本发明涉及药物与化工
技术领域：
，更具体地，涉及一种3,3'-双取代联吡啶衍生物及其制备方法和应用。
背景技术：
：阿尔茨海默病(alzheimer′sdisease,ad)，又称为老年痴呆，是一种慢性、进行性的中枢神经系统退行性疾病。近年来，随着社会的发展以及人们生活水平的提高，世界人口日趋老年化，因此ad的发病率逐年攀升，已经成为严重威胁老年人生命健康和生活质量的主要疾病之一。迄今为止，关于ad的发病机制尚未明确，可能涉及基因缺陷、代谢紊乱、自由基损伤、免疫神经炎症、神经元凋亡及环境毒素等多方面因素。针对这些因素，人们已经提出了许多假说，目前较为公认的是淀粉样蛋白级联假说，该假说认为aβ蛋白的聚集是导致大脑神经变性的主要原因。其中aβ是一种由淀粉样蛋白前体的c-末端裂解出来的39～43个残基的肽，含量最多的是aβ40和aβ42，aβ42的神经毒性更强。根据淀粉样蛋白级联假说，aβ在突触间隙的增加可导致毒性寡聚体的形成，这些毒性寡聚体进而再聚合形成不溶性聚集物和纤维，最终导致淀粉样蛋白的沉积。过量aβ的沉积可导致一系列的炎症反应，进而导致神经元的丢失和认知功能的下降。然而，aβ的自聚集特性还不足以解释ad患者特定大脑区域内肽的积累。另外，有研究发现，ad患者的老年斑中金属离子浓度异常高，如铜离子和铁离子等。这些金属离子能影响到aβ的合成、降解和清除。而aβ是金属离子结合蛋白，其上有金属离子结合位点，它可与金属离子结合并形成不溶性的金属-aβ复合物，增强aβ的神经毒性，并催化加速体内活性氧ros的生成，从而导致氧化损伤，诱导细胞凋亡。这些研究表明淀粉样蛋白病理学的出现与这些金属离子的失调有关。因此，基于金属-aβ在ad中的作用，人们提出通过金属络合治疗方式来扰乱金属-aβ的相互作用，从而减少金属-aβ的神经毒性，恢复大脑内金属离子平衡。综上所述，为了进一步研究金属离子与aβ的关系，以及找到更好的治疗ad的有潜力的药物，设计合成基于金属-aβ的金属螯合剂，即具有抑制aβ聚集活性，金属离子络合，抑制金属离子诱导的aβ聚集的小分子化合物可能是治疗ad的有效策略。技术实现要素：本发明的目的是针对现有技术的不足，提供一种新的3,3'-双取代联吡啶衍生物。本发明的另一个目的在于提供上述衍生物的制备方法，以及该类化合物在制备预防和/或治疗阿尔茨海默病、脑血管痴呆或重症肌无力疾病的药物。3,3'-联吡啶二胺是一个较好的cu2+和zn2+的螯合剂，同时文献报导联吡啶类化合物在细胞中具有一定的神经保护作用，并具有抗氧化应激作用。因此，为了增强联吡啶化合物的抑制aβ聚集的作用，本专利在联吡啶母核上引入易与aβ作用的芳香基团，设计和合成一系列新的3,3'-双取代联吡啶衍生物，并证实了这些化合物具有抑制aβ聚集，金属离子络合和抑制金属离子诱导的aβ聚集的活性。本发明的上述技术目的通过以下技术方案实现：本发明提供了一种3,3'-双取代联吡啶衍生物，所述3,3'-双取代联吡啶衍生物的结构式如式(i)和(ⅱ)所示，其中，r为-h，羟基，卤素，-o(ch2)mch3，被1个或多个甲基或乙基取代的氨基；r1为-o(ch2)mch3，-oh；n为0～3中任意一个整数；m为0～3中任意一个整数；r2为c1～c5的脂肪烃，被1个或多个甲基或乙基取代的氨基、优选地，所述3,3'-双取代联吡啶衍生物的结构式如下所示：本发明同时提供所述的3,3'-双取代联吡啶衍生物的制备方法，包括以下步骤：s1.将和活化的铜粉混合，溶于适当的溶剂，氮气保护下回流反应数小时，得到化合物s2.将与二水合氯化亚锡在浓盐酸中加热发生还原反应得到化合物s3.将与不同的羧酸进行缩合反应得到目标产物其中，r为-h，卤素，-o(ch2)mch3，被1个或多个甲基或乙基取代的氨基；r1为-o(ch2)mch3，-oh；n为0～3中任意一个整数；m为0～3中任意一个整数；r2为c1～c5的脂肪烃，被1个或多个甲基或乙基取代的氨基、优选地，目标产物通过柱层析或重结晶进行纯化。