人肝前体细胞的制备方法与流程
本发明涉及人肝前体细胞的制备方法。
背景技术：
针对严重的肝疾病的有效的治疗方法现在仅为肝移植，但绝对的供体不足成为问题。为了代替肝移植，迄今为止持续进行了由ips细胞分化诱导肝细胞并用于移植治疗的尝试。
然而，由于ips细胞具有分化全能性和高的增殖能力，因此，也有随着对免疫缺陷小鼠的移植而形成畸胎瘤的报告，在由ips细胞制作肝细胞时即使稍微混入未分化ips细胞时，产生在移植后形成肿瘤的危险性。另外，由于使用ips细胞来向肝脏等的内胚叶细胞进行高效分化的诱导法尚未确立，现状是，不可能由ips细胞制作能够代替肝功能程度的肝细胞。
针对这种情况，在成体肝脏内极少数存在的肝前体细胞也开始被认为是可利用的细胞来源。另外，最近的研究表明：在慢性肝炎时，成熟肝细胞被重编程为具有分化为肝细胞和胆管上皮细胞的双分化能力的前体细胞(非专利文献1～4)。
现有技术文献
非专利文献
非专利文献1:yangerk.et.al.,genes&development,pp.719-724,27,2013
非专利文献2:tanimizun.et.al.,journalofbiologicalchemistry,pp.7589-7598,289(11),2014
非专利文献3:yimlamaid.et.al.,cell,pp.1324-1338,157,2014
非专利文献4:tarlowb.d.et.al.,cellstemcell,pp.605-618,15,2014
技术实现要素：
本发明的目的在于提供在生物体外将人成熟肝细胞重编程为具有自我复制能力的人肝前体细胞的方法。
本发明人等为了解决本课题反复进行了深入研究，结果发现通过在生物体外将人成熟肝细胞在含有血清、a-83-01(tgf-β信号抑制剂)和chir99021(gsk3抑制剂)的培养基中进行培养，从而能够重编程为具有自我复制能力的人肝前体细胞，以至完成了本发明。
即，本发明提供以下所示的人肝前体细胞的制备方法。
项1.一种人肝前体细胞的制备方法，包括将人成熟肝细胞在含有血清、a-83-01和chir99021的培养基中进行培养。
项2.根据项1所述的人肝前体细胞的制备方法，其中，所述人成熟肝细胞来自婴幼儿。
项3.根据项1或2所述的人肝前体细胞的制备方法，其中，所述血清为胎牛血清。
项4.一种人肝前体细胞，是通过将人成熟肝细胞在含有血清、a-83-01和chir99021的培养基中进行培养而制备的。
项5.一种成熟肝细胞，是由项4所述的人肝前体细胞诱导而得的。
项6.一种被检物质的筛选方法，包括使用项5所述的成熟肝细胞。
项7.一种肝炎病毒的培养方法，包括使用项5所述的成熟肝细胞。
项8.一种人肝脏模型动物，是将项5所述的成熟肝细胞移植于非人哺乳动物而得的。
项9.一种试剂盒，是用于使用人肝前体细胞或成熟肝细胞来评价被检物质的代谢和/或肝毒的试剂盒，
包含人肝前体细胞或成熟肝细胞，所述人肝前体细胞是通过将人成熟肝细胞在含有血清、a-83-01和chir99021的培养基中进行培养而制备的，所述成熟肝细胞是由该人肝前体细胞诱导而得的。
根据本发明，能够提供在生物体外将人成熟肝细胞重编程为具有自我复制能力的肝前体细胞的方法。
附图说明
图1是表示将人成熟肝细胞在ac-f培养基(a)、yac-f培养基(b)或yac培养基(c)中进行培养的结果的相位差显微镜照片。
图2是表示将人成熟肝细胞在ac-f培养基中进行培养的结果的相位差显微镜照片。
图3是表示将人成熟肝细胞在ac-f培养基或fbs培养基中进行培养的结果的相位差显微镜照片。
图4是表示将人成熟肝细胞在ac-f培养基或fbs培养基中进行培养的结果的相位差显微镜照片。
图5是表示对cdna-upa/scid小鼠给予肝前体细胞后的血中人特异性白蛋白的经时变化的图表。
图6是表示对cdna-upa/scid小鼠给予肝前体细胞70天后的内侧右叶中的人cyp2c9的表达的免疫染色照片。
图7是表示对cdna-upa/scid小鼠给予肝前体细胞70天后的内侧左叶中的人cyp2c9的表达的免疫染色照片。
图8是表示对tk-nog小鼠给予肝前体细胞后的血清中人特异性白蛋白的经时变化的图表。
图9是表示对tk-nog小鼠给予肝前体细胞60天后的肝脏中的人cyp2c9的表达的免疫染色照片。
图10是表示对tk-nog小鼠给予肝前体细胞60天后的肝脏中的人cyp2c9的表达的免疫染色照片。
图11是表示本发明的肝前体细胞或由肝前体细胞分化而得的成熟肝细胞(分化成熟肝细胞)中的代谢酶cyp1a2的活性的图表。
图12是表示由本发明的肝前体细胞或由肝前体细胞分化而得的成熟肝细胞(分化成熟肝细胞)中的有无利用奥美拉唑的诱导下的代谢酶cyp1a2的活性比率的图表。
图13是表示本发明的肝前体细胞或由肝前体细胞分化而得的成熟肝细胞(分化成熟肝细胞)中的代谢酶cyp3a4的活性的图表。
图14是表示本发明的肝前体细胞或由肝前体细胞分化而得的成熟肝细胞(分化成熟肝细胞)中的有无利用苯巴比妥的诱导下的代谢酶cyp3a4的活性比率的图表。
图15是表示本发明的肝前体细胞或由肝前体细胞分化而得的成熟肝细胞(分化成熟肝细胞)中的alb的基因表达量的图表。
图16是表示本发明的肝前体细胞或由肝前体细胞分化而得的成熟肝细胞(分化成熟肝细胞)中的tat的基因表达量的图表。
图17是表示本发明的肝前体细胞或由肝前体细胞分化而得的成熟肝细胞(分化成熟肝细胞)中的tdo2的基因表达量的图表。
图18是表示本发明的肝前体细胞或由肝前体细胞分化而得的成熟肝细胞(分化成熟肝细胞)中的ttr的基因表达量的图表。
图19是表示本发明的肝前体细胞或由肝前体细胞分化而得的成熟肝细胞(分化成熟肝细胞)中的g6pc的基因表达量的图表。
图20是表示本发明的肝前体细胞或由肝前体细胞分化而得的成熟肝细胞(分化成熟肝细胞)中的ntcp的基因表达量的图表。
图21是表示本发明的肝前体细胞或由肝前体细胞分化而得的成熟肝细胞(分化成熟肝细胞)中的cyp1a2的基因表达量的图表。
图22是表示本发明的肝前体细胞或由肝前体细胞分化而得的成熟肝细胞(分化成熟肝细胞)中的cyp2b6的基因表达量的图表。
图23是表示本发明的肝前体细胞或由肝前体细胞分化而得的成熟肝细胞(分化成熟肝细胞)中的cyp2c9的基因表达量的图表。
图24是表示本发明的肝前体细胞或由肝前体细胞分化而得的成熟肝细胞(分化成熟肝细胞)中的cyp2c19的基因表达量的图表。
图25是表示本发明的肝前体细胞或由肝前体细胞分化而得的成熟肝细胞(分化成熟肝细胞)中的cyp2d6的基因表达量的图表。
图26是表示本发明的肝前体细胞或由肝前体细胞分化而得的成熟肝细胞(分化成熟肝细胞)中的cyp3a4的基因表达量的图表。
图27是表示本发明的肝前体细胞或由肝前体细胞分化而得的成熟肝细胞(分化成熟肝细胞)中的cyp7a1的基因表达量的图表。
图28是对cdna-upa/scid小鼠移植前的本发明的肝前体细胞的照片。
图29是对cdna-upa/scid小鼠移植本发明的肝前体细胞后，取出，进行4天培养的细胞的照片。
图30是表示从cdna-upa/scid小鼠取出的肝细胞中的cyp1a2的活性的图表。
