本发明属于医药合成技术领域，具体地说，涉及一种7-羰基-牛磺熊去氧胆酸晶体化合物及其备方法。
背景技术：
熊胆粉是名贵的中药材，对胆结石疾病以及各种急性、慢性肝病具有良好的治疗效果。然而，传统熊胆粉的主要来源为“活熊引流取胆”，不仅加剧了资源的短缺，而且也是非常不人道的获取方式。因此，为有效解决熊胆粉的资源问题，前期我们开发了一种人工孵育熊胆粉的技术方法——利用生物转化技术，通过体外模拟肝肠循环过程，把禽畜胆汁生物转化为与天然熊胆粉化学等值的人工熊胆粉(cn201410588581.5)。值得注意的是，在该生物转化过程中产生了关键中间体7-羰基-牛磺熊去氧胆酸(t-7-klca)，且药理活性研究表明t-7-klca亦具有良好的保肝、利胆和溶石的作用。因此，研究并建立该物质的质量标准，对于实现相关牛磺熊去氧胆酸的生物转化制备工艺及质量控制具有重要意义。
然而，现有t-7-klca的制备方法鲜有报道，且已报道的主要方法合成路线较长，得率较低，纯化难度大，且至今未见晶体纯化的报道(chemicalandpharmaceuticalbulletin,1987,35(11):4562-4567)。基于此，我们通过大量的实验，最终发明了一种采用化学合成的方法以7-klca为原料，经酰胺化高收率的得到t-7-klca的方法，再经系统萃取纯化和重结晶精制，最终得到t-7-klca白色晶体并首次报道该物质的晶体结构。
技术实现要素：
本发明的目的在于提供一种7-羰基-牛磺熊去氧胆酸晶体化合物及其制备方法。本发明首次公开了一种晶体化合物，同时本发明的制备方法不仅可以大大缩短反应时间，而且实验操作简单，合成试剂价廉易得。
本发明的上述目的是通过下述的技术方案加以实现的。
本发明提供一种7-羰基-牛磺熊去氧胆酸晶体化合物，其用粉末x射线衍射测定法测定，以2θ±0.2°衍射角表示的x射线粉末衍射图谱在5.1°、10.1°、13.8°、14.3°、15.1°、17.6°、18.0°、18.3°、19.0°、21.0°、22.3°、23.2°、24.2°、24.9°、25.6°、27.4°、29.3°、30.8°、32.3°、34.0°、36.1°、和37.5°处显示出特征衍射峰。
此外，本发明所提供的7-羰基-牛磺熊去氧胆酸晶体化合物含有2个结晶水。
本发明的合成方程式如下：
本发明提供的一种7-羰基-牛磺熊去氧胆酸晶体化合物的制备方法，具体步骤如下：
(1)合成7-羰基-牛磺熊去氧胆酸
将7-羰基-熊去氧胆酸(7-klca)，亚磷酸三乙酯，2,2’-二硫二苯并噻唑加入到有机溶剂中，滴加有机碱溶液，滴加完毕后继续搅拌反应至完全，得到7-klca-2-苯并噻唑硫酯和有机溶剂的混合物，然后于冰浴下将牛磺酸钠水溶液滴加至上述混合物中，室温搅拌过夜至反应完全；
(2)萃取纯化
反应完毕后加酸溶液调ph至3-4，静置分层，水层用有机溶剂萃取洗涤，再用浓盐酸调ph至1-2，于0-5℃搅拌2小时，抽滤，滤饼用少量丙酮洗涤，再用丙酮的水溶液洗涤，干燥后得到白色粉末状的t-7-klca粗品；
(3)重结晶
将得到的t-7-klca粗品，用丙酮的水溶液溶解，过滤除去不溶物，所得滤液静置于0-15℃冷却结晶，过夜，得到白色晶体，对所得晶体减压抽滤，丙酮洗涤，得到7-羰基-牛磺熊去氧胆酸晶体粉末。
本发明中，步骤(1)中，所述的有机溶剂选自正丁醇、甲酸乙酯、乙酸甲酯、乙酸乙酯、乙酸丙酯、乙酸丁酯、甲基叔丁基醚、四氢呋喃、1,4-二氧六环、乙醚、n,n-二甲基甲酰胺、二甲亚砜、1,2-二氯乙烷、二氯甲烷、氯仿和四氯化碳中的一种或几种。
本发明中，步骤(1)中，所述的有机碱为吡啶、三乙胺和二异丙基乙二胺中的一种或几种。
