本发明涉及组织工程领域，具体涉及一种心脏干细胞的制备方法及其应用。
背景技术：
干细胞的分类，按细胞来源可以将干细胞分为三类：胚胎干细胞，诱导多能干细胞和成体干细胞。
胚胎干细胞，它是从早期胚胎内的细胞团分离出来的一种高度未分化的细胞系，具有与早期胚胎细胞相似的形态特征和很强的分化能力，它可以无限增殖并分化成为全身200多种细胞类型，进一步形成机体的所有组织、器官。胚胎干细胞属于全能干细胞，可以发育为所有组织器官，因此，理论上可以作为治疗心脏疾病的干细胞。但事实上由于伦理及免疫排斥等问题，胚胎干细胞虽然是一种全能干细胞，但它却很难在临床使用。
诱导多能干细胞，是一种来源于成体细胞，通过植入4个经过重新编码的基因诱导的“强迫”表达的某些基因，使这些成体细胞具备类似于胚胎干细胞的功能(诱导返祖)的干细胞。和胚胎干细胞具有相似的临床应用困境：其来源问题也存在宗教、法律及伦理层面的限制；另外由于培养基及模拟环境的问题，可能存在扩增及诱导后的变异及癌变问题。特别是由于诱导技术及质量控制很难，操作成本极高，所以临床难以普及开展。
成体干细胞，是存在于所有组织中的原始细胞，具有自我更新和一定的分化潜能的不成熟细胞，具有向一种或几种类型的成熟细胞分化的潜能。成体干细胞存在的生理意义是更新正常衰老死亡的细胞，维持机体的正常组织结构与功能。成体干细胞具有来源丰富、可塑性强、离成熟细胞近和具有多向分化潜能等特点。而且可以实施个体化治疗，无免疫排斥等问题，因此是最具有临床应用优势的种子干细胞。
心脏干细胞属于成体干细胞的范畴。众所周知，心脏是一个终末分化器官，心肌细胞没有再生能力。进一步的研究表明，在健康人的心脏里存在心脏干/祖细胞，约占心肌细胞的万分之一。心脏干细胞来源于心脏组织本身，在分化为心肌细胞及移植后在体存活方面具有一定的优势。因此，心脏干细胞可以作为治疗心脏疾病的理想干细胞。目前的研究表明，心内膜、心肌、心外膜均存在心脏干细胞。但由于心脏是一个重要的组织器官，从心内膜、心肌、心外膜中安全的获取心脏干细胞是一个关键性的医学难题。
心内膜心肌活检时取下的心肌组织可以用于制备心脏干细胞，心内膜心肌活检是一种使用特殊设备通过外周血管进入心室钳取心内膜及内膜下心肌组织进行病理学检查的诊断手段，主要存在以下缺陷：(1)制备心脏干细胞的材料来源为病理组织，制备得到的干细胞不是正常细胞，没有代表性。临床上心内膜心肌活检的主要用于病因不明的心脏疾病的诊断，如心肌炎、药物心脏毒性、心肌病、心律失常、心脏肿瘤、心脏移植排斥以及继发于系统疾病的心脏表现等。由此可见，此途径取材的心脏组织基本都是病态的，所获得的细胞不是正常细胞。(2)获取制备心脏干细胞的原材料的技术难度大，心内膜心肌活检技术要求高，且需要特殊仪器的配合，此方法依赖临床水平，操作困难，易导致临床并发症，风险很大。临床上心内膜心肌活检操作要求大型介入机械的x射线指导下，将导管及导丝从动脉或静脉系统插入心腔内取材。此方法依赖临床水平，对专业技术及手术医生的操作均有很高的要求。并且，心内膜心肌活检操作有很多的临床并发症，临床实施风险很大。(3)制备心脏干细胞所需材料的获取途径少：受上述技术及相关风险的限制，真正开展心内膜心肌活检的医院及相关单位很少，制备心脏干细胞的材料较难获取。所以，从此途径获得干细胞的临床实用性太差。也就是说，从心内膜心肌取心脏干细胞，临床实施技术难度高风险太大。因此，有必要提供一种方便操作、安全可靠的心脏干细胞的制备方法，用于制备得到具有代表性的心脏干细胞。
技术实现要素：
针对上述问题，本发明的目的在于一种方便操作、安全可靠的心脏干细胞的制备方法，用于制备得到具有代表性的心脏干细胞。
为实现上述目的，本发明提供了如下技术方案：
一种心脏干细胞的制备方法，包括以下步骤：
(1)获得活体壁层心包膜组织；
(2)从活体壁层心包膜组织获取壁层心包膜原代细胞；
(3)诱导壁层心包膜原代细胞上皮-间质转化；
(4)对上皮-间质转化后的细胞培养扩增，得心脏干细胞。
在其中一些实施例中，所述活体壁层心包膜组织源自非-胚胎的心脏组织。
在其中一些实施例中，步骤(2)所述从活体壁层心包膜组织获取壁层心包膜原代细胞的方法为植块法或酶消化法。
在其中一些实施例中，所述植块法包括以下步骤：