图31是表示从cdna-upa/scid小鼠取出的肝细胞中的cyp3a4的活性的图表。
图32是对cdna-upa/scid小鼠移植前的本发明的肝前体细胞的照片。
图33是对cdna-upa/scid小鼠移植本发明的肝前体细胞后，取出，进行4天培养的细胞的照片。
图34是表示从cdna-upa/scid小鼠取出的肝细胞中的cyp1a2的活性的图表。
图35是表示从cdna-upa/scid小鼠取出的肝细胞中的cyp3a4的活性的图表。
图36是对cdna-upa/scid小鼠移植前的本发明的肝前体细胞的照片。
图37是对cdna-upa/scid小鼠移植本发明的肝前体细胞后，取出，进行4天培养的细胞的照片。
图38是表示从cdna-upa/scid小鼠取出的肝细胞中的cyp1a2的活性的图表。
图39是表示从cdna-upa/scid小鼠取出的肝细胞中的cyp3a4的活性的图表。
具体实施方式
本发明涉及一种人肝前体细胞的制备方法，包括将人成熟肝细胞在含有血清、a-83-01和chir99021的培养基中进行培养。
[人成熟肝细胞]
本发明中使用的人成熟肝细胞可以按照已知的任意的方法从活体肝脏组织取得。应予说明，本说明书中，活体肝脏组织是指从出生后的人肝脏取得的肝脏组织。活体肝脏组织的供给个体可以存活也以死亡。活体肝脏组织的供给个体的年龄没有限定，但从细胞增殖的观点，优选为20岁以下，进一步优选为10岁以下，更优选为婴幼儿(0岁～7岁)，最优选为婴儿(0岁～2岁)。
另外，本发明中使用的人成熟肝细胞只要具有作为成熟肝细胞的特征即可，可以为从活体肝脏组织取得后冷冻保存的细胞，也可以为从活体肝脏组织取得后适当重复冷冻保存和融化的细胞。本发明中使用的人成熟肝细胞可以是市售的来自人的成熟肝细胞。
此外，本发明的方法使用的人成熟肝细胞包含在体外不具有增殖能力的完全分化的肝细胞。
本发明的方法中使用的人成熟肝细胞可以为由ips细胞(inducedpluripotentstemcells，诱导多能性干细胞)、es细胞(embryonicstemcells，胚胎干细胞)等分化诱导而得的肝细胞。
[血清]
对本发明中使用的血清而言，例如可举出人血清、胎牛血清(fbs)、牛血清、仔牛血清、山羊血清、马血清、猪血清、羊血清、兔血清、大鼠血清等，优选为fbs、仔牛血清、牛血清，进一步优选为fbs。另外，本发明中使用的血清可以为白蛋白(牛、猪、人、狗、兔子、大鼠、小鼠、鸡等)、人血小板溶解物等来自血清成分的物质。本发明中使用的血清可以为市售品。
本发明中使用的血清的含量相对于培养基整体的量为0.1v/v％～30v/v％，优选为1v/v％～20v/v％，进一步优选为5v/v％～15v/v％，进一步更优选为8v/v％～12v/v％，最优选为10v/v％。
[a-83-01]
a-83-01(casno.909910-43-6)为tgf-β信号抑制剂的一种，能够选择性地抑制tgf-βtypei/activin受体样激酶(alk5)、typeiactiving/nodal受体激酶(alk4)、typeinodal受体激酶(alk7)。a-83-01也是作为3-(6-甲基-2-吡啶基)-n-苯基-4-(4-喹啉基)-1h-吡唑-1-硫代甲酰胺(3-(6-methyl-2-pyridinyl)-n-phenyl-4-(4-quinolinyl)-1h-pyrazole-1-carbothioamide)公知的。虽然没有限定，但a-83-01可以从和光纯药工业株式会社等获得。
本发明中使用的a-83-01的含量相对于培养基整体的量为0.0001μm～5μm，优选为0.001μm～2μm，进一步优选为0.01μm～1μm，进一步更优选为0.05μm～0.7μm、最优选为0.5μm。
[chir99021]
chir99021(casno.252917-06-9)为gsk-3β(glycogensynthasekinase3β，糖原合成酶激酶3β)抑制剂的一种，当前已知作为选择性最高的抑制剂。chir99021也是作为6-[[2-[[4-(2,4-二氯苯基)-5-(5-甲基-1h-咪唑-2-基)-2-嘧啶基]氨基]乙基]氨基]-3-吡啶甲腈(6-[[2-[[4-(2,4-dichlorophenyl)-5-(5-methyl-1h-imidazol-2-yl)-2pyrimidinyl]amino]ethyl]amino]-3-pyridinecarbonitrile)公知的。虽然没有限定，但chir99021可以从和光纯药工业株式会社等获得。
本发明中使用的chir99021的含量相对于培养基整体的量为0.001μm～20μm，优选为0.01μm～10μm，进一步优选为0.1μm～5μm，进一步更优选为0.3μm～4μm，最优选为3μm。
[rock抑制剂]
本发明中，培养人成熟肝细胞的培养基可以进一步含有rock抑制剂。这里，作为rock抑制剂，虽然没有限定，但可例示y-27632(casno.146986-50-7)、gsk269962(casno.850664-21-0)、法舒地尔(fasudilhydrochloride)(casno.105628-07-7)、h-1152(casno.871543-07-6)，优选为y-27632。y-27632是选择性且强力的rock(rho相关的卷曲螺旋形成蛋白激酶(rho-associatedcoiledformingkinase)/rho结合激酶)抑制剂。y-27632也是作为反式-4-[(1r)-1-氨基乙基]-n-4-吡啶基-环己烷甲酰胺(trans-4-[(1r)-1-aminoethyl]-n-4-pyridinyl-cyclohexanecarboxamide)公知的。另外，y-27632可以为游离体，也可以为盐酸盐、硫酸盐等盐的形式，还可以为水合物。gsk269962a也是作为n-[3-[[2-(4-氨基-1,2,5-
本发明中使用的rock抑制剂的含量相对于培养基整体的量为0.001μm～50μm，优选为0.01μm～30μm，进一步优选为0.1μm～20μm，进一步更优选为1μm～15μm，最优选为10μm。
本发明中，可以在培养人成熟肝细胞的培养基中添加es细胞、ips细胞等作为诱导技术公知的各种基因中的1种～多种基因或它们的基因产物(蛋白质、mrna等)或者药剂等。另外，可以在哺乳动物的细胞中表达或导入es细胞、ips细胞等作为诱导技术公知的各种基因中的1种～多种基因、或它们的基因产物(蛋白质、mrna等)。