本发明中，步骤(2)中，所述丙酮的水溶液中丙酮的体积百分数为0％～100％。
本发明中，步骤(2)中，所述的酸溶液选自h2so4，h2so3，hcl，h3po4，hno3，hbr，acoh和cf3cooh中的一种或多种。
本发明中，步骤(3)中，所述丙酮的水溶液中丙酮的体积百分数为40％～70％。
本发明的有益效果如下：
本发明所提供的7-羰基-牛磺熊去氧胆酸晶体化合物、其晶型参数及制备方法系首次报道。本发明经简单的一锅法制得到了t-7-klca，然后经萃取除杂和重结晶工艺后，得到目标结晶产物，收率高，一般在80％以上。本发明所需的反应试剂低廉、易得，且反应原子经济性强。
附图说明
图1是根据本发明的实施例1所述的方法制备的t-7-klca晶体化合物的红外光谱谱图。
图2是根据本发明的实施例1所述的方法制备的t-7-klca晶体化合物的13cnmr图。
图3是根据本发明的实施例1所述的方法制备的t-7-klca晶体化合物的x射线粉末衍射图。
图4是根据本发明的实施例1所述的方法制备的t-7-klca晶体化合物的x单晶衍射图。
具体实施方式
实施例1：t-7-klca晶体的制备
将7-klca(0.9764g，2.5mmol)，亚磷酸三乙酯(500μl)和2,2’-二硫二苯并噻唑(1.0g,3mmol)加入到乙酸乙酯(6.25ml)溶液中，室温搅拌1小时。滴加含三乙胺(700μl)的乙酸乙酯(1300μl)溶液(共2ml)，滴加完毕，升温至35-40℃反应2.5小时，得到7-klca-2-苯并噻唑硫酯的乙酸乙酯溶液。将牛磺酸(0.375g,3mmol)，氢氧化钠(0.11g,2.75mmol)加入5ml水中，冰水浴搅拌20分钟。之后将制得的牛磺酸钠溶液滴加至上述7-klca-2-苯并噻唑硫酯的乙酸乙酯溶液中，室温搅拌12小时。
反应完毕后，加10％稀盐酸调ph至3-4，静置分层，水层用乙酸乙酯(约5-10ml)萃取洗涤，再用浓盐酸调ph至1-2，于0-5℃搅拌2小时，抽滤，滤饼用少量丙酮洗涤，再用95％的丙酮水溶液洗涤，得到白色粉末状滤饼，即为t-7-klca粗品。
将上述粗品用45％的丙酮水溶液20ml溶解，过滤除去不溶物，所得滤液静置于0-15℃冷却结晶，过夜，得到白色晶体，对所得晶体再经反复重结晶后，用布氏漏斗减压抽滤，丙酮洗涤，得到白色结晶性粉末。所得结晶性粉末进一步经减压(<20mmhg)干燥至干，得到t-7-klca白色晶体0.99g，总收率80％。
图1是根据本发明的实施例1所述的方法制备的t-7-klca晶体化合物的红外光谱谱图。图2是根据本发明的实施例1所述的方法制备的t-7-klca晶体化合物的13cnmr图。
mp:236.0～238℃.
ir(kbr)v:3536.3,3459.7,3281.3,1707.7,1607.9,1238.1,1158.5,1023.0.
1hnmr(dmso,500mhz):δ7.79(brs,1h),3.38-3.37(m,3h),2.90-2.87(m,1h),2.64-2.59(m,2h),2.51-2.43(m,2h),1.93-1.68(m,10h),1.49-1.04(m,19h),1.01-0.98(m,3h),0.86(m,3h).
13cnmr(dmso,500mhz):211.6,172.5,69.2,54.4,50.7,48.9,48.7,45.5,45.2,42.3,38.7,37.5,35.42,34.9,34.8,33.9,32.6,31.6,29.9,27.9,24.5,22.9,21.3,18.5,12.0.
