本发明涉及分子生物学体外诊断试剂，具体涉及一种用于fish探针标记的bac-dna的快速制备方法。
背景技术：
：fish是利用荧光素标记的dna探针来检测在细胞、组织和肿瘤的特定dna序列的分子生物学检测技术。首先，样本dna变性，加入特定的荧光素标记的探针与变性的样本混合进行杂交，退火得到双链dna。探针信号能够被荧光显微镜捕获，从而定性、定量地检测目标dna。fish用途广泛，如应用于非整倍体，微缺失综合征以及基因重排的检测。而这些对很多遗传性疾病，如白血病、淋巴瘤、实体瘤、自闭症等发育综合征有重要的临床意义。因此，fish是来检测或确认基因或染色体异常的分子检测技术，通常用于遗传咨询、医学和品种鉴定、dna特定功能研究。目前比较常见的fish探针多采用bac-dna，采用切口平移的方法进行探针标记。细菌人工染色体(bacterialartificialchromosome，bac)是指一种以f质粒(f-plasmid)为基础建构而成的细菌染色体克隆载体，常用来克隆150kb-300kb左右大小的dna片段，属于低拷贝严谨型质粒。由于bac分子量巨大，给提取纯化带来了诸多困难。目前比较常用的bac提取试剂盒多采用异丙醇对裂解液中的dna进行沉淀，此方法虽然有效的回收了bac-dna，但异丙醇同时沉淀了裂解液中的rna和残留的蛋白，纯度难以达到要求，需要进一步使用rnase除去rna；用酚氯仿或离子交换柱去除蛋白质，此过程不仅繁琐费时，更会造成dna的损失。柱离心纯化法是目前最常用的一种核酸纯化方式，具有操作简单、回收率高、性能稳定的特点，其中使用的核酸纯化柱采用硅基质膜为滤芯，在低ph高盐环境下特异性的与核酸结合，在高ph低盐环境下释放结合的核酸，可以仅通过简单的离心操作，快速高效的纯化dna。虽然此方法快速简便，但市售常见的硅基膜离心柱仅能对100bp-10kb的dna片段进行有效的回收，10kb以上的dna片段时回收率明显降低，对30-50kb以上的片段几乎无法回收，而bac-dna的长度最小为150kb，无法利用此方法有效回收。切口平移法(nicktranslation)法是实验室最常用的一种脱氧核糖核酸探针标记法。以限量的dnasei在待标记的双链dna的每一条链上产生若干个单链缺口；再利用e.colidna多聚酶ⅰ的5’-3’外切酶活性和5’-3’多聚酶活性，在缺口处的5’末端每切除一个核苷酸，则在3’末端添加一个核苷酸，以修补缺口，随着缺口在dna链上的移动，标记的核苷酸就掺入到新合成的dna链中。虽然线状、超螺旋及带缺口的环状双链dna均可作为缺口平移法的模板，但实际应用中为避免超螺旋结构对酶不敏感，多采用ecori酶对bac-dna进行单酶酶切，将长的超螺旋bac-dna处理成为小片段的双链线性dna后再进行标记。限制性内切酶需要在特定的条件下才能进行酶切,需要将dna进行初步纯化加入到酶切体系中,酶切过程中bac-dna被稀释，同时加入了酶蛋白、盐等杂质，所以酶切后需要使用dna纯化试剂盒对dna进行再次纯化和浓缩，又会进一步造成dna的损失。如图1所示，传统的bac-dna制备流程包括下列步骤：1)菌液裂解获得裂解液；2)酶切前bac-dna纯化；3)bac-dna酶切；4)酶切产物dna再次纯化。整个过程操作复杂繁琐，且经过两次回收纯化，dna损失巨大。一般500ml菌液澄清裂解液中双链dna含量约500-600ug，酶切前纯化使用阴离子交换柱纯化dna(qiagenlarge-constructkit)回收率为约10％(不去除基因组dna)和4％(去除基因组dna)左右,硅基膜离心柱纯化dna(qiagenplasmidpluskit)回收率在5％左右；酶切处理后再次使用硅基膜离心住纯化(qiaquickpcrpurificationkit)回收率在40-60％,成品dna产量为10-30ug，回收率最高在5％左右，且需要使用大量rnase、离子交换柱、内切酶等耗材试剂，费用昂贵，操作复杂，整个制备过程需要2-3天。