部分，并且所述第二衔接子寡核苷酸连接至所述第二杂交寡核苷酸的5’末端并且具有不与所述单链cdna杂交的任何核酸序列；以及正向引物，其具有在所述第二衔接子寡核苷酸序列内的序列。在试剂盒中，rna分子可以是小rna分子，其长度为18至180nt，20至90nt，20至70nt，20至50nt，或20至30nt。小rna分子可以是trna、snrna、sirna、exrna、pirna、scarna或mirna。在试剂盒中，样品可以是表皮、毛发、活检组织、尸检组织、血液、血浆、血清、唾液、尿液、粪便、汗液、痰、鼻涕或泪液。试剂盒可以进一步包含具有在第一衔接子寡核苷酸内的核酸序列的反向引物。反向引物可以是通用反向引物，无论待扩增的rna分子的种类如何，其具有恒定核酸序列。然而，在一个优选的实施方案中，试剂盒不包含另外的反向引物。在这种情况下，逆转录反应中使用的短逆转录引物也在pcr反应中起反向引物的作用。即使在pcr反应中未添加反向引物时，逆转录反应物中包含的短逆转录引物也可以用于pcr反应，因为其保留在其中。在试剂盒中，第二衔接子寡核苷酸可包含取决于待扩增的rna分子种类的rna标记寡核苷酸，或者所述rna标记寡核苷酸和独立于待扩增的rna分子种类的具有共有核酸序列的共有寡核苷酸，并且正向引物可以是通用正向引物，其包含选自所述共有寡核苷酸的核酸序列。在试剂盒中，短逆转录引物的长度可为约29至34nt，第一衔接子寡核苷酸的长度可为约17至22nt。在试剂盒中，第二衔接子寡核苷酸的长度可为约32至61nt或约56至63nt，并且其长度可根据待扩增的rna分子种类进行调节。在这种情况下，可以在单个反应中多重检测两个或更多个待扩增的rna。在试剂盒中，第二杂交寡核苷酸的长度可为12至22nt，13至22nt，或14至22nt，并且不与短逆转录引物杂交。根据本发明的另一方面，提供了用于检测rna分子的试剂盒，其包含：用于逆转录的短反向引物，其由第一杂交寡核苷酸和第一衔接子寡核苷酸构成，所述第一杂交寡核苷酸由与在所述rna分子的3’末端的5至9nt的所述rna分子的3’末端部分杂交的核酸序列构成，并且所述第一衔接子寡核苷酸连接至所述第一杂交寡核苷酸的5’末端并且为不与所述rna分子杂交的任何核酸序列；延伸引物，其比用于逆转录的反向引物更长并且由第二杂交寡核苷酸和第二衔接子寡核苷酸构成，所述第二杂交寡核苷酸能够与从所述rna分子逆转录的单链cdna的部分特异性杂交，该部分为所述单链cdna的除对应于所述rna分子的3’末端部分的部分以外的部分，并且所述第二衔接子寡核苷酸连接至所述第二杂交寡核苷酸的5’末端并且具有不与所述单链cdna杂交的任何核酸序列；以及正向引物，其具有在所述第二衔接子寡核苷酸序列内的序列。在试剂盒中，rna分子可以是小rna分子，其长度为18至180nt，20至90nt，20至70nt，20至50nt，或20至30nt。小rna分子可以是trna、snrna、sirna、exrna、pirna、scarna或mirna。试剂盒可以进一步包含具有在第一衔接子寡核苷酸内的核酸序列的反向引物。反向引物可以是通用反向引物，无论待扩增的rna分子种类如何，其具有恒定核酸序列。然而，在一个优选的实施方案中，试剂盒不包含另外的反向引物。在这种情况下，逆转录反应中使用的用于逆转录的短反向引物也在pcr反应中起反向引物的作用。即使在pcr反应中未添加反向引物时，逆转录反应物中包含的用于逆转录的短反向引物也可以用于pcr反应，因为其保留在其中。在试剂盒中，第二衔接子寡核苷酸可包含取决于待扩增的rna分子种类的rna标记寡核苷酸，或者所述rna标记寡核苷酸和独立于待扩增的rna种类的具有共有核酸序列的共有寡核苷酸，并且正向引物可以是通用正向引物，其包含选自所述共有寡核苷酸的核酸序列。在试剂盒中，用于逆转录的短反向引物的长度可为约26至28nt，23至28nt，或18至28nt，并且第一衔接子寡核苷酸的长度可为约20至22nt，17至22nt，或12至22nt。在试剂盒中，第二衔接子寡核苷酸的长度可为约32至61nt或约56至63nt，并且其长度可根据待扩增的rna分子种类进行调节。在这种情况下，可以在单个反应中多重检测两个或更多个待扩增的rna。在试剂盒中，第一杂交寡核苷酸的长度可为6至8nt，更优选为6至7nt，最优选为6nt。第二杂交寡核苷酸的长度可为12至16nt，13至16nt，或14至16nt，并且不与用于逆转录的短反向引物杂交。