本发明中，在培养人成熟肝细胞的培养基中，为了提高向肝前体细胞的诱导效率，可以添加已知诱导es细胞、ips细胞等的药剂、化合物、抗体。例如，可以添加fgf受体酪氨酸激酶、mek(丝裂原活化蛋白激酶)/erk(细胞外信号控制激酶1和2)途径、gsk(糖原合成酶激酶)3这三种的低分子抑制剂〔su5402和pd184352〕、mek/erk途径和gsk3的低分子抑制剂〔pd0325901〕、组蛋白甲基化酶g9a的抑制剂即低分子化合物〔bix-01294(bix)〕、氮杂胞苷、曲古抑菌素a(tsa)、7-羟基黄酮(7-hydroxyflavone)、麦角酸二乙酰胺(lysergicacidethylamide)、肯帕罗酮(kenpaullone)、tgf-βreceptorikinase/activin-likekinase5(alk5)的抑制剂〔emd616452〕、tgf-β受体1(tgf-βr1)激酶的抑制剂〔e-616452和e-616451〕、src家族激酶(src-familykinase)的抑制剂〔ei-275〕、噻托维汀(thiazovivin)、pd0325901、su5402、pd184352、sb431542、抗tgf-β中和抗体、tnr5a2、p53抑制化合物、针对p53的sirna、p53途径的抑制剂等。
另外，在培养人成熟肝细胞的培养基中，为了提高向肝前体细胞的诱导效率，也可以进一步使用为了制作es细胞、ips细胞等而使用的小rna(microrna)。
本发明中，在培养人成熟肝细胞的培养基中，也可以使用抑制或中和tgf-β等的活性的各个抑制剂或抗体等。作为tgf-β的抑制剂，例如可举出tgf-βri抑制剂、tgf-βri激酶抑制剂等。
本发明的培养中，也优选在进行了包被的培养皿上进行培养。作为包被，可以使用基质胶包被、胶原蛋白包被、明胶包被、层粘连蛋白包被、纤维连接蛋白包被等。优选使用基质胶包被作为包被。
作为可用于本发明的基本的培养基，例如可例示es培养基〔40％杜尔贝科改良伊格尔培养基(dulbecco'smodifiedeaglemedium)(dmem)、40％的f12培养基(sigma公司制)、2mml-谷氨酰胺或glutamax(sigma公司制)、1％的非必需氨基酸(sigma公司制)、0.1mm的β-巯基乙醇(sigma公司制)、15～20％的knockout血清替代品(invitrogen公司制)、10μg/ml的庆大霉素(invitrogen公司制)、4～10ng/ml的bfgf(fgf2)〕(以下称为es培养基)、向在除去了0.1mm的β-巯基乙醇的es培养基中将小鼠胚胎成纤维细胞mef培养24小时而得的上清即驯化培养基添加0.1mm的β-巯基乙醇和10ng/ml的bfgf(fgf2)的培养基(以下为mef驯化es培养基)，ips细胞用最适培养基(ipsellon公司制)、饲养细胞用最适培养基(ipsellon公司制)、stempro〔注册商标〕hescsfm(invitrogen公司制)、mtesr1(stemcelltechnologies·veritas公司制)、无动物蛋白的人es/ips细胞维持用无血清培养基tesr2〔st-05860〕(stemcelltechnologies·veritas公司制)、灵长类es/ips细胞用培养基(reprocell公司)、reprostem(reprocell公司)、reproff(reprocell公司)、reproff2(reprocell公司)等，但并不限于这些培养基。这些培养基中，在不含本发明的制备方法需要的血清、a-83-01和chir99021的情况下，可以适当追加。
本发明中，将人成熟肝细胞制备成人肝前体细胞时的最适的培养条件可以按照常规方法进行适当变更。虽然没有限定，但将人成熟肝细胞制备成人肝前体细胞时的最适的培养条件，例如如下。
培养温度：优选为15℃～45℃，进一步优选为25℃～40℃，最优选为37℃。
co2浓度：优选为1％～10％，进一步优选为3％～8％，最优选为5％。
培养期间：优选为1天(24小时)～30天，进一步优选为3天～20天。
本发明中，肝前体细胞的增殖培养或传代培养的方法，可以使用es细胞、ips细胞等的培养中本领域技术人员通常使用的任一方法。例如，可例示如下方法：从细胞除去培养基，利用pbs(-)清洗，加入细胞剥离液并静置后，加入含有1×抗生素-抗真菌剂和10％fbs的d-mem(高葡萄糖)培养基进行离心分离，进一步除去上清液后，添加1×抗生素-抗真菌剂、mtesr1和10μmy-27632，在接种有mef的基质胶包被、明胶包被或胶原蛋白包被培养皿中接种细胞悬浮液，由此进行传代培养。
本发明的肝前体细胞只要具备分化成成熟肝细胞或胆管上皮细胞等的能力即可。肝前体细胞可以为冷冻保存细胞，也可以为适当重复冷冻保存和融化的细胞。本发明中，冷冻保存可通过向本领域技术人员周知的冷冻保存液悬浮肝前体细胞并冷却来进行。悬浮可通过利用胰蛋白酶等剥离剂将细胞剥离，移至冷冻保存容器，适当处理后，加入冷冻保存液来进行。
冷冻保存液可以含有dmso(二甲基亚砜(dimethylsulfoxide))作为冻害保护剂，但由于dmso具有细胞毒性，因此优选减少dmso含量。作为dmso的代替物，可例示甘油、丙二醇或多糖类。在使用dmso的情况下，含有5％～20％的浓度，优选含有5％～10％的浓度，更优选含有10％的浓度。除此以外，也可以含有wo2007/058308中记载的添加剂。作为这样的冷冻保存液，例如可以使用由bioverde公司、日本genetics株式会社、reprocell公司、zenoaq公司、cosmobio公司、kohjin-bio株式会社、thermofisherscientific公司等提供的冷冻保存液。
将上述悬浮的细胞进行冷冻保存时，通过在-80℃～-100℃之间的温度(例如，-80℃)下保管即可，可使用能够达到该温度的任意的冷冻器进行。虽然没有特别限定，但为了避免急剧的温度变化，可以使用程序冷冻器适当控制冷却速度。冷却速度可以根据冷冻保存液的成分而适当选择，可以按照冷冻保存液的制造商说明来进行。
保存期间只要是在上述条件下冷冻保存的细胞融化后，保持与冷冻前同等的性质，上限就没有特别限定，例如可举出1周以上、2周以上、3周以上、4周以上、2个月以上、3个月以上、4个月以上、5个月以上、6个月以上、1年以上或其以上。通过在更低的温度下进行保存，能够抑制细胞障碍，因此，可以移至液氮上的气相(约-150℃以下～-180℃以下)中进行保存。在液氮上的气相中进行保存的情况下，可以使用本领域技术人员周知的保存容器进行。虽然没有特别限定，但例如在保存2周以上的情况下，优选在液氮上的气相中保存。
冷冻保存的肝前体细胞的融化可通过本领域技术人员周知的方法进行。例如可例示通过在37℃的恒温槽内或热水浴中静置或振荡来进行的方法。
通过将由本发明得到的肝前体细胞进一步进行培养，能够使其分化成成熟肝细胞或胆管上皮细胞等。
如此得到的成熟肝细胞(以下称为“分化成熟肝细胞”)与肝前体细胞相比，选自alb(白蛋白(albumin))、afp(甲胎蛋白(alphafetoprotein))、tat(酪氨酸转氨酶(tyrosineaminotransferase))、tdo2(色氨酸2,3-双加氧酶(tryptophan2,3-dioxygenase))、ttr(运甲状腺素(transthyretin))、g6pc(葡萄糖-6-磷酸酶(glucose-6-phosphatase))、ntcp(牛磺胆酸钠共转运多肽(sodiumtaurocholatecotransportingpolypeptide))、cnx32、cyp1a1(细胞色素(cytochrome)p1a1)、cyp1a2(细胞色素(cytochrome)p1a2)、cyp2b6(细胞色素(cytochrome)p2b6)、cyp2c9(细胞色素(cytochrome)p2c9)、cyp2c19(细胞色素(cytochrome)p2c19)、cyp2d6(细胞色素(cytochrome)p2d6)、cyp3a4(细胞色素(cytochrome)p3a4)和cyp7a1(细胞色素(cytochrome)p7a1)中的至少1种的基因的表达量显著变高。虽然没有限定，但分化成熟肝细胞的特征在于，与肝前体细胞相比，上述的基因的表达量上升到10～50000倍。