图3是根据本发明实施例1所述的方法制备的t-7-klca晶体化合物的x射线粉末衍射图。结果显示：以2θ±0.2°衍射角表示的x射线粉末衍射图谱在5.1°、10.1°、13.8°、14.3°、15.1°、17.6°、18.0°、18.3°、19.0°、21.0°、22.3°、23.2°、24.2°、24.9°、25.6°、27.4°、29.3°、30.8°、32.3°、34.0°、36.1°、和37.5°处显示出特征衍射峰。
图4是根据本发明实施例1所述的方法制备的t-7-klca晶体化合物的x单晶衍射图。
实施例2：t-7-klca晶体的制备
将7-klca(0.9764g，2.5mmol)，亚磷酸三乙酯(500μl)，2,2’-二硫二苯并噻唑(1.0g,3mmol)加入到二甲基亚砜(6.25ml)中，室温搅拌0.5小时。然后缓慢滴加二异丙基乙二胺溶液(800μl)，滴加完毕，升温至35-40℃反应6小时，得到7-klca-2-苯并噻唑硫酯的二甲基亚砜溶液。将牛磺酸(0.375g,3mmol)，氢氧化钠(0.11g,2.75mmol)加入5ml水中，冰水浴搅拌20分钟。之后将制得的牛磺酸钠溶液滴加至上述7-klca-2-苯并噻唑硫酯的二甲基亚砜溶液中，室温搅拌12小时。
反应完毕后，加10％稀硫酸调ph至3-4，静置分层，水层用乙酸乙酯(约5-10ml)萃取洗涤，再用浓盐酸调ph至1-2，于0-5℃搅拌2小时，抽滤，滤饼用少量丙酮洗涤，再用90％的丙酮水溶液洗涤，得到白色粉末状滤饼，即为t-7-klca粗品。
将上述粗品用50％的丙酮水溶液20ml溶解，过滤除去不溶物，所得滤液静置于0-15℃冷却结晶，过夜，得到白色晶体，对所得晶体再经反复重结晶后，用布氏漏斗减压抽滤，丙酮洗涤，得到白色结晶性粉末。所得结晶性粉末进一步经减压(<20mmhg)干燥至干，得到t-7-klca白色晶体1.02g，总收率82％。
mp:236.0～238℃.
ir(kbr)v:3536.3,3459.7,3281.3,1707.7,1607.9,1238.1,1158.5,1023.0.
1hnmr(dmso,500mhz):δ7.79(brs,1h),3.38-3.37(m,3h),2.90-2.87(m,1h),2.64-2.59(m,2h),2.51-2.43(m,2h),1.93-1.68(m,10h),1.49-1.04(m,19h),1.01-0.98(m,3h),0.86(m,3h).
13cnmr(dmso,500mhz):211.6,172.5,69.2,54.4,50.7,48.9,48.7,45.5,45.2,42.3,38.7,37.5,35.42,34.9,34.8,33.9,32.6,31.6,29.9,27.9,24.5,22.9,21.3,18.5,12.0.
实施例3：t-7-klca晶体稳定性研究
对实施例1、2制备的t-7-klca晶体分别进行了稳定性研究，包括高温高湿光照试验(温度60℃、湿度90％±5％、光照4500lx)、加速试验(6个月，温度40℃±2℃、相对湿度75％±5％)、长期试验(12个月，温度25℃±2℃、相对湿度60％±10％)及经研磨、压片后进行x射线粉末衍射测试。
试验结果表明：(1)实施例1、2中制备的晶体化合物在高温高湿光照条件下、以及在加速试验6个月和长期留样12个月后，以2θ±0.2°衍射角表示的x射线粉末衍射图谱均未发生显著变化，说明本发明的实施方式所提供的晶体化合物在存储过程中晶型稳定性好，符合药用需求。(2)实施例1、2中制备的晶体化合物经研磨、压片后，以2θ±0.2°衍射角表示的x射线粉末衍射图谱均未发生显著变化，说明本发明的实施方式所提供的晶体化合物在制剂过程中晶型稳定性好。