根据本发明的另一个方面，提供了用于检测rna分子的方法，其包括：通过使用poly(a)聚合酶对从对象获得的样品中的rna分子进行poly(a)加尾，从而制备poly(a)尾rna分子；使用逆转录酶和短逆转录引物对所述poly(a)尾rna分子进行逆转录，所述短逆转录引物由第一杂交寡核苷酸和第一衔接子寡核苷酸构成，所述第一杂交寡核苷酸由与所述poly(a)尾rna分子的poly(a)尾杂交的寡(dt)构成，并且所述第一衔接子寡核苷酸连接至所述第一杂交寡核苷酸的5’末端并且为不与所述poly(a)尾rna分子杂交的任何核酸序列；使所述逆转录酶失活并使通过逆转录产生的dna解链，从而制备从所述poly(a)尾rna分子逆转录的单链cdna；以及将一部分或全部逆转录反应物转移到用于引物延伸和pcr反应的反应器中，所述反应器含有比所述逆转录引物更长的延伸引物、正向引物和热稳定的dna聚合酶，所述延伸引物由第二杂交寡核苷酸和第二衔接子寡核苷酸构成，所述第二杂交寡核苷酸能够与所述单链cdna的3’末端部分特异性杂交，该3’末端部分为所述单链cdna的除寡(dt)以外的部分，并且所述第二衔接子寡核苷酸连接至所述第二杂交寡核苷酸的5’末端并且具有不与所述单链cdna杂交的任何核酸序列，并且所述正向引物具有在所述第二衔接子寡核苷酸内的序列，以及随后在单个步骤中进行引物延伸和pcr反应。在该检测方法中，rna分子可以是小rna分子，其长度为18至180nt，20至90nt，20至70nt，20至50nt，或20至30nt。小rna分子可以是trna、snrna、sirna、exrna、pirna、scarna或mirna。在该检测方法中，样品可以是表皮、毛发、活检组织、尸检组织、血液、血浆、血清、唾液、尿液、粪便、汗液、痰、鼻涕或泪液。在该检测方法中，在pcr反应中可另外使用具有在第一衔接子寡核苷酸内的核酸序列的反向引物。反向引物可以是通用反向引物，无论待扩增的rna分子种类如何，其具有恒定核酸序列。然而，在一个优选的实施方案中，不使用另外的反向引物，并且在这种情况下，逆转录反应中使用的短逆转录引物也在pcr反应中起反向引物的作用。即使在pcr反应中未添加反向引物时，逆转录反应物中包含的短逆转录引物也可以用于pcr反应，因为其保留在其中。本发明人发现，当在pcr反应中另外添加反向引物时，获得了不期望的结果，例如出现非特异性带，而当在pcr反应中未添加反向引物时，获得了更理想的结果。在检测方法中，第二衔接子寡核苷酸可包含取决于待扩增的rna分子种类的rna标记寡核苷酸，或者所述rna标记寡核苷酸和独立于待扩增的rna分子种类的具有共有核酸序列的共有寡核苷酸，并且正向引物可以是通用正向引物，其包含选自所述共有寡核苷酸的核酸序列。在检测方法中，短逆转录引物的长度可为约29至34nt，第一衔接子寡核苷酸的长度可为约17至22nt。在检测方法中，第二衔接子寡核苷酸的长度可为约32至61nt或约56至63nt，并且其长度可根据待扩增的rna分子种类进行调节。在这种情况下，可以在单个反应中多重检测两个或更多个待扩增的rna。在检测方法中，第二杂交寡核苷酸的长度可为12至22nt，13至22nt，或14至22nt，并且不与短逆转录引物杂交。根据本发明的另一个方面，提供了用于检测rna分子的方法，其包括：使用逆转录酶和用于逆转录的短反向引物对样品中的rna分子进行逆转录，所述用于逆转录的短反向引物由第一杂交寡核苷酸和第一衔接子寡核苷酸构成，所述第一杂交寡核苷酸由与在所述rna分子的3’末端的5至9nt的所述rna分子的3’末端部分杂交的核酸序列构成，并且所述第一衔接子寡核苷酸连接至所述第一杂交寡核苷酸的5’末端并且为不与所述rna分子杂交的任何核酸序列；使所述逆转录酶失活并使通过逆转录产生的dna解链，从而制备从所述rna分子逆转录的单链cdna；以及将一部分或全部逆转录反应物转移到用于引物延伸和pcr反应的反应器中，所述反应器含有比所述用于逆转录的反向引物更长的延伸引物、正向引物和热稳定的dna聚合酶，所述延伸引物由第二杂交寡核苷酸和第二衔接子寡核苷酸构成，所述第二杂交寡核苷酸能够与从所述rna分子逆转录的单链cdna的部分特异性杂交，该部分为所述单链cdna的除对应于所述rna分子的3’末端部分的部分以外的部分，并且所述第二衔接子寡核苷酸连接至所述第二杂交寡核苷酸的5’末端并且具有不与所述单链cdna杂交的任何核酸序列，并且所述正向引物具有在所述第二衔接子寡核苷酸内的序列，以及随后在单个步骤中进行引物延伸和pcr反应。在检测方法中，rna分子可以是小rna分子，其长度为18至180nt，20至90nt，20至70nt，20至50nt，或20至30nt。小rna分子可以是trna、snrna、sirna、exrna、pirna、scarna或mirna。在检测方法中，样品可以是表皮、毛发、活检组织、尸检组织、血液、血浆、血清、唾液、尿液、粪便、汗液、痰、鼻涕或泪液。还可以使用检测方法，具有在第一衔接子寡核苷酸内的核酸序列的反向引物。反向引物可以是通用反向引物，无论待扩增的rna分子种类如何，其具有恒定核酸序列。然而，在一个优选的实施方案中，试剂盒不包含另外的反向引物。在这种情况下，逆转录反应中使用的用于逆转录的短反向引物也在pcr反应中起反向引物的作用。