由人肝前体细胞向分化成熟肝细胞的分化诱导(以下也称为“分化”或“诱导”)可通过例如将抑瘤素m和地塞米松添加于基础培养基(上述基本的培养基等)来进行。为了赋予分化诱导培养基的各增殖分化因子的浓度所需的量的抑瘤素m，例如每1l培养基，为1μg～100μg，优选为5μg～50μg。为了赋予分化诱导培养基的各增殖分化因子的浓度所需的量的地塞米松，例如每1l培养基，为0.1mm～10mm，优选为0.5mm～5mm。
由人肝前体细胞向分化成熟肝细胞的分化诱导也可以通过将人肝前体细胞移植于动物的肝脏或者脾脏来进行。被移植的动物只要是能够将人肝前体细胞分化诱导成分化成熟肝细胞的动物就没有特别限定，优选为哺乳动物，例如可举出兔子、狗、猫、豚鼠、仓鼠、小鼠、大鼠、羊、山羊、猪、小型猪、马、牛和猴等，进一步优选为小鼠、大鼠、小型猪、猴。
另外，对于由肝前体细胞分化而得的成熟肝细胞(分化成熟肝细胞)，作为功能，例如可举出具有葡萄糖产生能力、氨代谢能力、白蛋白产生能力、尿素合成能力等。葡萄糖产生能力例如可以通过利用葡萄糖氧化酶法对培养上清液中的葡萄糖水平进行分析来确认。氨代谢能力例如可以通过利用改性靛酚法(horndb&squirecr,chim.acta.14：185-194.1966)对培养培养基中的氨水平进行分析来确认。白蛋白产生能力例如可以通过利用测定血清白蛋白浓度的方法对培养液中的白蛋白浓度进行分析来确认。另外，尿素合成能力例如可以使用比色测定(colorimetricassay)(sigma公司)来确认。
另外，本发明能够提供通过本发明的方法制造的肝前体细胞和由肝前体细胞分化而得的成熟肝细胞(分化成熟肝细胞)。通过本发明的方法制造的肝前体细胞和由肝前体细胞分化而得的成熟肝细胞(分化成熟肝细胞)的功能、形态与通过以往的方法制造的肝细胞的功能、形态相比，具有更接近于人成熟肝细胞的特征。另外，通过本发明的方法制造的肝前体细胞和由肝前体细胞分化而得的成熟肝细胞(分化成熟肝细胞)具有即使在体外也发挥功能的特征。因此，本发明的肝前体细胞和由肝前体细胞分化而得的成熟肝细胞(分化成熟肝细胞)例如在医疗领域(例如再生医疗领域)中是有用的。
例如，通过使用本发明的肝前体细胞，能够治疗肝疾病。例如，通过将肝前体细胞或由肝前体细胞分化而得的成熟肝细胞(分化成熟肝细胞)经由肝门静脉进行直接移植的方法、或以包埋于胶原蛋白、聚氨酯、其它公知的生物体亲和性材料的形式进行移植的方法，能够治疗肝疾病。如此，本发明还提供通过上述工序制造的肝前体细胞或由肝前体细胞分化而得的成熟肝细胞(分化成熟肝细胞)的用途。更具体而言，提供含有肝前体细胞或由肝前体细胞分化而得的成熟肝细胞(分化成熟肝细胞)的肝疾病的治疗剂。另外，提供使用该细胞的肝疾病的治疗方法。作为具体的疾病，可举出肝硬化、暴发性肝炎、慢性肝炎、病毒性肝炎、酒精性肝炎、肝纤维症、自身免疫性肝炎、脂肪肝、药剂过敏性肝损伤、血色素沉着病、含铁血黄素沉着症、威尔森氏症、原发性胆汁性肝硬化、原发性硬化性胆管炎、肝脓肿、慢性活动性肝炎、慢性持续性肝炎胆道闭锁症、肝癌等，但不限定于这些。
另外，由肝前体细胞分化而得的胆管上皮细胞可以由其形态特征、上皮细胞的标记物等来确认。
另外，本发明能够提供由通过本发明的方法制造的肝前体细胞分化而得的胆管上皮细胞(以下称为“分化胆管上皮细胞”)。通过本发明的方法制造的分化胆管上皮细胞的功能、形态与通过以往的方法制造的细胞的功能、形态相比，具有更接近人胆管上皮细胞的特征。另外，通过本发明的方法制造的分化胆管上皮细胞具有即使在体外也发挥功能的特征。因此，本发明的肝前体细胞和由肝前体细胞分化而得的胆管上皮细胞(分化胆管上皮细胞)例如在医疗领域(例如再生医疗领域)中是有用的。
例如，通过使用本发明的肝前体细胞，能够将本发明的肝前体细胞或胆管上皮细胞用于胆管疾病，例如，胆结石、胆囊息肉、胆囊癌、胆管癌、胆管炎、胆管肝炎、胆囊炎、alagille综合征(ags)、胆囊结石、胆囊腺肌症、胆囊隆起性病变、非结石性胆道疼痛、原发性硬化性胆管炎(psc)等的治疗。
另外，本发明的肝前体细胞在例如以肝疾病的治疗为目的的研究领域中也是有用的。例如，可以在人工器官(人工肝脏等)的研究开发中使用。此外，本发明的人肝细胞在医药品、食品等的开发的领域中也是有用的。具体而言，能够利用于被检物质的代谢、肝毒性的评价、肝疾病治疗剂、肝炎病毒感染抑制剂或病毒性肝炎治疗剂的筛选。
通过利用通过本发明的方法制造的肝前体细胞或由肝前体细胞分化而得的成熟肝细胞(分化成熟肝细胞)或者胆管上皮细胞(分化胆管上皮细胞)，能够评价被检物质的代谢、肝毒性。
被检物质的代谢、肝毒性的评价中，以往使用动物模型等，但存在如下问题：能够一次评价的被检物质的数量有限制，并且无法将通过动物模型等得到的评价直接应用于人。因此，一直采用使用人肝癌细胞株、初代正常人培养肝细胞的评价方法。然而，由于人肝癌细胞株为癌细胞，因此，通过人肝癌细胞株得到的评价仍存在无法应用于人正常肝细胞的可能性。另外，初代正常人培养肝细胞在稳定供给、成本方面存在问题。另外，使初代正常人培养肝细胞永生化的细胞株与未永生化的情况相比，显示cyp3a4的活性降低(internationaljournalofmolecularmedicine14：663-668,2004,akiyamai.etal.)。通过利用通过本发明的方法制造的肝前体细胞或由肝前体细胞分化而得的成熟肝细胞(分化成熟肝细胞)或者胆管上皮细胞(分化胆管上皮细胞)，能够解决这样的问题。
本发明的分化成熟肝细胞能够利用于被检物质的筛选。本发明的被检物质的筛选可以将代谢酶的分析、代谢途径的分析、代谢产物的分析、代谢活性的分析、细胞毒性的分析、遗传毒性的分析、致癌性表达的分析、致突变性的分析、肝毒性表达的分析、对肝脏的作用的分析等作为指标。
本发明提供对被检物质的代谢进行评价的方法。该方法中，使被检物质与通过本发明的方法制造的肝前体细胞或由肝前体细胞分化而得的成熟肝细胞(分化成熟肝细胞)接触。接着，测定与该细胞接触的被检物质的代谢。
作为本发明中使用的被检物质，没有特别限制。可举出例如外来物、天然化合物、有机化合物、无机化合物、蛋白质、肽等单一化合物以及化合物库、基因库的表达产物、细胞提取物、细胞培养上清液、发酵微生物产物、海洋生物提取物、植物提取物、医药品原料、化妆品原料、食品原料、医药品添加物、化妆品添加物、食品添加物、补充成分等，但不限定于这些。