技术实现要素：本发明的目的在于提供一种成本低、方便快速的用于fish探针标记的bac-dna的快速制备方法。为了解决上述技术问题，本发明采用的技术方案是：一种用于fish探针标记的bac-dna的快速制备方法，包括以下步骤：(1)裂解菌体获得澄清裂解液；(2)利用超声波进行dna打断；(3)采用离心柱法回收纯化dna。所述步骤(2)将双链闭合超螺旋环状的bac-dna打断成为短的双链dna。所述步骤(2)中，bac-dna经超声波打断后，所得片段大小在10kb以下。所述步骤(2)中，使用sonicsvcx130超声波破碎仪对裂解液进行超声破碎，130w、超声2秒间歇8秒循环5次后提取dna。所述步骤(1)获得的澄清裂解液再经过细菌基因组去除和bac-dna纯化。本发明的有益效果是：本发明采用超声波破碎取代了限制性内切酶的酶切步骤，省略了酶切前dna纯化步骤，利用超声波直接将细菌澄清裂解液中超螺旋的bac-dna打碎成10kb以下的双链线性dna，再使用硅基膜柱离心法进行纯化回收，避免了传统制备工艺中多次的纯化操作造成的dna损失，大幅减少了制备时间和成本，提高了成品dna得率5倍以上。附图说明图1是传统方法流程图。图2是本发明的用于fish探针标记的bac-dna的快速制备方法的流程图。图3是本发明的超声打碎效果比较图(m为λdnahindiiimarker，1为未超声dna片段，2-6分别为使用sonicsvcx130超声波破碎仪对裂解液进行超声破碎，130w、超声2秒间歇8秒循环2-6次后电泳结果)。图4是bac-dna酶切结果和超声破碎结果比较图(m1λdnahindiiimarker，m2为d2000marker，1为bac-dna经ecori酶切后产物，2为使用sonicsvcx130超声波破碎仪对裂解液进行超声破碎，130w、超声2秒间歇8秒循环5次后提取的dna)。具体实施方式下面结合附图和具体实施方式对本发明作进一步详细说明：如图2所示，本发明用于fish探针标记的bac-dna的快速制备方法，包括以下步骤：(1)裂解菌体获得澄清裂解液；(2)利用超声波进行dna打断；(3)采用离心柱法回收纯化dna。所述步骤(2)将双链闭合超螺旋环状的bac-dna打断成为短的双链dna。所述步骤(2)中，bac-dna经超声波打断后，所得片段大小在10kb以下。所述步骤(2)中，使用sonicsvcx130超声波破碎仪对裂解液进行超声破碎，130w、超声2秒间歇8秒循环5次后提取dna。所述步骤(1)获得的澄清裂解液再经过细菌基因组去除和bac-dna纯化。实施例1：快速制备bac-dna1、500mllb培养基中加入适量抗生素，接入500ul工作库菌液，气浴摇床37℃，200rpm培养16小时。2、6000rpm离心菌液10分钟，倒掉上清，加入20mlp1buffer重悬菌体；加入20mlp2buffer，轻柔颠倒混匀4-6次，室温放置不超过5分钟；加入20mlp3buffer，轻柔颠倒混匀8-10次后冰上放置10分钟；16000g离心30分钟，小心分离上清，获得澄清裂解液。3、取25ml裂解液，使用sonicsvcx130超声波破碎仪对裂解液进行超声破碎，130w、超声2秒间歇8秒循环5次。另取25ml裂解液不进行超声处理直接进行后续操作作为对照。