即使在pcr反应中未添加反向引物时，逆转录反应物中包含的用于逆转录的短反向引物也可以用于pcr反应中，因为其保留在其中。本发明人发现，当在pcr反应中另外添加反向引物时，获得了不期望的结果，例如出现非特异性带，而当在pcr反应中未添加反向引物时，获得了更理想的结果。在检测方法中，第二衔接子寡核苷酸可包含取决于待扩增的rna分子种类的rna标记寡核苷酸，或者所述rna标记寡核苷酸和独立于待扩增的rna分子种类的具有共有核酸序列的共有寡核苷酸，并且正向引物可以是通用正向引物，其包含选自所述共有寡核苷酸的核酸序列。在检测方法中，用于逆转录的短反向引物的长度可为约26至28nt，23至28nt，或18至28nt，并且第一衔接子寡核苷酸的长度可为约20至22nt，17至22nt，或12至22nt。在检测方法中，第二衔接子寡核苷酸的长度可为约32至61nt或约56至63nt，并且其长度可根据待扩增的rna分子种类进行调节。在这种情况下，可以在单个反应中多重检测两个或更多个待扩增的rna。在检测方法中，第一杂交寡核苷酸的长度可为6至8nt，更优选的长度是6至7nt，最优选的长度是6nt。第二杂交寡核苷酸的长度可为12至16nt，13至16nt，或14至16nt，并且不与用于逆转录的短反向引物杂交。除非本文另有说明，否则由多个寡核苷酸和/或多核苷酸构成的核酸分子从5’末端到3’末端读取。在下文中，将参考附图更详细地描述根据本发明的一个实施方案的试剂盒和方法。图1是示出根据本发明一个实施方案使用poly(a)聚合酶检测小rna的方法的示意图。如图1所示，示例性rna分子101可以是非常短的核酸分子，例如mirna，其长度为约20至30nt。与mrna不同，mirna101没有poly(a)尾。因此，当poly(a)聚合酶和atp混合并与含有mirna101的样品反应时，poly(a)尾102连接至mirna101以产生poly(a)尾mirna(第一反应)。当将由以下构成的逆转录引物105添加至poly(a)尾mirna时，则第一杂交寡核苷酸103与poly(a)尾互补结合：具有不与待扩增的rna分子杂交的核酸的第一衔接子寡核苷酸104，和作为第一杂交寡核苷酸103的聚dt。当将逆转录酶和dntp混合物添加至mirna复合物并进行逆转录反应时，产生靶mirna的逆转录产物110，其由第一衔接子寡核苷酸104、第一杂交寡核苷酸103和反义链cdna111组成(第二反应)。然后，使逆转录酶失活并使dna解链，从而确保逆转录过程终止，从而制备单链cdna。然后，使用比逆转录引物长得多的延伸引物进行延伸反应，以确保用于pcr扩增的足够的模板长度。然而，通过使用比逆转录引物长得多的延伸引物，对单链cdna而非异源双链体cdna进行延伸反应，以防止延伸引物的反应性降低。将部分或全部逆转录产物110转移至第二反应器，并与延伸引物120(长于逆转录引物)杂交，该引物在3’末端具有第二杂交寡核苷酸122，其具有与反义链cdna互补的序列，并且在5’末端具有第二衔接子寡核苷酸121，其具有不与mirna110和反义链cdna111二者杂交的任意核酸序列。然后，用dna聚合酶进行引物延伸，从而产生延伸的双链cdna140(第三反应)。由于可以根据每个靶rna调节第二衔接子寡核苷酸的长度，因此每个靶rna均可以通过不同长度的其相应的第二衔接子寡核苷酸进行标记，从而使得可以通过多重分析来检测多种rna。使用延伸的双链cdna140作为模板，使用具有与第一衔接子寡核苷酸相同的核酸序列的反向引物131和具有第二衔接子寡核苷酸的5’末端的核酸序列的正向引物132进行pcr反应，从而指数扩增延伸的双链cdna140(第四反应)。引物延伸反应(第三反应)和pcr反应(第四反应)可以不依次进行，而是可以在单个反应中进行。此外，可以使用第二反应中使用的逆转录引物105代替反向引物131。在这种情况下，当将部分或全部第二反应产物转移到反应器用于引物延伸和pcr反应时，保留在第二反应产物中的逆转录引物105可以在第四反应中重复使用，而不是在第四反应中单独添加逆转录引物105。图2是示出根据本发明的一个实施方案使用rna特异性引物(逆转录引物)检测短rna的方法的示意图。如图2所示，rna特异性反向引物136(短逆转录引物)与rna杂交，然后使用逆转录酶进行逆转录，从而产生反义链cdna137(第一步反应)，该引物在3’末端具有能够特异性结合rna101的3’-末端的5-7-nt(优选6-nt)部分的第一杂交寡核苷酸134，并且在5’末端具有与第一杂交寡核苷酸连接并且具有不与靶rna杂交的任意核酸序列的第一衔接子寡核苷酸135。使逆转录酶失活并使dna解链，确保逆转录过程终止，从而制备单链cdna。然后，使用比逆转录引物长得多的延伸引物进行延伸反应，以确保足够的模板长度用于pcr扩增。然而，通过使用比逆转录引物长得多的延伸引物对单链cdna而非异源双链体cdna进行延伸反应，以防止延伸引物的反应性降低。