作为外来物，可举出例如药剂或食品的候选化合物、候选物质、已知的药剂、食品，但不限定于这些，只要对生物体而言是异物，就包含于本发明的外来物。更具体而言，可例示利福平(rifampin)、地塞米松(dexamethasone)、苯巴比妥(phenobarbital)、ciglirazone、苯妥英(phenytoin)、依非韦仑(efavirenz)、辛伐他汀(simvastatin)、β-萘黄酮(β-naphthoflavone)、奧美拉唑(omeprazole)、克霉唑(clotrimazole)、3-甲基胆蒽(3-methylcholanthrene)等。
本发明的“接触”通常通过在培养基、培养液中添加被检物质来进行，但不限定于该方法。在被检物质为蛋白质等的情况下，可以通过将表达该蛋白质的dna载体导入该细胞来进行“接触”。
被检物质的代谢可以通过本领域技术人员周知的方法进行测定。例如在检测出被检物质的代谢产物的情况下，判定为被检物质被代谢。另外，通过被检物质的接触，诱导cyp(细胞色素p450)、mdr((多种抗药性)multidrugresistance，abcb1)、mpr(多药耐药相关蛋白(multidrugresistance-associatedprotein)，abcc2)等的酶基因的表达时或者在这些酶的活性上升时，判定为被检物质被代谢。
代谢酶的分析，可以通过例如使被检物质与本发明的分化成熟肝细胞接触后，对被检物质的结构的变化进行分析，来进行参与被检物质的代谢的酶的分析。具体而言，可举出通过使被检物质与本发明的分化成熟肝细胞接触后利用各种酶的抑制·拮抗物质或者各种酶的中和抗体对被检物质的结构的变化进行分析而进行的参与被检物质代谢的酶的鉴定、通过分析基于被检物质与细胞的接触的被检物质的结构的变化而进行的酶反应机理的分析、底物特异性的分析等。
代谢途径的分析和代谢产物的分析，可以通过例如使被检物质与本发明的分化成熟肝细胞接触后对被检物质的结构的变化进行分析来进行被检物质的代谢途径的分析和代谢产物的分析。用于检测被检物质的代谢产物的方法可以使用公知方法。例如，通过液相色谱、质谱等对与被检物质接触的分化成熟肝细胞的培养基等进行分析，由此能够检测代谢产物。
代谢活性的分析例如可以通过使被检物质与本发明的分化成熟肝细胞接触并检测被检物质代谢酶活性的上升、酶量的增加或编码酶的基因的转录量的上升等，由此能够进行被检物质代谢酶的活性的促进的分析。具体而言，可以通过检测细胞色素p450酶活性的上升、蛋白量的增加、mrna的增加来进行分析。作为检测方法，可以使用与各种p450对应的酶活性的测定、与各种p450蛋白质对应的western印迹、与各种p450mrna对应的northern杂交或者rt-pcr法等公知的方法。
另外，本发明提供评价被检物质的肝毒性的方法。该方法中，使被检物质与通过本发明的方法制造的肝前体细胞和由肝前体细胞分化而得的成熟肝细胞(分化成熟肝细胞)接触。接着，测定使被检物质接触的该细胞的障碍的程度。障碍的程度例如可以将该细胞的存活率、got(谷氨酸草酰醋酸氨基移转酶(glutamateoxaloacetatetransaminase))或gpt(谷氨酸丙酮酸转氨酶(glutamicpyruvictransaminase))等肝损伤标记物作为指标进行测定。
肝毒性表达的分析例如可以通过使被检物质与本发明的分化成熟肝细胞接触，观察该细胞毒性的表达，或者通过使被检物质与该细胞接触后，将因该细胞而变化的被检物质对其它肝细胞、肝切片、摘除肝或实验动物进行给予，观察由其引起的细胞、组织、生物体的变化，从而对基于被检物质代谢的肝毒性进行分析。
例如，通过将被检物质添加于肝前体细胞或由肝前体细胞分化而得的成熟肝细胞(分化成熟肝细胞)的培养液，该细胞的存活率降低时，判定为该被检物质具有肝毒性，存活率没有显著的变化时，判定为该被检物质不具有肝毒性。另外，例如，在该细胞的培养液中添加被检物质后，培养液中的got、gpt上升时，判定为该被检物质具有肝毒性，got、gpt没有显著的变化时，判定为该被检物质不具有肝毒性。
应予说明，通过使用已判明了有无肝毒性的物质作为对照，能够更准确地评价被检物质是否具有肝毒性。
细胞毒性的分析，例如可以使被检物质与本发明的分化成熟肝细胞接触来进行基于被检物质的代谢物的细胞毒性的分析。具体而言，通过观察基于被检物质的接触的该细胞的形态的变化、活细胞数的变动、细胞内酶的漏出、细胞表层结构的变化或者细胞内酶的变动等来进行分析。
生遗传毒性的分析，例如可以使被检物质与本发明的分化成熟肝细胞接触，将该细胞进行染色体异常试验、微核试验等来进行基于被检物质代谢的遗传毒性的分析。另外，通过使被检物质与本发明的分化成熟肝细胞接触后，利用适当的评价系统评价因该细胞而变化的被检物质并通过进行染色体异常试验、微核试验、回复突变试验等来进行分析。
致癌性表达的分析例如可以通过使被检物质与本发明的分化成熟肝细胞接触并将该细胞进行染色体异常试验、dna的修饰等来进行基于被检物质代谢的致癌性的分析。另外，可以通过使被检物质与本发明的分化成熟肝细胞接触后，利用基于适当的化学物质的致癌评价系统评价因该细胞而变化的被检物质来进行分析。
致突变性的分析例如可以通过使被检物质与本发明的分化成熟肝细胞接触并将该细胞进行染色体异常试验、微核试验等来进行基于被检物质代谢的致突变性的分析。另外，可以通过使被检物质与本发明的分化成熟肝细胞接触后，利用适当的评价系统评价因该细胞而变化的被检物质并通过进行染色体异常试验、微核试验、回复突变试验等来进行分析。
另外，本发明能够提供肝疾病或胆管疾病的治疗剂的筛选方法。该方法中，使被检物质与通过本发明的方法制造的肝前体细胞或由肝前体细胞分化而得的成熟肝细胞(分化成熟肝细胞)接触。接着，测定使被检物质接触的该细胞的功能。接着，选择使接触被检物质的该细胞的功能亢进的物质。
对肝脏的作用的分析，例如可以通过使被检物质与本发明的分化成熟肝细胞接触后，观察该细胞的变化的表达，或者通过使被检物质与该细胞接触后，将因细胞而变化的被检物质对其它肝脏细胞、肝脏切片、摘除肝脏或实验动物进行给予，观察由其引起的细胞、组织、生物体的变化来分析对肝脏的作用的表达。使被检物质接触的分化成熟肝细胞中，发现细胞功能亢进时，可期待被检物质对肝脏的治疗效果。
本发明的肝前体细胞或由肝前体细胞分化而得的成熟肝细胞(分化成熟肝细胞)的功能例如可以将葡萄糖产生能力、氨代谢能力、白蛋白产生能力、尿素合成能力、cyp等酶的活性作为指标进行测定。
葡萄糖产生能力例如可以通过利用葡萄糖氧化酶法对培养上清液中的葡萄糖水平进行分析来确认。氨代谢能力例如可以通过利用改性靛酚法(horndb&squirecr,chim.acta.14：185-194.1966)对培养培养基中的氨水平进行分析来确认。白蛋白产生能力例如可以通过利用测定血清白蛋白浓度的方法对培养液中的白蛋白浓度进行分析来确认。另外，尿素合成能力例如可以使用colorimetricassay(sigma公司)来确认。本发明的cyp没有特别限制，例如可举出cyp1a1、cyp2c8、cyp2c9、cyp3a4等。cyp的活性测定方法可以使用本领域技术人员周知的方法。