如图3所示，m为λdnahindiiimarker，1号孔为未超声dna片段，2-6号孔分别为使用sonicsvcx130超声波破碎仪对裂解液进行超声破碎，130w、超声2秒间歇8秒循环2-6次后片电泳结果，结果显示超声进行5次循环以上可有效的将全部dna打断到10k以下。4、利用qiagen-plasmidplusmaxikit(catno：12963)进行dna纯化：离心柱装上延伸管连接到qiavac24plus上，2组裂解液分别加入5mlbbbuffer，颠倒4-6次混匀后转移到延伸管中，-300mbar真空抽滤，直到全部液体通过离心柱；加入0.7mletrbuffer真空抽滤使液体全部通过离心柱；再加入0.7mlpebuffer，真空抽滤使液体全部通过离心柱；取下离心柱放到废液收集管中，10000g离心1分钟彻底去除残留液体；离心柱放入新的1.5ml离心管中，加入200ulebbuffer，室温放置1分钟后10000g离心1分钟洗脱dna。5、实验结果和比较，浓度检测结果见下表，进行超声处理后dna浓度有明显的提升，两组检测方法分别提高了2.5倍和3.3倍，且超声处理后qubit检测的浓度更接近nanodrop值(1.13vs1.48)，证明dna溶液内rna等污染物更少，纯度更高。nanodrop法(ng/ul)qubit法(ng/ul)n/q比值超声后389.53451.48未超声155.81051.13提高倍数2.53.3-6、超声组dna可直接进行后续荧光探针标记；未超声组dna采用ecori(neb，货号r0101s)进行酶切处理：300ul酶切体系中加入6ugdna(终浓度20ng/ul)，37℃反应1小时85℃灭活15分钟，然后取5ul酶切产物进行电泳检测，电泳结果如图4所示，m1为λdnahindiiimarker，m2为d2000marker，1号孔为bac-dna经ecori酶切后产物，2号孔为为使用sonicsvcx130超声波破碎仪对裂解液进行超声破碎，130w、超声2秒间歇8秒循环5次后片提取的dna，由于超声断裂的位点是随机的与dna序列无关，打断的dna片段更加均匀一致，dna片段主要集中于1kb-2kb区域，而酶切后的片段从数十bp到十几kb长短不一。7、利用qiaquickpcrpurificationkit(货号：28104)对酶切后dna进行纯化回收：取250ul酶切后产物，加入1.25mlpbbuffer反复颠倒混匀，加入到qiaquick离心柱，13000rpm离心1分钟后弃掉滤液加入750ulpebuffer，离心1分钟弃掉滤液，再离心1分钟甩干残留液体，将qiaquick离心柱放入新的1.5ml离心管，加入50ulebbuffer离心1分钟，获得纯化后dan溶液，qubit检测dna浓度为68.2ng/ul,回收率为68.2％。8、使用本发明的提取方法可以有效提高dna产量3.3倍，且获得的dna可直接用于后续探针标记操作，无需后续的酶切和再次纯化回收，避免了因此产生的二次dna损失，最终提高dna产量约5倍左右。实施例2：无基因组污染bac-dna提取1、500mllb培养基中加入适量抗生素，接入500ul工作库菌液，气浴摇床37℃，200rpm培养16小时。2、6000rpm离心菌液15分钟，倒掉上清，加入20mlp1buffer重悬菌体；加入20mlp2buffer，轻柔颠倒混匀4-6次，室温放置不超过5分钟；加入20mlp3buffer，轻柔颠倒混匀8-10次后冰上放置10分钟；16000g离心30分钟，小心分离上清，获得澄清裂解液。3、异丙醇沉淀dna：向裂解液中加入0.7倍体积的异丙醇，反复颠倒混匀，16000g离心20分钟，倒掉上清；加入15ml70％乙醇，16000g离心10分钟，倒掉上清；室温干燥沉淀5分钟；加入5ml反应缓冲液(33mmtris-醋酸ph7.5,66mm醋酸钾,10mm醋酸镁,0.5mmdtt)完全溶解沉淀。