当使用延伸引物143对反义链cdna137进行引物延伸时，则cdna在两个方向上延伸，从而产生包含与rna特异性引物136和第二衔接子寡核苷酸142互补的链的延伸产物，该引物在3’末端具有能够特异性结合反义链cdna137的一部分(约16nt长)而排除对应于rna101的上述6nt部分的另一部分的第二杂交寡核苷酸138，并且在5’端具有与第二杂交寡核苷酸138连接并且不与反义链cdna137和rna101二者互补结合的第二衔接子寡核苷酸142。此处，第二衔接子寡核苷酸142在其5’末端包含5’-区域141，其是通用引物区域，通常用于所有rna检测试剂盒，并且第二衔接子寡核苷酸142的剩余3’-区域139具有不同的序列和/或长度，这取决于rna的种类，从而使得能够通过多重分析同时检测多种rna。在引物延伸反应完成后，使用rna特异性引物136和对应于5’-区域141的正向引物144通过pcr在同一试管中产生pcr产物145(第二步反应)。正向引物144具有第二衔接子寡核苷酸5’-末端的核酸序列内的序列。如果第二衔接子寡核苷酸的5’末端的序列被设计为恒定而与rna的种类无关，则正向引物144成为通用正向引物。逆转录反应中的逆转录引物可以作为rna特异性引物136使用。逆转录引物可以在第二步反应中进一步添加，或者保留在第一步反应的产物中的逆转录引物也可以用于第二步反应而无需进一步添加逆转录引物。pcr产物145可以在pcr反应期间通过实时pcr检测，并且可以在pcr反应完成后通过琼脂糖凝胶电泳等显示。有利效果根据本发明一个实施方案的用于检测rna的试剂盒和方法使用短逆转录引物，因此可以缩短逆转录反应时间。就此而言，本发明的试剂盒和方法使得可以提高总体pcr反应速率并快速检测rna。此外，试剂盒和方法可以通过在引物延伸步骤中使用比逆转录引物长得多的延伸引物来制备具有足够长度的模板用于pcr扩增。具体地，该试剂盒和方法通过在逆转录过程中采用短逆转录引物使得逆转录引物能够在反应溶液中快速扩散，因此可以缩短逆转录反应时间。就此而言，试剂盒和方法使得可以提高总体pcr反应速率，降低ct值并稳定且快速地检测rna。此外，试剂盒和方法可以通过在逆转录过程后使用比逆转录引物长得多的延伸引物对获得的单链cdna进行延伸反应来确保足够的模板长度用于pcr扩增。此外，试剂盒和方法显示出检测rna的高精确度，因为在逆转录步骤中产生的cdna在实时pcr步骤中进一步验证，然后合成最终的扩增产物。此外，根据试剂盒和方法，可以通过调整长延伸引物的长度来标记每个靶rna，因此该试剂盒作为能够通过多重分析同时检测多个rna的临床诊断产品具有高度竞争性。因此，试剂盒和方法可以在不使用昂贵设备的情况下以快速且准确的方式检测某种mirna，并且可以进行能够同时检测多种mirna的多重分析。例如，试剂盒和方法可以非常有效地用于诊断多种疾病，包括癌症，并确定这些疾病的预后。应该理解，本发明的范围不受上述效果的限制。附图简述本领域技术人员将从本发明的实施方案的描述并参考以下附图清楚地理解本发明的上述及其他目的和特征。图1是示出根据本发明的一个实施方案使用poly(a)聚合酶检测mirna的方法的示意图。图2是示出根据本发明的一个实施方案使用mirna特异性逆转录引物检测mirna的方法的示意图。图3至10分别示出了通过mirna检测试剂盒和方法使用本发明实施例中的poly(a)聚合酶和寡dt引物扩增mir-532、mir-196b、mir-362、mir-29c、mir-106b、mir-200c、mir-127和mir-145的结果。在图3至10的每幅图中，顶部是示出荧光强度变化作为扩增循环数之函数的图；中部是示出荧光发射率的变化作为随温度之函数的图；底部左侧的表格示出了样品的种类、荧光检测的阈值和熔点；底部的右侧是示出1.5％琼脂糖凝胶电泳结果的照片。图11至18分别示出了通过mirna检测试剂盒和方法使用本发明实施例中的mirna特异性逆转录引物扩增mir-532、mir-196b、mir-362、mir-29c、mir-106b、mir-200c、mir-127和mir-145的结果。在图11至18的每幅图中，左侧的顶部是示出荧光强度的变化作为扩增循环数之函数的图；左侧的中部是示出荧光发射率的变化作为温度之函数的图；左侧底部的表格示出了样品的种类、荧光检测的阈值和熔点；右侧是示出1.5％琼脂糖凝胶电泳结果的照片。图19至26示出了通过使用比较例中的mirna检测试剂盒(qiagen)分别扩增mir-532、mir-196b、mir-362、mir-29c、mir-106b、mir-200c、mir-127和mir-145的结果。在图19至26的每幅图中，顶部是示出荧光强度变化作为扩增循环数之函数的图；中间是示出荧光发射率的变化作为温度之函数的图；底部左侧的表格示出了样品的种类、荧光检测的阈值和熔点；底部的右侧是示出1.5％琼脂糖凝胶电泳结果的照片。