通过本发明的方法制造的肝前体细胞和由肝前体细胞分化而得的成熟肝细胞(分化成熟肝细胞)的功能、形态更接近人成熟肝细胞，因此，能够感染肝炎病毒。
本发明提供肝炎病毒感染抑制剂的筛选方法。该方法中，使肝炎病毒在被检物质的存在下与通过本发明的方法制造的肝前体细胞或由肝前体细胞分化而得的成熟肝细胞(分化成熟肝细胞)接触。接着，检查使肝炎病毒接触的该细胞有无感染肝炎病毒。接着，选择抑制肝炎病毒感染的物质。与细胞的肝炎病毒的接触可以通过常规方法实施。
作为肝炎病毒，没有特别限制，包括丙型肝炎病毒、甲型肝炎病毒、乙型肝炎病毒。这些肝炎病毒可以为已株化的肝炎病毒，也可以为由肝炎病毒感染者直接分离的肝炎病毒。另外，可以为精制的状态，也可以为粗产物的状态(例如由感染者得到的血清的状态)。
有无感染肝炎病毒例如可以将细胞中的肝炎病毒量作为指标进行检查。细胞中的肝炎病毒量例如可以将细胞中的肝炎病毒的rna量作为指标进行判定。肝炎病毒的rna量可以按照常规方法进行测定。另外，可以通过本发明人等建立的方法进行测定(t.takeuchietal.real-timedetectionsystemforquantificationofhepatitiscvirusgenome.gastroenterology1999,116：636-642)。
此外，本发明能够提供病毒性肝炎治疗剂的筛选方法。该方法中，使肝炎病毒与通过本发明的方法制造的肝前体细胞或由肝前体细胞分化而得的成熟肝细胞(分化成熟肝细胞)接触。接着，使被检物质与感染了肝炎病毒的该细胞接触。接着，测定使被检物质接触的细胞中肝炎病毒的增殖。接着，选择抑制肝炎病毒的增殖的物质。
抑制肝炎病毒的增殖的物质包括1)与不使被检物质接触的情况相比，抑制肝炎病毒增殖的物质、2)完全抑制肝炎病毒增殖的物质、3)使肝炎病毒消失的物质全部。肝炎病毒的增殖、消失可以通过测定细胞中的肝炎病毒量来进行检查。
本发明中，被检物质通常可以通过将被检物质添加于分化成熟肝细胞的培养基、培养液而使其与该细胞接触。此外，可以通过在分化成熟肝细胞内使编码被检物质的基因表达而使其与该细胞接触。或者，通过将产生被检物质的细胞和分化成熟肝细胞进行共培养，也可以使被检物质与该细胞接触。
本发明的分化成熟肝细胞的功能、形态更接近于成熟肝细胞，因此，能够感染肝炎病毒。因此，本发明能够提供肝炎病毒的培养方法。本发明的肝炎病毒的培养方法中，病毒的种类没有特别限定，例如可举出甲型肝炎病毒、乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒、丁型肝炎病毒和戊型肝炎病毒。本发明的肝炎病毒的培养方法在已经分离的病毒的传代、扩增中是有用的。另外，本发明的肝炎病毒的培养方法可以从来自环境、患者的样品分离肝炎病毒。
本发明的人肝脏模型动物，可以通过将本发明的分化成熟肝细胞移植于非人哺乳动物而得到。作为用于对非人哺乳动物进行移植的分化成熟肝细胞的给药途径，可举出对肝脏表面的直接给药、肝脏内给药、门静脉内给药、脾脏内给药、口服给药、皮下给药、肌肉内给药、静脉内给药、动脉内给药、舌下给药、直肠给药、阴道给药、经皮给药等，从本发明的分化成熟肝细胞的存活率的观点出发，优选为对肝脏表面直接给药、肝脏内给药、脾脏内给药、动脉内给药和静脉内给药，更优选为肝脏内给药、脾脏内给药、肝动脉内给药。
本发明的人肝脏模型动物中的分化成熟肝细胞的给药量可根据非人哺乳动物和给药途径而不同，通常为1×10～1×1010个/个体，优选为1×102～1×109个/个体，进一步优选为1×103～1×108个/个体。应予说明，可以将该用量设为1次量进行多次给药，也可以将该用量分成多次进行给药。
作为本发明的非人哺乳动物，只要是哺乳动物就没有特别限定，例如可举出兔子、狗、猫、豚鼠、仓鼠、小鼠、大鼠、羊、山羊、猪、小型猪、马、牛和猴等，进一步优选为小鼠、大鼠、小型猪、猴。
另外，本发明能够提供试剂盒，该试剂盒包含人肝前体细胞或成熟肝细胞(分化成熟肝细胞)，所述人肝前体细胞是通过将人成熟肝细胞在含有血清、a-83-01和chir99021的培养基中进行培养而制备的，所述成熟肝细胞(分化成熟肝细胞)是由该人肝前体细胞诱导而得的。这样的试剂盒用于使用人肝前体细胞或分化成熟肝细胞来评价被检物质的代谢和/或肝毒性。在其它实施方式中，这样的试剂盒也能够用于被检物质的筛选，具体而言，肝疾病或胆管疾病的治疗剂的筛选、肝炎病毒感染抑制剂的筛选、病毒性肝炎治疗剂的筛选等。各自的具体的评价方法、筛选方法如上所示。
实施例
以下，举出实施例和试验例对本发明详细地进行说明，但本发明不限定于这些实施例等。以下，关于使用的细胞的年龄·月龄信息分别以“m”(month)、“y”(year)的缩写来表示。
(实施例1)
将人冷冻肝细胞(lot.id：hc3-14，45y，male，caucasian，xenotech公司制)悬浮于解冻用培养基(william’se培养基(lifetechnologies公司制，32551-020)、10％fbs(lifetechnologies公司制)、10-4m胰岛素(sigma公司制)、1×抗生素/抗真菌溶液(lifetechnologies公司制))，通过500rpm(约40×g)、4℃、2min的低速离心进行人肝细胞回收。将回收的细胞再次悬浮于接种培养基(l-15培养基(lifetechnologies公司制，11415-064)、1×抗生素/抗真菌溶液(lifetechnologies公司制))，对细胞数进行计数。以成为1×104cells/cm2的方式接种于胶原蛋白包被板(iwaki公司制)，放入co2培养箱(37℃，5％co2)内，在细胞粘附后的3-5小时后由接种培养基替换为在基础培养基(以下，“shm培养基”(dmem/f12培养基(lifetechnologies公司制，11320033)、5mmhepes(sigma公司制，st.louis，mo)、30mg/ll-脯氨酸(sigma公司制)、0.05％bsa(sigma公司制)、10ng/ml表皮生长因子(sigma公司制)、胰岛素-转铁蛋白-丝氨酸(its)-x(lifetechnologies公司制)、10-7m地塞米松(dex)(sigma公司制)、10mm烟酰胺(sigma公司制)、100mm2-磷酸抗坏血酸酯(wako公司制)、1×抗生素/抗真菌溶液(lifetechnologies公司制))中加入10％fbs(lifetechnologies公司制)、0.5μma-83-01(wako公司制)和3μmchir99021(axonmedchem公司制)而得的ac-f培养基、在基础培养基加入10％fbs(lifetechnologies公司制)、0.5μma-83-01(wako公司制)、3μmchir99021(axonmedchem公司制)和10μmy-27632(wako公司制)而得的yac-f培养基以及加入0.5μma-83-01(wako公司制)、3μmchir99021(axonmedchem公司制)和10μmy-27632(wako公司制)而得的yac培养基。然后以2-3天一次的频度使用各试验用培养基进行培养基更换，在co2培养箱(37℃，5％co2)内进行培养。