4、基因组dna去除：反应缓冲液-dna溶液中加入200ul25mmatp溶液和10ulatp-dependentdnase(10u/ul)，轻柔混匀后37℃水浴反应3小时，70℃水浴灭活30分钟。加入20mlp3buffer和35ml水混合均匀。5、取30ml混合液使用sonicsvcx130超声波破碎仪对反应液进行超声破碎，130w、超声2秒间歇5秒循环5次。剩余的30ml混合液不超声处理进行下一步6、2组混合液利用qiagen-plasmidplusmaxikit(catno：12963)进行后续dna纯化：离心柱装上延伸管连接到qiavac24plus上，超声后的反应液加入5mlbbbuffer，颠倒4-6次混匀后转移到延伸管中，-300mbar真空抽滤，直到全部液体通过离心柱；加入0.7mletrbuffer真空抽滤使液体全部通过离心柱；再加入0.7mlpebuffer，真空抽滤使液体全部通过离心柱；取下离心柱放到废液收集管中，10000g离心1分钟彻底去除残留液体；离心柱放入新的1.5ml离心管中，加入200ulebbuffer，室温放置1分钟后10000g离心1分钟洗脱dna。7、实验结果和比较：利用qubit进行dna浓度检测，超声组dna浓度为289ng/ul，未超声组dna浓度为103ng/ul,提高产量约2.8倍左右。未超声组需进行进一步的酶切和回收后才能进行探针标记，根据经验回收率在60％-80％之间，本发明总体提高dna产量5倍左右。本发明使用超声波破碎仪对bac-dna进行超声破碎来代替传统方法中的限制性内切酶的酶切步骤。通过超声可直接将细菌澄清裂解液中超螺旋状态的bac-dna打断成为10kb以下的小片段的双链线性dna，如图3所示，m为λdnahindiiimarker，1号孔为未超声dna片段，2-6号孔分别为使用sonicsvcx130超声波破碎仪对裂解液进行超声破碎，130w、超声2秒间歇8秒循环2-6次后片电泳结果，结果显示超声进行5次循环以上可有效的将全部dna打断到10k以下。超声断裂的位点是随机的与dna序列无关，与传统酶切相比超声打断的dna片段更加均匀一致，如图4所示，m1λdnahindiiimarker，m2为d2000marker，1号孔为bac-dna经ecori酶切后产物，2号孔为为使用sonicsvcx130超声波破碎仪对裂解液进行超声破碎，130w、超声2秒间歇8秒循环5次后片提取的dna，超声打断的dna片段主要集中于1kb-2kb区域，片段更加均匀一致。由于超声对破碎过程对dna浓度和纯度没有限制，避免了传统方法中的酶切前的纯化操作,从而减少了因纯化造成的dna的损失；超声打碎后的bac-dna从150k-200k大小的超螺旋大分子转变为小于10kb的小片段,能够通过硅基膜离心柱的孔隙，可以使用硅基膜离心住法快速有效回收，获得大量高纯度的双链线性bac-dna片断。本发明在整个制备过程中仅使用了超声打碎和一次柱离心纯化，与传统方法相比，没有使用任何额外的酶进行处理，也没减少了dna纯化处理过程，极大地减少了人力、财力和物力消耗，并且将提取时间缩短到3个小时以内，另一方面，超声波破碎对dna纯度、浓度没有限制和要求，处理前无需纯化，避免了纯化过程中dna的损失，成品dna得率显著提高，500ml菌液即可获得约100-150ug的片断化双链bac-dna成品，回收率约20％，与传统方法相比提高产量4-5倍。综上所述，本发明的内容并不局限在上述的实施例中，相同领域内的有识之士可以在本发明的技术指导思想之内可以轻易提出其他的实施例，但这种实施例都包括在本发明的范围之内。当前第1页12