图27是示出使用根据本发明的一个实施方案的mirna检测试剂盒和商业mirna检测试剂盒(qiagen)的每一个进行mirnalet-7e的实时pcr扩增的结果的图。图28是示出通过使用根据本发明的一个实施方案的mirna检测试剂盒和商业mirna检测试剂盒(qiagen)中的每一个进行mirnahsalet-7e的实时pcr而获得的pcr扩增产物的测序结果的图。图29是示出使用根据本发明一个实施方案的mirna检测试剂盒，对作为模板的连续稀释的mirna进行实时pcr的结果中模板拷贝数与检测阈值(cq)循环之间的相关性的图。图30是示出通过根据本发明的一个实施方案的mirna检测试剂盒定量测量cal27细胞和hsc3细胞中mir-200的三种亚型(mir-200a、mir-200b和mir-200c)的表达水平的结果的图。图31是示出根据本发明一个实施方案的mirna检测试剂盒的实时pcr结果的一组图，其取决于在引物延伸和实时pcr反应(第二步反应)中是否添加了逆转录引物。图32是比较使用根据本发明一个实施方案的mirna检测试剂盒获得的ct值与使用商业mirna检测试剂盒(qiagen)获得的ct值的一组图。实施例在下文中，将参考实施例和实验例详细描述本发明。然而，本发明可以以不同的形式实施，并且不应被解释为限于以下公开的实施例。相反，提供这些实施例是为了使本公开内容变得全面和完整，并且向本领域技术人员充分传达本发明的范围。因此，应该理解，提供这些实施例和实验例仅仅是为了详细解释本发明，而不旨在限制或限定本发明的范围。因此，本领域技术人员从本发明的详细描述和实施例中可容易预期的那些被理解为落入本发明的范围内。本文引用的参考文献通过引用并入本文。实施例：通过本发明的试剂盒检测rna根据本发明的一个实施方案，本发明人通过以下步骤检测多个mirna：用poly(a)对每个mirna进行加尾，然后使用寡dt引物进行逆转录，并在单独的步骤中使用具有mirna特异性序列的延伸引物对含有逆转录cdna的逆转录产物进行双向引物延伸和实时pcr。根据本发明的另一个实施方案，本发明人使用以下检测多个mirna：mirna特异性引物(短逆转录引物)，其具有对mirna的3’末端具有特异性的6-nt核酸序列；和延伸引物(长于逆转录引物)，其具有除6-nt核酸序列以外的mirna特异性序列，而不使用寡(dt)引物。经检测的mirna显示在下表1中。在使用poly(a)聚合酶进行的检测方法中，在42℃下进行poly(a)加尾和逆转录60分钟，然后通过在70℃下加热10分钟使逆转录酶失活。通过在95℃下将dna解链15分钟，然后进行以下40个循环来进行引物延伸和pcr：每个循环由在94℃下持续15秒，在55℃下持续30秒和在70℃下持续30秒组成。接下来，通过在95℃下加热10秒，然后以0.5℃/5秒的速率从65℃加热到95℃来测量解链曲线。在使用mirna特异性引物进行的检测方法中，在42℃下进行逆转录60分钟，然后通过在70℃下加热10分钟使逆转录酶失活。通过在95℃下将dna解链15分钟，然后进行以下40个循环来进行引物延伸和pcr：每个循环由在95℃下持续10秒和在60℃下持续40秒组成。接下来，通过在95℃下加热10秒，然后以0.5℃/5秒的速率从65℃加热到95℃来测量解链曲线。此外，逆转录和实时pcr反应中使用的试剂量示于下表2和3中。使用bio-rad实时pcr系统(bio-radcfx96touchreal-timepcr系统)进行pcr反应，并使用1.5％琼脂糖凝胶电泳带模型分析是否实际实现pcr反应。表1：本发明的实施例表2：逆转录中使用的试剂量样品体积终浓度2x反应缓冲液10ul逆转录酶(addscript)1ul1udntp混合物(10mm)2μl1mm逆转录引物(80μm)1μl4μm模板(来自a549细胞的总rna，1μg/μl)1μl1μg蒸馏水5μl总体积20μl表3：实时pcr中使用的试剂量样品体积终浓度2xsybrgreenpcrmaster混合物10μl1x延伸引物(200nm)1μl10nm正向引物(2μm)1μl100nm逆转录反应产物1μl蒸馏水7μl总体积20μl比较例在比较例中，本发明人使用商业mirna检测试剂盒(qiagen)扩增mirna，以比较本发明的mirna检测试剂盒与商业mirna检测试剂盒(qiagen)的性能。表4：比较例比较例待扩增的mirna检测方法1mir-532使用锚定寡dt衔接子2mir-196b使用锚定寡dt衔接子3mir-362使用锚定寡dt衔接子4mir-29c使用锚定寡dt衔接子5mir-106b使用锚定寡dt衔接子6mir-200c使用锚定寡dt衔接子7mir-127使用锚定寡dt衔接子8mir-145使用锚定寡dt衔接子分析结果如图3至26所示。从中可以看出，根据本发明的一个实施方案的mirna检测试剂盒和方法(图3至18)使得能够比商业mirna检测试剂盒(qiagen)(图19至26)更清楚和准确地检测mirna。