本发明同时提供所述的3,3'-双取代联吡啶衍生物的应用，具体地，是应用于制备预防和/或治疗阿尔茨海默病、脑血管痴呆或重症肌无力疾病的药物。所述的制备预防和/或治疗阿尔茨海默病、脑血管痴呆或重症肌无力疾病的药物的剂型为片剂、丸剂、胶囊、注射剂、悬浮剂或乳剂。本发明提供的3,3'-双取代联吡啶衍生物对aβ的自聚集都有较好的抑制活性，在测试浓度20μm下，对aβ自聚集的抑制率均大于65％，其中化合物3d表现出最强的抑制活性，达到93.3％；紫外-可见分光光度法测试抑制活性最强的化合物3d与金属离子的螯合作用发现化合物3d能较好地螯合cu2+和fe2+；并能通过螯合金属离子作用抑制金属离子诱导的aβ的聚集，它可以减少96.9％的由cu2+诱导的aβ聚集，减少75.5％的由fe2+诱导的aβ聚集。mtt法测试本专利化合物对sh-sy5y细胞的毒性表明本专利化合物具有较低的细胞毒性，其中化合物3d对sh-sy5y细胞的ic50值为143.8μm，具有较高的安全性。因此本发明所述的3,3'-双取代联吡啶衍生物可作为基于金属-aβ作用的双功能试剂用于制备抗阿尔茨海默症的药物。与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：本发明所述的化合物具有较好的抑制aβ聚集活性，且与铜离子显示出较好的螯合作用，并能通过螯合金属离子抑制cu2+诱导的aβ聚集，这为进一步研究金属离子参与ad的病理学过程提供物质基础。所述的衍生物制备方法简单，步骤少，原料价廉，对阿尔茨海默症的aβ聚集及金属离子诱导的aβ聚集具有显著抑制作用，尤其是细胞毒性较小，安全性高，可以制成基于金属-aβ作用的抗阿尔茨海默症药物，具有很高的医学价值和广阔的市场前景。附图说明图1：化合物3d与金属离子作用的紫外光谱图。图2：化合物3c～3e抑制金属离子诱导的aβ聚集具体实施方式以下通过具体的实施例和附图进一步说明本发明的技术方案。除非特别说明，本发明采用的试剂、设备和方法为本
技术领域：
常规市购的试剂、设备和常规使用的方法。实施例1:n,n'-[(2,2'-联吡啶基)-3,3'-二基]双(4-氯苯甲酰胺)(化合物3a)的合成将4-氯苯甲酸0.20g，n,n-二异丙基乙胺(diea)0.14ml加入到含有8mldmf的圆底烧瓶中，搅拌让固体完全溶解，并用冰浴冷却至0～5℃。加入2-(7-氧化苯并三氮唑)-n,n,n',n'-四甲基脲六氟磷酸酯(hatu)0.21g后，搅拌5min，再加入3,3'-二氨基-2,2'-联吡啶0.10g，冰浴搅拌10min后，自然升温到室温反应，tlc跟踪，反应结束后将其反应液倒入20ml冰水中，搅拌，有淡黄色固体析出。固体抽滤，水洗，干燥。粗产品通过硅胶层析纯化，得到淡黄色粉末3a，收率81％。1hnmr(400mhz,cdcl3):δ14.35(s,2h),9.39(s,2h),8.42(s,2h),7.65(d,j＝8.0hz,4h),7.47(d,j＝8.0hz,4h),7.02(s,2h).esi-msm/z:464.3[m+h]+。实施例2:化合物3b的合成方法同实施例一，所不同的是用苯甲酸代替4-氯苯甲酸，粗产物通过硅胶柱层析纯化，得到淡黄色固体3b，收率84％。1hnmr(400mhz,cdcl3)δ14.56(s,2h),9.43(d,j＝7.9hz,2h),8.42(s,2h),8.08(d,j＝5.7hz,4h),7.57(d,j＝7.0hz,6h),7.48-7.45(m,2h)..esi-msm/z:395.5[m+h]+。