17天后利用相位差显微镜进行培养细胞的形态的观察，结果在ac-f培养基和yac-f培养基中培养的细胞中，发现很多小型的细胞，它们由于核/细胞质(n/c)比高，并且确认到白色的核，因此，能够确认为肝前体细胞(图1a和图1b)。与此相对，在yac培养基中培养的细胞由于在12天后n/c比低、核为黑色并且还观察到双核的细胞(图1c)，因此，能够确认这些细胞不是肝前体细胞。另外，在ac-f培养基和yac-f培养基中培养的细胞与在yac培养基中培养的细胞相比，增殖速度快。
综上所述，明确了为了由成熟肝细胞得到肝前体细胞，需要在培养基中含有血清、a-83-01和chir99021。
(实施例2)
与实施例1同样地使用人冷冻肝细胞(10m，female，hispanic，celsis公司制)在ac-f培养基中进行培养，结果6天后(d6)、9天后(d9)和12天后(d12)观察到肝前体细胞(图2)。图2中，箭头表示由肝前体细胞部分自发地分化并成熟化的细胞。
(实施例3)
与实施例1同样地使用人冷冻肝细胞(2y，male，caucasian，biopredic公司制)在ac-f培养基中进行培养，结果在7天和14天后，观察到肝前体细胞。与此相对，将试验培养基设为仅含有10％fbs(lifetechnologies公司制)的fbs培养基进行培养时，未观察到肝前体细胞(图3)。
同样地使用人冷冻肝细胞(8m，male，caucasian，bioreclamationivt公司制)在ac-f培养基中进行培养，结果在7天和14天后，观察到肝前体细胞，将试验培养基设为fbs培养基进行培养时，未观察到肝前体细胞(图4)。
(实施例4)
对upa基因在肝细胞中特异性表达，肝脏先天性持续受到损伤而出现慢性肝损伤的cdna-upa/scid小鼠进行本发明的肝前体细胞的移植，确认来自本发明的肝前体细胞的肝细胞植入cdna-upa/scid小鼠的肝脏。
对于与实施例1同样地使用人冷冻肝细胞(10m，female，hispanic，celsis公司制)在ac-f培养基中进行了4天培养的细胞，利用pbs(-)清洗2次后，利用trypleexpress(thermo公司制，sku：12604013)剥离回收，进行细胞数的测定。将细胞悬浮液离心(200×g，5分钟)后，悬浮于dmem10(10％fbs-dmem)，以达到5×107cells。
在异氟烷麻醉下将cdna-upa/scid小鼠(tatenoet.al.，2015，2-4周龄)剖腹，露出脾脏，以0.5×105～2×106cells/mouse移植后，将剖腹部缝合。1周1次，从眼窝采取20～40ul的血液，分离血清，利用albhumanalbelisakit(bethyl公司制，商品代码：e88-129)测定血清中的人特异性白蛋白。细胞移植后8周进行剖检，制作全血和肝脏·脾脏的组织样品(石蜡和冷冻块)。
(实施例5)
由于肝细胞特异性表达胸苷激酶，因此，能够通过给药更昔洛韦而肝细胞特异地诱导细胞死亡，引起肝损伤，对这样的tk-nog小鼠进行本发明的肝前体细胞的移植，确认tk-nog小鼠的肝脏内，生长出来源于本发明的肝前体细胞的肝细胞。
与实施例4同样地使用人冷冻肝细胞(10m，female，hispanic，celsis公司制)制备细胞悬浮液。对于tk-nog小鼠(hasegawaet.al.，2011，7-8周龄，in-vivoscience公司制)，在细胞移植7天前和5天前，称取更昔洛韦(gcv，sigma公司制，g2536-100mg)10mg，溶于16.7ml的pbs(-)，利用0.22um过滤器进行过滤灭菌，以10ul/g体重(6mg/kg)进行腹腔内给药。在异氟烷麻醉下将tk-nog小鼠剖腹，露出脾脏，以0.5×105～2×106cells/mouse进行给药后，将剖腹部缝合。1周1次从尾静脉采取20～40ul的血液，分离血清，利用albhumanalbelisakit(bethyl公司制，商品代码：e88-129)测定血清中的人特异性白蛋白。细胞给药后8周进行剖检，制作全血和肝脏·脾脏的组织样品(石蜡和冷冻块)。
(实施例6)
确认分化为肝细胞的基因表达的试验
与实施例1同样地使用人冷冻肝细胞，在ac-f培养基中进行培养，制备肝前体细胞后，在含有抑瘤素m(osm)和地塞米松(dex)的培养基中进行6天培养，然后在基质胶中进行培养，使其分化为肝细胞。对于分化而得的肝细胞，按照操作说明书，使用sureprintg3ratge8x60kkit(g4853a)和sureprintg3mousege8x60kver2.0kit(g4852b)，通过one-colormicroarray-basedgeneexpressionanalysissystem(agilenttechnologies公司制)获得数据。强度数值以2为底进行对数转化，向partekgenomicssuite6.6(partekinc生产，chesterfield，mo，usa)读入数据。基因表达的分析使用one-wayanova，确定表达有差异的基因。在各自的分析中，算出p值和变化量的比。使用partekgenomicssuite6.6，对于所有数据集或排序完毕的数据集，通过使用选择的探针组的euclideandistancesofaveragelinkageclustering的方法实施无监督聚类(unsupervisedclustering)和热图制作，进行肝特异性基因的表达的确认。
(实施例7)确认分化为胆管上皮细胞的试验
促胰液素测定
与实施例1同样地使用人冷冻肝细胞，在ac-f培养基中进行培养，制备肝前体细胞后，在含有mtesr1和yac的培养基中，在mef上进行6天培养，然后添加2％基质胶进行2天培养，使其分化为胆管上皮细胞。对于分化而得的胆管上皮细胞，以2×10-7m(wako公司制)添加大鼠促胰液素进行30分钟培养后，使用相位差显微镜观察胆管样结构中的管腔区域的扩大，进行向胆管上皮细胞的分化的确认。
(实施例8)
荧光素二乙酸酯测定
与实施例7同样地由肝前体细胞分化为胆管上皮细胞，在得到的胆管上皮细胞中添加荧光素二乙酸酯，进行15分钟培养后，更换为新的培养基。进一步继续30分钟培养，由此促进分解的荧光素向管腔区域的输送。然后，将培养基替换为hbss(+)，利用荧光显微镜观察荧光素的分布，进行向胆管上皮细胞的分化的确认。
(实施例9)
分化为肝细胞时的肝特异性基因的表达的确认试验
与实施例6同样地由肝前体细胞分化为肝细胞，对于得到的肝细胞，使用mirneasyminikit(qiagen公司制，venlo，thenetherlands)提取总rna。按照操作说明书，使用high-capacitycdnareversetranscriptionkit(lifetechnologies公司制)进行逆转录。以制备的cdna为模板，使用platinumsybrgreenqpcrsupermixudg(invitrogen公司制)进行pcr，进行肝特异性基因的表达的确认。
(实施例10)