实验例1：pcr扩增产物的测序在该实验例中，使用本发明的方法扩增来自a549细胞的mirnahsalet-7e，所述方法在上述实施方案的方法中不使用poly(a)聚合酶，并且商业mirna检测试剂盒作为比较例。对pcr扩增产物进行测序。具体地，在与上述实施例中所述相同的条件下，使用以下进行逆转录和实时pcr：具有由seqidno：20表示的核酸序列的逆转录引物；具有由seqidno：21表示的核酸序列的延伸引物；和具有由seqidno：22表示的核酸序列的正向引物。结果，如图27所示，当使用qiagen实时pcr试剂盒作为比较例时，在阴性对照中观察到非特异性扩增产物，而当使用根据本发明的一个实施方案的mirna检测试剂盒时未观察到非特异性扩增。此外，如图28所示，pcr扩增产物的测序结果表明，使用qiagenmirna检测试剂盒获得的扩增产物的核苷酸序列未能被正确确认，使得难以确认靶mirna是否被正确扩增，而使用根据本发明的一个实施方案的mirna检测试剂盒获得的扩增产物可以精确测序。实验例2：pcr扩增产物的校准曲线的确认在该实验例中，为了检查样品中mirna的水平是否可以使用根据本发明一个实施方案的mirna检测试剂盒准确定量，对具有预定浓度的连续稀释的mirna样品进行实时pcr反应，然后测量检测阈值循环(ca)。具体地，使用mir-145作为靶mirna，并且在与上述实施例中所述相同的条件下进行逆转录和pcr。结果，如图29所示，证实了cq从非常低的浓度开始表现出精确的指数关系，并且mirna的拷贝数和cq的对数值之间的相关性如此之高以至于其r2值达到0.9979。这些结果表明，本发明的试剂盒和方法不仅可用于检测mirna，还可用于mirna的精确定量。此外，图32是示出使用根据本发明一个实施方案的mirna检测试剂盒获得的ct值与使用商业mirna检测试剂盒(qiagen)获得的ct值之间的比较的图(人a549肺癌细胞系的实时pcr结果)。如在图32的图中可以看出的那样，在短时间内商业mirna检测试剂盒(qiagen)的ct值变化且不稳定，表明实时pcr的反应时间变得更长并且因此其反应性降低(参见图32(a))，而在10分钟后根据本发明的一个实施方案的mirna检测试剂盒的ct值稳定，表明实时pcr的反应时间变得更短并且其反应性提高(参见图32(b))。因此，根据本发明的rna检测试剂盒和方法，通过使用短逆转录引物缩短了逆转录反应时间，因此可以提高总体pcr反应速率，使得可以快速检测rna。此外，根据本发明的rna检测试剂盒和方法，可以通过使用比引物延伸步骤中的逆转录引物长得多的延伸引物制备具有足够长度的模板用于pcr反应。实验例3：mirna亚型的分类对于mirna，即使相同的mirna也显示不同的亚型，具有略微不同的序列，这取决于mirna来源的个体或细胞。本发明人检查了根据本发明一个实施方案的mirna检测试剂盒是否可以对mirna的亚型进行分类。具体地，通过trizol试剂从cal27细胞(atcccrl-2095)和hsc-3细胞中分离总rna，然后在42℃下使用逆转录引物(seqidno：23至25)进行逆转录持续60分钟，每个逆转录引物在3’-末端包含第一杂交寡核苷酸，其与mir-200a、mir-200b和mir-200c的每一个的3’-末端的6-nt部分互补结合，并且在5’-末端包含第一衔接子寡核苷酸。接下来，将1μl各逆转录产物转移到含有上表3中所示的实时pcr反应溶液的反应器中，然后通过在70℃下加热10分钟使酶失活。使用bioradcfx96touch实时pcr系统，通过将dna在95℃下解链15分钟，然后进行以下40个循环来进行引物延伸和pcr，每个循环由在95℃下持续10秒和在60℃下持续40秒组成。接下来，通过在95℃下加热10秒，然后以0.5℃/5秒的速率从65℃加热到95℃来测量解链曲线。使用以下进行实时pcr反应：对相应的mirna具有特异性的各延伸引物(seqidno：26至28)，和具有延伸引物的5’末端共有序列的通用正向引物(seqidno：22)。结果，如图30所示，证实cal27细胞和hsc3细胞均表达mir-200a和mir-200b，但在两种细胞中未检测到mir-200c。这些结果与使用abimicrorna测定试剂盒获得的结果非常相似，表明根据本发明的一个实施方案的试剂盒可以提供可靠的结果。实验例4：根据在实时pcr反应中是否添加反向引物的结果此外，本发明人在单个步骤而非分离的步骤中进行引物延伸和实时pcr。使用由以下构成的引物对进行实时pcr：具有延伸引物的5’末端的核酸序列的正向引物，和作为逆转录中使用的逆转录引物的反向引物。然而，由于反向引物已用于逆转录反应(第一步反应)并保留在添加至引物延伸和实时pcr反应(第二步反应)的逆转录反应物(第一步反应产物)中，因此认为即使反向引物未单独添加至引物延伸和实时pcr反应(第二步反应)，第二步反应也可以正常进行。