实施例3:化合物3c的合成方法同实施例一，所不同的是用3,4-二甲氧基苯甲酸代替4-氯苯甲酸，粗产物通过硅胶层析纯化，得到白色固体3c，收率85％。1hnmr(400mhz,cdcl3):δ14.35(s,2h),9.39(s,2h),8.42(s,2h),7.64(s,4h),7.45(s,2h),7.02(s,2h),3.99(s,12h).esi-msm/z:515.5[m+h]+。实施例4:化合物3d的合成方法同实施例一，所不同的是用4-二甲氨基苯甲酸代替4-氯苯甲酸，粗产物通过硅胶层析纯化，得到浅黄色固体3d，收率84％。1hnmr(400mhz,cdcl3):δ8.72(s,2h),8.48-8.39(m,2h),8.14-8.12(m,4h),7.45-7.42(m,2h),6.76(d,j＝3.9hz,4h),3.13(s,12h).esi-msm/z:481.6[m+h]+。实施例5:化合物3e的合成方法同实施例一，所不同的是用2-羟基苯甲酸代替4-氯苯甲酸，粗产物通过硅胶层析纯化，得到淡黄色固体3e，收率72％。1hnmr(400mhz,cdcl3):δ14.72(s,2h),12.31(s,2h),9.02(s,2h),8.41(s,2h),8.08(s,2h),7.95-7.91(m,2h),7.49-7.43(m,2h),7.38-7.32(m,2h),7.02(s,2h).esi-msm/z:427.4[m+h]+。实施例6:化合物3f的合成方法同实施例一，所不同的是用苯乙酸代替4-氯苯甲酸，粗产物通过硅胶层析纯化，得到白色固体3f，收率83％。1hnmr(400mhz,cdcl3):δ13.21(s,2h),9.04(d,j＝8.3hz,2h),8.28(s,2h),7.48(s,2h),7.39-7.36(m,6h),7.03(d,j＝9.8hz,4h),3.79(s,4h).esi-msm/z:423.5[m+h]+。实施例7:化合物3g的合成方法同实施例一，所不同的是用4-甲氧基苯甲酸代替4-氯苯甲酸，粗产物通过硅胶层析纯化，得到淡黄色固体3g，收率85％。1hnmr(400mhz,cdcl3):δ14.53(s,2h),9.28(s,2h),8.33(s,2h),8.05(s,4h),7.14(s,4h),7.01(s,2h),3.90(s,6h).esi-msm/z:455.5[m+h]+。实施例8:化合物3h的合成方法同实施例一，所不同的是用2,2-二甲基丙酸代替4-氯苯甲酸，粗产物通过硅胶层析纯化，得到白色固体3h，收率87％。1hnmr(400mhz,cdcl3):δ13.17(s,2h),9.15(d,j＝8.4hz,2h),8.34(d,j＝4.0hz,2h),7.42-7.37(m,2h),1.34(s,18h).esi-msm/z:355.3[m+h]+。实施例9:化合物3i的合成方法同实施例一，所不同的是用乙酸代替4-氯苯甲酸，粗产物通过硅胶层析纯化，得到浅黄色固体3i，收率86％。1hnmr(400mhz,cdcl3):δ12.98(s,2h),9.08(d,j＝8.6hz,2h),8.35(d,j＝4.5hz,2h),7.40(dd,j＝8.5,4.6hz,2h),2.24(s,6h).esi-msm/z:271.4[m+h]+。实施例10:化合物3j的合成方法同实施例一，所不同的是用3-二乙胺基丙酸代替4-氯苯甲酸，粗产物通过硅胶层析纯化，得到浅黄色固体3i，收率80％。1hnmr(400mhz,cdcl3):δ12.86(s,2h),9.04(d,j＝8.5hz,2h),8.34(t,j＝4.5hz,2h),7.36(dd,j＝8.4,4.6hz,2h),2.89(t,j＝7.2hz,4h),2.60-2.52(m,12h),1.02(t,j＝7.1hz,12h).esi-msm/z:441.7[m+h]+。