(1)在iv型胶原酶中剪碎壁层心包膜，离心后弃上清；
(2)加入胎牛血清，将剪碎的心包膜碎片转移到培养皿中，保持均匀分布；
(3)在所述心包膜碎片之间加入少量培养基，培养，使所述心包膜碎片贴壁；
(4)继续培养，即得壁层心包膜原代细胞。
在其中一些实施例中，步骤(3)所述诱导壁层心包膜原代细胞上皮-间质转化的方法为：低氧环境诱导或tgf-β诱导。
在其中一些实施例中，所述低氧环境诱导为：将壁层心包膜原代细胞置入低氧环境中培养，所述低氧环境中含有(1±0.3)％的o2。
在其中一些实施例中，步骤(1)所述获得活体壁层心包膜组织为：在开胸心脏手术或微创心脏手术时，从壁层心包膜组织取材。
在其中一些实施例中，步骤(1)所述获得活体壁层心包膜组织为：采用穿刺手术，从壁层心包膜组织取材。
在其中一些实施例中，所述穿刺手术的部位是：剑突与左肋缘夹角处，或胸骨左缘第五肋间、心绝对浊音界内侧1-2cm处。
本发明的目的还在于提供一种心脏干细胞的制备方法的在建立体外干细胞模型、干细胞库中的应用，具体技术方案如下：
上述心脏干细胞的制备方法在建立体外干细胞模型、干细胞库中的应用。
基于上述技术方案，本发明具有以下有益效果：
本发明所述的心脏干细胞的制备方法，通过发明人大量创造性劳动，获取活体壁层心包膜组织，在离体组织中，通过获取壁层心包膜原代细胞、并诱导促使上皮-间质转化，培养制备得到心脏干细胞，获取活体壁层心包膜组织的取材方便、安全、具有代表性。同时，由于壁层心包膜原代细胞中绝大多数细胞是上皮细胞，本发明采用的诱导方法促使壁层心包膜原代细胞的上皮-间质转化，可提高壁层心包膜原代细胞生成心脏干细胞的能力。
本发明所述的心脏的制备方法相对现有技术具有以下优势：
1、本发明所述心脏干细胞来自于非胚胎组织器官，隶属于成体干细胞的范畴。避开了胚胎干细胞由于伦理及技术难题而难以临床应用的困境。
2、制备心脏干细胞所需材料为壁层心包膜，其独立于心脏肌肉组织以外，是一类弹性膜组织，因此可以避免取材过程中而导致的心肌损伤而造成的安全性问题，因此该方法的获取原材料的步骤方便、安全可靠。
3、制备心脏干细胞所需材料的来源为活体非病变组织，所获得的干细胞具有代表性，可以避免坏死组织中细胞溶解及各种有毒有害物质的释放导致的干细胞损伤，有利于保障所获得干细胞的活性与功能。
4、本发明获得的干细胞可以用于大规模干细胞库的建立及临床应用。利用本方法制备得到的心脏干细胞，可以在体外建立细胞模型，其制备得到c-kit、sca-1、kdr-1等多种干细胞表型，可用于相关药物研究，满足不同的研究需要。
附图说明
图1为实施例1中的低氧环境诱导心包膜原代细胞emt转化前后的细胞形态；
图2为实施例1中的原代与传代培养形成的干细胞克隆形态；
图3为实施例1中干细胞克隆中三种心脏干细胞表型(c-kit、sca-1、kdr)免疫荧光染色结果；
图4为实施例2中的tgf-β1诱导心包膜原代细胞emt转化前后的细胞形态。
具体实施方式
本发明提供了一种方法安全可靠、易于操作的心脏干细胞的制备方法，用于制备得到具有代表性的心脏干细胞。为了便于理解本发明，下面将参照实施例对本发明进行更全面的描述，以下给出了本发明的较佳实施例。但是，本发明可以以许多不同的形式来实现，并不限于本文所描述的实施例。提供这些实施例的目的是使对本发明的公开内容的理解更加透彻全面。
除非另有定义，本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。在本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不是旨在于限制本发明。本文所使用的术语“及/或”包括一个或多个相关的所列项目的任意的和所有的组合。
以下所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对以下实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。
本发明采用常规手段获取活体心包膜组织：例如，心脏开胸手术患者或心脏微创手术的患者，无菌状态下切取适量的心包膜组织，放入装有无钙镁pbs的50ml离心管中；或彩超定位下，采用特殊装置，在胸骨左缘第五肋间，心绝对浊音界内测1-2cm部位处取材获得少量的心包膜组织，放入装有无钙镁pbs的50ml离心管中。