因此，检查了以下两种条件对实时pcr的影响：在第二步反应中不添加逆转录引物的一种条件；和在第二步反应中单独添加逆转录引物的另一种条件。具体地，使用mir-16作为待扩增的rna，并且使用a549肺癌细胞系作为细胞。在第二步反应中未添加逆转录引物的条件下，在上述表2和3中所示的条件下进行逆转录、引物延伸和实时pcr反应。在第二步反应中单独添加逆转录引物的条件下，在添加1μl逆转录引物(2μm)并将蒸馏水减少1μl体积的条件下进行第二步反应。使用具有由seqidno：29表示的核酸序列的寡核苷酸作为逆转录引物，并且使用具有由seqidno：30表示的核酸序列的寡核苷酸作为mir-16特异性延伸引物用于引物延伸和实时pcr，使用具有由seqidno：22表示的核酸序列的通用正向引物作为正向引物。逆转录步骤和引物延伸以及实时pcr步骤在与上述实验例2中所述相同的条件下进行。结果，如图31所示，当在第二步反应中添加逆转录引物时，即使在阴性对照中也检测到非特异性反应产物，但是当在第二步反应中未添加逆转录引物时，未检测到该非特异性反应产物。因此，可以看出，当在第二步反应中不添加逆转录引物时，可以获得更理想的结果。尽管已经参考实施方案描述了本发明，但是本发明不限于这些实施方案。本领域技术人员将理解，在不脱离本发明的精神和范围的情况下，可以进行多种修改和变更。<110>heimbiotekinc.<120>用于检测rna分子的试剂盒和方法<130>op17-0008pct<150>pct/kr2016/007971<151>2016-07-21<160>30<170>kopatentin3.0<210>1<211>29<212>dna<213>人工序列<220><223>具有polya加尾的用于逆转录的引物<400>1gcaccaccactgattagtttttttttttt29<210>2<211>18<212>dna<213>人工序列<220><223>hsa-mir-532的用于逆转录的引物和用于pcr的反向引物<400>2gcgagcatgcagacggtc18<210>3<211>20<212>dna<213>人工序列<220><223>hsa-mir-196b的用于逆转录的引物和用于pcr的反向引物<400>3gctagtcatgccagcccaac20<210>4<211>19<212>dna<213>人工序列<220><223>hsa-mir-362的用于逆转录的引物和用于pcr的反向引物<400>4gcgagcatcgcagactcac19<210>5<211>19<212>dna<213>人工序列<220><223>hsa-mir-29c的用于逆转录的引物和用于pcr的反向引物<400>5gcgagcatcgcagtaaccg19<210>6<211>19<212>dna<213>人工序列<220><223>hsa-mir-106b的用于逆转录的引物和用于pcr的反向引物<400>6gcgagcactgcacatctgc19<210>7<211>20<212>dna<213>人工序列<220><223>hsa-mir-200c的用于逆转录的引物和用于pcr的反向引物<400>7gcgagcacttcacgtccatc20<210>8<211>18<212>dna<213>人工序列<220><223>hsa-mir-127的用于逆转录的引物和用于pcr的反向引物<400>8gcgacgatgcagagccaa18<210>9<211>20<212>dna<213>人工序列<220><223>hsa-mir-145的用于逆转录的引物和用于pcr的反向引物<400>9gcgagtccgcatagagggat20<210>10<211>77<212>dna<213>人工序列<220><223>hsa-mir-532的延伸引物<400>10gcacctccaggaccaatcttgtagccaggatcttgccatcctatggaactgcctcggtga60gcatgccttgagtgtag77<210>11<211>77<212>dna<213>人工序列<220><223>hsa-mir-196b的延伸引物<400>11gcacctccaggaccaatcttgtagccaggatcttgccatcctatggaactgcctcggtga60gtaggtagtttcctgtt77<210>12<211>79<212>dna<213>人工序列<220><223>hsa-mir-362的延伸引物<400>12gcacctccaggaccaatcttgtagccaggatcttgccatcctatggaactgcctcggtga60gaatccttggaacctaggt79<210>13<211