实施例11:化合物3k的合成方法同实施例一，所不同的是用3-(4-甲基哌嗪-1-基)-丙酸代替4-氯苯甲酸，粗产物通过硅胶层析纯化，得到淡黄色固体3k，收率78％。1hnmr(400mhz,cdcl3):δ12.91(s,2h),9.01(dd,j＝8.5,1.4hz,2h),8.36(dd,j＝4.5,1.4hz,2h),7.38(dd,j＝8.5,4.6hz,2h),2.80(d,j＝7.2hz,4h),2.64(d,j＝7.2hz,4h),2.57(s,8h),2.43(s,8h),2.28(s,6h).esi-msm/z:495.9[m+h]+。实施例12:化合物3l的合成方法同实施例一，所不同的是用3-(吡咯-1-基)-丙酸代替4-氯苯甲酸，粗产物通过硅胶层析纯化，得到淡黄色固体3l，收率82％。1hnmr(400mhz,cdcl3):δ12.82(s,2h),8.99(d,j＝8.4hz,2h),8.37(d,j＝4.4hz,2h),7.38(dd,j＝8.0,4.6hz,2h),2.89(t,j＝7.1hz,4h),2.67(t,j＝8.2hz,4h),2.55(s,8h),1.74(s,8h).esi-msm/z:437.7[m+h]+。实施例13：本专利所述3,3'-双取代联吡啶衍生物对aβ自聚集的抑制作用选择实施例1～12制备的化合物，采用tht法进行aβ自聚集抑制活性测定。1.溶液的配制：(1)20mmph7.4磷酸盐缓冲溶液(pbs)：称取3.618gna2hpo4和0.6027gkh2po4，加入100ml超纯水，待固体完体溶解后，用超纯水定容至200ml，调节溶液ph值至7.4即可。(2)aβ1-42蛋白溶液：将1mg蛋白溶解于100μl的1％nh4oh溶液中，溶液浓度为2300μm，贮存于-80℃冰箱备用。使用时用pbs缓冲液稀释为40μm。(3)50mm甘氨酸-naoh缓冲液：称取0.938g甘氨酸，溶解于250ml的超纯水中，用1mol/lnaoh溶液调整ph至8.50，存于4℃冰箱。(4)5μm硫磺素t溶液(现配现用)：称取硫磺素t粉末2.2mg溶解于689μlph8.5的甘氨酸-naoh缓冲液中，超声使固体完全溶解，避光放置。(5)化合物溶液的制备：用精密分析天平准确称取化合物适量,用dmso稀释为浓度为10mm的透明溶液，使用时用磷酸缓冲液稀释到测试浓度。2.抑制活性测试：分别取10μl40μm的aβ1-42蛋白与10μl浓度为40μm的化合物混匀，置于恒温箱中，37℃孵育48h。空白对照为10μl40μm的aβ1-42蛋白与10μl的ph7.4磷酸缓冲液混合共同孵育；阳性对照为aβ1-42蛋白与白藜芦醇共同孵育。72h后，将孵育液转移至黑色96孔板中，加入180μl5μm的硫磺素t溶液，室温下于暗处静置于反应5min。最后，用多功能酶标仪测量荧光吸收值，其中激发波长为450nm，吸收波长485nm，以阴性对照试验中aβ1-42与硫磺素t结合的荧光强度为对照，求出化合物对aβ1-42蛋白聚集的抑制率。结果如表1所示。结果表明本专利所述大部分化合物对aβ1-42具有较强的抑制作用，在20μm浓度下其抑制率均大于65％，其中化合物3d表现出最强的抑制活性，达到93.3％。因此本发明所述的3,3'-双取代联吡啶衍生物极具有开发前景，可用于制备抗阿尔茨海默症的药物。