与实施例1同样地使用人冷冻肝细胞(10m，female，hispanic，celsis公司制)，对于在ac-f培养基中进行了11天培养的细胞，利用pbs(-)清洗2次后，利用trypleexpress(thermo公司制，sku：12604013)进行剥离回收，进行细胞数的测定。将细胞悬浮液离心(200×g，5分钟)后，悬浮于dmem10(10％fbs-dmem)，以达到5×107cells。
在异氟烷麻醉下将cdna-upa/scid小鼠(tatenoet.al.，2015，2-4周龄，n＝3)剖腹，露出脾脏，以1×106cells/mouse进行移植后，将剖腹部缝合。1周1次从眼窝采取20～40ul的血液，利用humanalbelisakit(bethyl公司制，商品代码：e88-129)测定血中的人特异性白蛋白。如图5所示，能够确认小鼠血中存在人alb，确认鼠肝上生长出来源于肝前体细胞的肝细胞。应予说明，细胞给药后70天的血中人alb分别为17.2mg/ml、12.1mg/ml和12.0mg/ml。
另外，进行细胞给药后70天的小鼠的肝脏中的人cyp2c9的表达的确认，结果确认为分别表达94.6～96.1％(右内叶)、91.3～97.2％(左内叶)和93.1～96.0％(全部)(分别为图6和7)。
(实施例11)
与实施例10同样地使用人冷冻肝细胞(10m，female，hispanic，celsis公司制)，对于在ac-f培养基中进行了11天培养的细胞，利用pbs(-)清洗2次后，利用trypleexpress(thermo公司制，sku：12604013)进行剥离回收，进行细胞数的测定。将细胞悬浮液离心(200×g，5分钟)后，悬浮于dmem10(10％fbs-dmem)，以达到5×107cells。对tk-nog小鼠(hasegawaet.al.，2011，7-8周龄，in-vivoscience公司制，n＝2)给药更昔洛韦(gcv)，给药1周后测定alt，将显示400-1600u/dl的值的个体作为被移植动物使用。应予说明，在制备gcv时将500mg(田边三菱制药，点滴静注用denosine)用10ml的注射用蒸馏水(大冢)溶解(50mg/ml)，将各分注0.2ml的溶液作为原始原料，在移植时预先准备利用pbs(-)将其稀释5倍的溶液，小鼠体重每10g腹腔内给药0.1ml，肝细胞特异地诱导细胞死亡。在异氟烷麻醉下将tk-nog小鼠剖腹，露出脾脏，以1×106cells/mouse给药后，将剖腹部缝合。1周1次从尾静脉采取20～40ul的血液，分离血清，利用albhumanalbelisakit(bethyl公司制，商品代码：e88-129)测定血清中的人特异性白蛋白。如图8所示，能够确认小鼠血清中存在alb，确认到来自肝前体细胞的肝细胞植入。应予说明，细胞给药后60天的血清中人alb在各个个体中为8.1mg/ml和2.2mg/ml。
另外，进行细胞给药后60天的小鼠的肝脏的人cyp2c9的表达的确认，结果确认到各个个体中表达57.5％和30.6％(图9和10)。
(实施例12)
与实施例1同样地使用人冷冻肝细胞1(10m，female，hispanic，celsis公司制)和人冷冻肝细胞2(8m，male，caucasian，bioreclamationivt公司制)，在ac-f培养基中进行培养，制备肝前体细胞(分别称为“fcl”，“dux”)后，在含有抑瘤素m(osm、5ng/ml)和地塞米松(dex，10-6m)的培养基中进行6天培养，然后在基质胶中进行2天培养，使其分化为肝细胞。对于肝前体细胞和分化而得的肝细胞，使用甲醇(meoh，1％浓度)和奥美拉唑(omp，50μm)，进行代谢酶cyp1a2的活性的测定。另外，使用蒸馏水和苯巴比妥(1mm)进行代谢酶cyp3a4的活性的测定。代谢酶的活性分别利用promega公司的luciferin1a2试剂盒和luciferin-ipa试剂盒进行。结果表明，通过使肝前体细胞分化为肝细胞，诱导了cyp1a2和cyp3a4(图11～14)。
(实施例13)
与实施例1同样地使用人冷冻肝细胞(10m，female，hispanic，celsis公司制)，在ac-f培养基中进行培养，制备肝前体细胞后，在含有抑瘤素m(osm，5ng/ml)和地塞米松(dex，10-6m)的培养基中进行6天培养，然后在基质胶中进行2天培养，使其分化为肝细胞。对于肝前体细胞和分化而得的肝细胞，使用pcr测定各代谢酶等的表达量。结果表明，通过使肝前体细胞分化为肝细胞，诱导了alb、tat、tdo2、ttr、g6pc、ntcp、cyp1a2、cyp2b6、cyp2c9、cyp2c19、cyp2d6、cyp3a4和cyp7a1(图15～27)。
(实施例14)
与实施例1同样地使用人冷冻肝细胞(10m，female，hispanic，celsis公司制)，制备肝前体细胞后，在异氟烷麻醉下将cdna-upa/scid小鼠(2-4m，male，phoenixbio公司制)剖腹，露出脾脏，以0.5×105～2×106cells/mouse进行移植后，将剖腹部缝合。移植后第73天，摘除肝脏，对肝细胞进行回流分离，以4×105cells/well在24孔胶原蛋白板(iwaki公司制)上使用2％fbs-shm培养基进行4天培养。图28和图29分别是移植前的肝前体细胞和移植后取出并进行了4天培养的细胞的照片，根据形态学观察，可以看出移植的细胞在小鼠肝脏内完全成熟为肝细胞的情形。
对于从小鼠取出的肝细胞，使用甲醇(meoh，1％浓度)和奥美拉唑(omp，50μm)进行代谢酶cyp1a2的活性的测定。另外，使用利福平(rf，10μm)、甲醇(meoh，1％浓度)、苯巴比妥(1mm)和蒸馏水进行代谢酶cyp3a4的活性的测定。代谢酶的活性分别利用promega公司的luciferin1a2试剂盒和luciferin-ipa试剂盒进行。结果表明，对于移植于动物的肝脏并培养的肝前体细胞，也由奥美拉唑诱导了cyp1a2，由利福平和苯巴比妥诱导了cyp3a4(图30和图31)
(实施例15)
与实施例1同样地使用人冷冻肝细胞(8m，male，caucasian，bioreclamationivt公司制)制备肝前体细胞，与实施例14同样地进行移植和培养。图32和图33分别是移植前的肝前体细胞和移植后取出并进行了4天培养的细胞的照片。
对于从小鼠取出的细胞，与实施例14同样地进行代谢酶的活性测定，结果表明，与实施例14同样地，由奥美拉唑诱导了cyp1a2，由利福平和苯巴比妥诱导了cyp3a4(图34和图35)
(实施例16)
与实施例1同样地使用人冷冻肝细胞(1y，male)制备肝前体细胞，与实施例14同样地进行移植和培养。图36和37分别是移植前的肝前体细胞和移植后取出并进行了4天培养的细胞的照片。
对于从小鼠取出的细胞，与实施例14同样地进行代谢酶的活性测定，结果表明，与实施例14同样地，由奥美拉唑诱导了cyp1a2，由利福平和苯巴比妥诱导了cyp3a4(图38和图39)。
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