>77<212>dna<213>人工序列<220><223>hsa-mir-29c的延伸引物<400>13gcacctccaggaccaatcttgtagccaggatcttgccatcctatggaactgcctcggtga60gtagcaccatttgaaat77<210>14<211>76<212>dna<213>人工序列<220><223>hsa-mir-106b的延伸引物<400>14gcacctccaggaccaatcttgtagccaggatcttgccatcctatggaactgcctcggtga60gtaaagtgctgacagt76<210>15<211>78<212>dna<213>人工序列<220><223>hsa-mir-200c的延伸引物<400>15gcacctccaggaccaatcttgtagccaggatcttgccatcctatggaactgcctcggtga60gtaatactgccgggtaat78<210>16<211>77<212>dna<213>人工序列<220><223>hsa-mir-127的延伸引物<400>16gcacctccaggaccaatcttgtagccaggatcttgccatcctatggaactgcctcggtga60gtcggatccgtctgagc77<210>17<211>78<212>dna<213>人工序列<220><223>hsa-mir-145的延伸引物<400>17gcacctccaggaccaatcttgtagccaggatcttgccatcctatggaactgcctcggtga60ggtccagttttcccagga78<210>18<211>18<212>dna<213>人工序列<220><223>polya加尾mirna的通用正向引物<400>18gcacctccaggaccaatc18<210>19<211>17<212>dna<213>人工序列<220><223>polya加尾mirna的通用反向引物<400>19gcaccaccactgattag17<210>20<211>21<212>dna<213>人工序列<220><223>hsa-let-7e-5p的rt引物<400>20tgcagggtggcagccaactat21<210>21<211>72<212>dna<213>人工序列<220><223>hsa-let-7e-5p的延伸引物<400>21taagttccgctgtgtgccgcatctcaccgggcggcgctttgagcacggtgtgacggtgag60gtaggaggttgt72<210>22<211>20<212>dna<213>人工序列<220><223>通用正向引物<400>22taagttccgctgtgtgccgc20<210>23<211>21<212>dna<213>人工序列<220><223>mir-200a的rt引物<400>23tgcagggtggcagccgctaca21<210>24<211>21<212>dna<213>人工序列<220><223>mir-200b的rt引物<400>24tgcagggtggcagccactact21<210>25<211>21<212>dna<213>人工序列<220><223>mir-200c的rt引物<400>25tgcagggtggcagccctacct21<210>26<211>72<212>dna<213>人工序列<220><223>mir-200a的延伸引物<400>26taagttccgctgtgtgccgcatctcaccgggcggcgctttgagcacggtgtgacggtaac60actgtctggtaa72<210>27<211>72<212>dna<213>人工序列<220><223>mir-200b的延伸引物<400>27taagttccgctgtgtgccgcatctcaccgggcggcgctttgagcacggtgtgacggtaat60actgcctggtaa72<210>28<211>73<212>dna<213>人工序列<220><223>mir-200c的延伸引物<400>28taagttccgctgtgtgccgcatctcaccgggcggcgctttgagcacggtgtgacggtaat60actgccgggtaat73<210>29<211>21<212>dna<213>人工序列<220><223>mir-16的rt引物<400>29tgcagggtggcagcccgccaa21<210>30<211>72<212>dna<213>人工序列<220><223>mir-16的延伸引物<400>30taagttccgctgtgtgccgcatctcaccgggcggcgctttgagcacggtgtgacggtagc60agcacgtaaata72当前第1页12