表13,3'-双取代联吡啶衍生物对aβ1-42自聚集的抑制活性化合物aβ1-42自聚集抑制率化合物aβ1-42自聚集抑制率3a85.9±1.23h68.1±1.73b88.5±1.53i64.9±1.33c90.2±1.43j83.5±1.33d93.3±0.83k74.8±1.53e91.5±1.13l77.6±1.13f88.1±1.8resveratrol79.2±1.53g89.3±1.5实施例14:本专利所述3,3'-双取代联吡啶衍生物3d的金属络合实验选择实施例4制备的化合物，采用uv-vis法进行化合物的金属络合能力测定。1.溶液的配制：(1)化合物3d溶液：称取一定量化合物用无水乙醇配制到1mm。(2)金属离子溶液：称取一定量的znso4,cuso4和feso4用ddh2o配制成10mm，再用无水乙醇稀释到1mm。2.化合物3d与znso4,cuso4,和feso4的作用取3支1.5ml梨形管，分别加入20μl1mm3d化合物溶液，再分别加入20μl1mmznso4,cuso4,和feso4溶液，最后补加入无水乙醇使总体积为1000μl，3d与金属离子的终浓度均为20μm。空白对照为20μl1mm化合物溶液补加无水乙醇至与样品中化合物浓度相同。混匀后在室温下放置30min，倒入石英皿用紫外-可见光谱仪扫描吸收曲线。测试温度为室温，测试范围为200-600nm，波长间隔为1nm，扫描速率为200nm/min，每个样品测试三次，取平均值。结果如图1所示。结果表明本专利所述化合物3d具有较强的金属络合能力，并且对cu2+，fe2+具有较好的选择性。因此本发明所述的3,3'-双取代联吡啶衍生物衍生物可络合体内过多的铜离子，可用于制备抗阿尔茨海默症的药物。实施例15：本专利所述3,3'-双取代联吡啶衍生物3c～3e对金属离子诱导的aβ聚集的抑制作用选择实施例3～5制备的化合物，采用tht法进行金属离子诱导的aβ聚集抑制活性测定。1.溶液的配制：(1)20μmol/lph6.6hepes(150μmol/lnacl)溶液配制：称取hepes2.38mg，nacl4.38mg加入纯水定容至500ml，用少量naoh溶液调ph为6.6。(2)75μmcu2+溶液配制：从10mmcuso4溶液中取7.5μl，用20μmol/lph6.6hepes(150μmol/lnacl)溶液稀释至1ml。(3)75μmfe2+溶液配制：从10mmfeso4溶液中取7.5μl，用20μmol/lph6.6hepes(150μmol/lnacl)溶液稀释至1ml。(4)75μm化合物配制：从10mm化合物储备液中取7.5μl，用20μmol/lph6.6hepes(150μmol/lnacl)溶液稀释至1ml。(5)75μmaβ1-42溶液配制：取一管储备液(10μl，1000μm)，加123μl20μmol/lph6.6hepes(150μmol/lnacl)使其浓度为75μm。每管10μl分装。2.样品制备测试样品：取2μl分装好的aβ1-42，加入2μl浓度75μm的cu2+或fe2+，室温孵育2min；再加化合物2μl。混匀37℃孵育24h。对照样品1：取2μl分装好的aβ1-42，加入2μl浓度75μm的cu2+，再加20μmol/lph6.6hepes(150μmol/lnacl)溶液2μl，混匀37℃孵育24h。对照样品2：取2μl分装好的aβ1-42，加入2μl浓度75μm的fe2+，再加20μmol/lph6.6hepes(150μmol/lnacl)溶液2μl，混匀37℃孵育24h。对照样品3：取2μl分装好的aβ1-42，加入20μmol/lph6.6hepes(150μmol/lnacl)溶液4μl，混匀37℃孵育24h。3.抑制金属离子诱导的aβ聚集的活性测试：参照实施例13中aβ自聚集抑制活性测试方法。结果如图2所示。结果表明cu2+和fe2+可以促进aβ1-42的聚集，其中cu2+诱导聚集的作用较fe2+显著。当加入上述化合物共同孵育后，样品的荧光值大大降低。