实施例1
本实施例的心脏干细胞由以下方法制备得到：
1、从活体壁层心包膜组织获取原代细胞(植块法)：
在装有5mliv型胶原酶的离心管中将心包膜剪碎，800rpm离心；
用移液枪吸掉上层清液，加入1ml新鲜的胎牛血清，将剪碎的心包膜碎片转移到大的培养皿中，保持均匀分布；
在组织块之间加入少量的常用的完全培养基(含imdm培养基，胎牛血清，青链霉素，β-巯基乙醇，l-谷氨酰胺)，放进培养箱中培养24小时(37℃，5％co2)，促使心包膜碎片贴壁；
第二天加入适量的培养基，继续培养；定期(3-5天)更换培养基；
待细胞长满80％左右时，向培养皿中加入0.1％iv胶原酶和0.25％胰蛋白酶共5ml，消化30秒，收集消化下来的原代细胞，离心(3000rmp，5min)，弃去消化酶，加入新鲜的培养基，按适当密度(2×104/cm2)接种于新的培养皿中。
2、诱导原代心包膜细胞上皮-间质转化(emt)：
采用低氧环境诱导心包膜原代细胞emt转化，其中低氧环境本实施例中优选为将培养皿置入低氧培养箱中培养24小时(低氧工作站包括1％o2,5％co2,94％n2)，该低氧环境还可以为(1±0.3)％o2,(5±0.5)％co2,(94±1)％n2，使原代培养的上皮细胞(鹅卵石样)转换为间质细胞(多边形，长梭形)诱导上皮间质转换(emt)，诱导前后如图1所示。
3、从emt后的原代细胞中培养扩增干细胞：
将培养皿重新置入普通培养培养箱中培养，每3-5天更换一次培养液，使培养皿中长出克隆样细胞团(原代心包膜干细胞克隆)，待克隆长到120μm左右时，收集原代培养中的细胞克隆，转入1.5mlep管中，加至1ml0.05％胰酶，小心吹打，使克隆消化成单个细胞。离心5min，3000rmp，弃去上清，加入完全培养基终止消化。按合适的细胞数目(1.3×104/cm2)接种到多聚赖氨酸包被的培养皿中，培养24小时后可以出现新的干细胞克隆(传代的干细胞克隆)，定期(3-5天)更换培养液，待干细胞克隆长到120μm左右时，收集干细胞克隆(如图2所示)，冷冻保存。
注：检测细胞的干细胞表型：收集培养第三代的心包膜干细胞克隆，免疫荧光检测结果显示，三种心脏干细胞表型(c-kit,sca-1,kdr-1)在心包膜干细胞克隆中也表达，如图3所示。
实施例2
本实施例的心脏干细胞由以下方法制备得到：
1、从活体壁层心包膜组织获取原代细胞(消化法)：
在ep管中将心包膜剪碎，并移到15ml离心管中，离心；
吸去上清液，向离心管中加入0.1％iv胶原酶和0.25％胰蛋白酶5ml，轻轻吹打后37℃培养箱中消化30min；
吸去上层大部分酶，再加入5ml含血清的培养液以终止消化；
用滤网收集消化下来的细胞；按适当比例接种(1.3×104/cm2)到培养瓶中，加入cem培养液，按时(3-5天)更换培养液；
2、诱导原代心包膜细胞上皮-间质转化(emt)：采用tgf-β诱导心包膜原代细胞emt转化，收集消化下来的细胞，按适当比例接种到培养瓶中，加入含tgf-β1(10nmol/l)的培养基，培养24小时。使原代培养的上皮细胞(鹅卵石样)转换为间质细胞(多边形，长梭形)，诱导上皮间质转换，(emt)，诱导前后细胞形态如图4所示。
3、从emt后的原代细胞中培养扩增干细胞：步骤同实施例1，emt后的细胞继续培养后，在培养皿底部细胞的上层可以长出克隆状心包膜干细胞球，得到的心脏干细胞克隆的形态与实施例1相同。
实施例3
本实施例的心脏干细胞由以下方法制备得到：
1、从活体壁层心包膜组织获取原代细胞：同实施例1；
2、诱导原代心包膜细胞上皮-间质转化：同实施例2；
3、从emt后的原代细胞中培养扩增干细胞：步骤同实施例1，制备得到的心脏干细胞克隆的形态与实施例1相同。
实施例4
本实施例的心脏干细胞由以下方法制备得到：
1、从活体壁层心包膜组织获取原代细胞：同实施例2；
2、诱导原代心包膜细胞上皮-间质转化：同实施例1；
3、从emt后的原代细胞中培养扩增干细胞：步骤同实施例1，制备得到的心脏干细胞克隆的形态与实施例1相同。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。