其中化合物3d作用尤为明显，它可以减少96.9％的由cu2+诱导的aβ1-42聚集，减少75.5％的由fe2+诱导的aβ1-42聚集，且这种抑制效果好于白藜芦醇(减少85.3％的由cu2+诱导的aβ1-42聚集，减少65.7％由fe2+诱导的aβ1-42聚集)，这说明3d可以螯合cu2+和fe2+，从而阻止cu2+和fe2+诱导的aβ聚集。其中，化合物3d对cu2+诱导的aβ的抑制活性高于fe2+诱导的aβ聚集的抑制活性。实施例16:本专利所述化合物对神经细胞毒性的研究选择实施例1～12制备的化合物，采用mtt法进行化合物对sh-sy5y细胞毒性测试。1.溶液配制(1)dmem培养基：用1000ml的烧杯将干粉培养基溶于300ml的超纯水中，再用300ml的超纯水冲洗包装内面两次，合并溶液，磁力搅拌使之完全溶解。加入3.7g碳酸氢钠，2.38ghepes，磁力搅拌使完全溶解。搅拌下用10m的氢氧化钠调节ph为7.5，于超净台中用0.22μm滤膜过滤除菌，于4℃冰箱中保存。使用时加入抗生素(最终浓度青霉素为100u/ml，链霉素100μg/ml)和血清(10％)。(2)pbs缓冲溶液：准确称取8gnacl、0.2gkh2po4和2.88gna2hpo4·12h2o，用超纯水定容至1l，120℃高压灭菌20min，4℃冰箱中保存。(3)mtt溶液：用pbs溶液配制成5g/l，用0.22μm滤膜过滤除菌，4℃冰箱中避光保存。2.神经细胞sh-sy5y的培养取神经细胞株sh-sy5y，用含有10％胎牛血清，100u/ml青霉素和100μg/ml链霉素的dmem培养基，在温度为37℃、湿度饱和、环境为5％co2及95％空气的培养箱中常规培养，2-3天传代一次。3.神经细胞毒性测定(1)取对数生长期细胞，用0.25％胰酶消化后，pbs洗涤两次，使完全培养基重新悬浮，在显微镜下用细胞计数板计数并调整细胞浓度为5×104个/ml，接种于96孔细胞培养板，100μl/孔，培养24h使细胞贴壁。(2)吸去原培养基，加入用培养基稀释后的不同浓度的化合物溶液，每孔100μl，设5个复孔。空白及对照组加入培养基代替化合物，置于37℃、5％co2培养箱培养48h。实验终止前4h加入含5mg/mlmtt的培养基至样品组和对照组，100μl/孔，继续培养4h。(3)弃去上清，每孔加dmso100μl，振荡使生成物formazan充分溶解，在全波长酶标仪上测定每孔吸光度值(od值)，测定波长570nm。各样品中细胞存活率(％)＝(od样品-od空白)/(od对照-od空白)×100％；各样品细胞抑制率(％)＝100％-各样品细胞存活率(％)再用抑制率对浓度作图，抑制率为50％的浓度即为化合物ic50值。结果如表2所示。结果表明本专利化合物对sh-sy5y细胞的ic50值均大于90μm，显示出较低的神经细胞毒性。可见，本专利所述的化合物相对比较安全，这为进一步开发新药提供了保障。表2mtt法测试化合物对sh-sy5y细胞的毒性结论：从表1数据发现所有测试的3,3'-双取代联吡啶衍生物对aβ的自聚集都有较好的抑制活性，在测试浓度20μm下，对aβ自聚集的抑制率均大于65％，其中化合物3d表现出最强的抑制活性，达到93.3％；紫外-可见分光光度法测试发现化合物3d具有较强的螯合cu2+和fe2+的能力，并且能抑制cu2+和fe2+诱导的aβ聚集，它可以减少96.9％的由cu2+诱导的aβ聚集，减少75.5％的由fe2+诱导的aβ聚集；mtt法测试化合物对sh-sy5y细胞的毒性表明本专利所述化合物具有较低的细胞毒性，其中化合物3d对sh-sy5y细胞的ic50值为143.8μm，具有较高的安全性。因此本发明所述的3,3'-双取代联吡啶衍生物可作为基于金属-aβ作用的多功能试剂用于制备抗阿尔茨海默症的药物。当前第1页12