高血压基因多态性荧光PCR溶解曲线检测试剂盒及应用的制作方法

本发明涉及一种高血压基因多态性荧光pcr溶解曲线检测试剂盒，及其应用，以及一种检测高血压用药基因的多重pcr熔解曲线检测方法。(二)
背景技术：
：高血压作为一种慢性非传染性疾病，也是我国患病率较高、致残率较高及疾病负担较重的慢性疾病。2016年国家卫生计生委发布的数据显示：我国18岁及以上成人高血压患病率为25.2％。尽管近些年我国人群的高血压知晓率、治疗率、控制率已有改善，但仍处于较低水平。全球疾病负担研究显示：中国人群因高血压造成的伤残调整寿命年(daly)高达3794万人年，占总daly的12.0％，占心血管病总daly的63.5％；其中伤残损失寿命年(yld)为3557万人年，早逝损失寿命年(yll)为236.5万人年，占心血管病yld和yll的50.1％和64.5％，是心血管病负担的首位危险因素。全国每年因血压升高所致的过早死亡人数高达200余万，每年直接医疗费用达366亿，我国治疗后的高血压患者的血压达标率为29.6％。高血压作为心脑血管病最重要的危险因素，流行态势严重，其主要并发症如卒中、心肌梗死、心力衰竭及慢性肾脏病等的致残致死率高，严重消耗医疗和社会资源，给家庭和社会造成沉重负担，已成为我国一项重要的公共卫生问题。尽管近年来高血压的诊断和治疗取得了长足进展，高血压治疗药物也层出不穷，但高血压药物治疗亦存在诸多不合理之处，由此也影响了患者治疗的依从性、持续性及血压控制率。药物反应的个体差异是临床上目前血压控制率低下的主要因素，产生这种差异的原因有很多，比如升高、基因、性别、体重、疾病状况在内的多种因素可导致不同个体对于药物的反应的差别，然而遗传因素是其中最根本的因素，药物的代谢、转运、受体的基因多态性直接决定了其编码的蛋白功能差异，从而是药物代谢吸收产生差异，导致人血药浓度的显著不同。目前临床上常用的5大类药物及对应的主要基因多态性及功能影响如下所示(表1)：表1：高血压药物相关基因型的临床意义以上所述的基因突变均有较大可能与高血压药物在不同个体中的反应相关，相同剂量的药物在不同个体中产生明显差异，有的个体有效，有的个体根本无效，甚至有的人产生药物反应。因此，利用有效地基因多态性检测技术对于高血压患者进行基因检测，根据检测结果可以调整患者的用药种类或剂量，可以使药物发挥最佳作用，同时可以防止药物的毒副作用。这为精准医疗中个体化医疗提供最佳的科学实践论据，为迎接更广泛的个体化医疗时代的来临继续努力。目前针对基因多态性检测的技术有很多，最常用的有聚合酶链式反应-限制性片段长度多态性分析(pcr-rflp法)、序列特异性pcr、一代测序、二代测序等技术，但是这些技术有各自的应用缺陷，有的操作繁琐，检测周期长，无法进行高通量多位点同时检测，使得目前在临床上对于多态性检测技术应用仍不理想，一直无法满足临床检测需求。多重荧光pcr结合高分辨探针法熔解曲线法是一种新型的snp分析技术，是从hrm(高分辨溶解曲线)技术的基础上进行了改良，将hrm中的饱和染料用探针来替代，而探针设计的位置就在snp位点上，使检测结果更直接，更加特异，并且最大的优势是可以进行分型检测，一条探针区分一个snp位点的所有多态性情况，结合多色荧光检测，使检测通量大大提升，而传统荧光pcr法一个荧光通道只能检测一种基因型，如果采用探针法熔解曲线法一个荧光通道可以检测3种基因型甚至可以更多，使通量放大3倍，更需要说明的是采用常规荧光pcr方法面临亚型间的干扰，从而判读多数采用ct值差的方法，使检测结果变得不稳定。(三)技术实现要素：为克服现有技术的不足，本发明的目的是提供高血压个体化用药指导基因检测的试剂盒及其应用，包括分别检测cyp2c9*3基因、cyp2d6基因、cyp3a5*3基因、adrb1基因、agtr1基因、ace基因和nppa基因多态性的试剂。一种高血压基因多态性荧光pcr溶解曲线检测试剂盒，主要包括三组引物对和pcr反应试剂，其特征在于，所述引物序列如下：引物探针组一为cyp3a5*3和nppa引物：cyp3a5*3引物探针序列如下：上游引物：5’-taatgaagtattttaaacatata-3’下游引物：5’-gttctagttcattagggtgtgacac-3’荧光探针：fam-tttgtctttcaatatctc-bq1；nppa引物探针序列如下：上游引物：5’-gatgggatgatcacaac-3’下游引物：5’–ccaggtcaccaagccagata-3’荧光探针：hex-tgttatcttcagtac-bq2；引物探针组二为agtr1、cyp2c9*3和ace(i/d)引物：agtr1引物探针序列如下：上游引物：5’-ttctaaaatatattcccc-3’下游引物：5’-gaaaagtcggttcagtccacataat-3’荧光探针：fam-ccaaatgagcattagct-bq1；cyp2c9*3引物探针序列如下：上游引物：5’–agagattgaacgtgtgattggca-3’下游引物：5’-tgatactatgaatttggggacttcg-3’荧光探针：hex-gagatacattgacc-bq2；ace(i/d)引物探针序列如下：上游引物：5’-tcccatcctttctcccatttctcta-3’下游引物：5’-cccttagctcacctctgcttgta-3’荧光探针：cy5-gctgcctatacagtcact-bq2；引物探针组三为adrb1和cyp2d6*10引物：adrb1引物探针序列如下：上游引物：5’-cccatcatctactgccgcagc-3’下游引物：5’-tctccgtgggtcgcgtg-3’荧光探针：fam-cttccagggactgctct-bq1；cyp2d6*10引物探针序列如下：上游引物：5’-cccatttggtagtgaggcaggt-3’下游引物：5’-gacctgatgcaccggcg-3’荧光探针：hex-gcacgctacccaccagg-bq2。具体检测时，以引物探针组一和pcr反应试剂配制pcr反应液1，以引物探针组二和pcr反应试剂配制pcr反应液2，以引物探针组三和pcr反应试剂配制pcr反应液3，通过3个反应液来分别检测7个基因多态性的结果。每个反应液包括至少2个荧光通道，检测等位基因类型，从而指导临床用药。上述引物具体检测的是cyp2c9*3基因的rs1057910位点、cyp2d6基因的rs1065852位点、cyp3a5*3基因的rs776746位点、adrb1基因的rs1801253位点、agtr1基因的rs5186位点、ace基因的rs4646994位点和nppa基因的rs5065位点的多态性。反应液1包括热启动聚合酶、pcr缓冲液、dntps、cyp3a5*3引物、cyp3a5*3探针、nppa引物、nppa探针。反应液2包括：热启动聚合酶、pcr缓冲液、dntps、agtr1引物、agtr1探针、cyp2c9*3引物、cyp2c9*3探针、ace(i/d)引物、ace(i/d)探针。反应液3包括：热启动聚合酶、pcr缓冲液、dntps、adrb1引物、adrb1探针、cyp2d6*10引物、cyp2d6*10探针。所述试剂盒通常还包括7个基因多态性质粒标准品作为阳性对照，所述标准品序列如下：cyp3a5*3标准品序列：cyp3a5*3突变型：5’-ctttttgataatgaagtattttaaacatataaaacattatggagagtggcataggagatacccacgtatgtaccacccagcttaacgaatgctctactgtcatttctaaccataatctctttaaagagctcttttgtctttcagtatctcttccctgtttggaccacattacccttcatcatatgaagccttgggtggctcctgtgtgagactcttgctgtgtgtcacaccctaatgaactagaacctaaggttgctgtgtgtcgtacaactaggggtat-3’；cyp3a5*3野生型：5’-ctttttgataatgaagtattttaaacatataaaacattatggagagtggcataggagatacccacgtatgtaccacccagcttaacgaatgctctactgtcatttctaaccataatctctttaaagagctcttttgtctttcaatatctcttccctgtttggaccacattacccttcatcatatgaagccttgggtggctcctgtgtgagactcttgctgtgtgtcacaccctaatgaactagaacctaaggttgctgtgtgtcgtacaactaggggtat-3’；nppa标准品序列：nppa突变型：5’-gcttagatgggatgatcacaactccatggcaacaagatgacacaaatgcagcagagaccccaggggacaggagcctcttgcagtctgtccctaggcccagccctgcttgtcctccctggctgttatcttcggtactgcaaagagaacacagacatatctggcttggtgacctggctgtcctggaaaagtcagcttcatgtatgagtgtgcccatcctctgaacttgattactgaccacctgcttcccaccggcccccaccccagcctgatgaccctctga-3’；nppa野生型：5’-gcttagatgggatgatcacaactccatggcaacaagatgacacaaatgcagcagagaccccaggggacaggagcctcttgcagtctgtccctaggcccagccctgcttgtcctccctggctgttatcttcagtactgcaaagagaacacagacatatctggcttggtgacctggctgtcctggaaaagtcagcttcatgtatgagtgtgcccatcctctgaacttgattactgaccacctgcttcccaccggcccccaccccagcctgatgaccctctga-3’；agtr1标准品序列：agtr1突变型：5’-ctccagcttctaaaatatattcccccaaaagccaaatcccactcaaacctttcaacaaaaatgagcacgctttcctaccgcccctcagataatgtaagctcatccaccaagaagcctgcaccatgttttgaggttgagtgacatgttcgaaacctgtccataaagtaattttgtgaaagaaggagcaagagaacattcctctgcagcacttcactaccaaatgagccttagctacttttcagaattgaaggagaaaatgcattatgtggactgaaccgacttttctaaagctctgaacaaaagcttttctttccttttgcaacaagacaaagcaaagccacattttgcattagacagatgacggctgctcgaagaacaatgtcagaaactcgatgaatgtgttgatttgagaaattttactgacagaaatgcaatctccctagcctgctt-3’；agtr1野生型：5’-ctccagcttctaaaatatattcccccaaaagccaaatcccactcaaacctttcaacaaaaatgagcacgctttcctaccgcccctcagataatgtaagctcatccaccaagaagcctgcaccatgttttgaggttgagtgacatgttcgaaacctgtccataaagtaattttgtgaaagaaggagcaagagaacattcctctgcagcacttcactaccaaatgagcattagctacttttcagaattgaaggagaaaatgcattatgtggactgaaccgacttttctaaagctctgaacaaaagcttttctttccttttgcaacaagacaaagcaaagccacattttgcattagacagatgacggctgctcgaagaacaatgtcagaaactcgatgaatgtgttgatttgagaaattttactgacagaaatgcaatctccctagcctgctt-3’；cyp2c9*3标准品序列：cyp2c9*3突变型：5’-tctccttttccatcagtttttacttgtgtcttatcagctaaagtccaggaagagattgaacgtgtgattggcagaaaccggagcccctgcatgcaagacaggagccacatgccctacacagatgctgtggtgcacgaggtccagagataccttgaccttctccccaccagcctgccccatgcagtgacctgtgacattaaattcagaaactatctcattcccaaggtaagtttgtttctcctacactgcaactccatgttttcgaagtccccaaattcatagtatcatttttaaacctct-3’；cyp2c9*3野生型：5’-agagattgaacgtgtgattggcagaaaccggagcccctgcatgcaagacaggagccacatgccctacacagatgctgtggtgcacgaggtccagagatacattgaccttctccccaccagcctgccccatgcagtgacctgtgacattaaattcagaaactatctcattcccaaggtaagtttgtttctcctacactgcaactccatgttttcgaagtccccaaattcatagtatcatttttaaacctct-3’ace(i/d)标准品序列：ace-d质粒：5’-agactcaagcacgcccctcacaggactgctgaggccctgcaggtgtctgcagcatgtggccccaggccggggactctgtaagccactgctggagagccactcccatcctttctcccatttctctagacctgctgcctatacagtcacttttatgtggtttcgccaattttattccagctctgaaattctctgagctccccttacaagcagaggtgagctaagggctggagctcaaggcattcaaacccctaccagatctgacgaatgtgatggccacgtcccggaaatatgaagacctgttatgggcatgggagggctggcgagacaaggcggggagagccatcctccagttttacccgaaatacgtggaactcatcaaccaggctgcccggctcaatg-3’；ace-i质粒：5’-agactcaagcacgcccctcacaggactgctgaggccctgcaggtgtctgcagcatgtggccccaggccggggactctgtaagccactgctggagagccactcccatcctttctcccatttctctagacctgctgcctatacagtcactttttttttttttttgagacggagtctcgctctgtcgcccaggctggagtgcagtggcgggatctcggctcactgcaagctccgcctcccgggttcacgccattctcctgcctcagcctcccaagtagctgggaccacaggcgcccgccactacgcccggctaattttttgtatttttagtagagacggggtttcaccgttttagccgggatggtctcgatctcctgacctcgtgatccgcccgcctcggcctcccaaagtgctgggattacaggcgtgatacagtcacttttatgtggtttcgccaattttattccagctctgaaattctctgagctccccttacaagcagaggtgagctaagggctggagctcaaggcattcaaacccctaccagatctgacgaatgtgatggccacgtcccggaaatatgaagacctgttatgggcatgggagggctggcgagacaaggcggggagagccatcctccagttttacccgaaatacgtggaactcatcaaccaggctgcccggctcaatg-3’；adrb1标准品序列：adrb1突变型：5’-atgggcgtcttcacgctctgctggctgcccttcttcctggccaacgtggtgaaggccttccaccgcgagctggtgcccgaccgcctcttcgtcttcttcaactggctgggctacgccaactcggccttcaaccccatcatctactgccgcagccccgacttccgcaaggccttccagcgactgctctgctgcgcgcgcagggctgcccgccggcgccacgcgacccacggagaccggccgcgcgcctcgggctgtctggcccggcccggacccccgccatcgcccggggccgcctcggacgacgacgacgacgatgtcgtcggggccacgccgcccgcgcgcctgctggagccctgggccggctgcaacggcggggcggcggc-3’；adrb1野生型：5’-atgggcgtcttcacgctctgctggctgcccttcttcctggccaacgtggtgaaggccttccaccgcgagctggtgcccgaccgcctcttcgtcttcttcaactggctgggctacgccaactcggccttcaaccccatcatctactgccgcagccccgacttccgcaaggccttccagggactgctctgctgcgcgcgcagggctgcccgccggcgccacgcgacccacggagaccggccgcgcgcctcgggctgtctggcccggcccggacccccgccatcgcccggggccgcctcggacgacgacgacgacgatgtcgtcggggccacgccgcccgcgcgcctgctggagccctgggccggctgcaacggcggggcggcggc-3’；cyp2d6*10标准品序列：cyp2d6*10突变型：5’-gtgctgagagtgtcctgcctggtcctctgtgcctggtggggtgggggtgccaggtgtgtccagaggagcccatttggtagtgaggcaggtatggggctagaagcactggtgcccctggccgtgatagtggccatcttcctgctcctggtggacctgatgcaccggcgccaacgctgggctgcacgctactcaccaggccccctgccactgcccgggctgggcaacctgctgcatgtggacttccagaacacaccatactgcttcgaccaggtgagggaggaggtcctggagggcggcagaggtgctgaggctcccctaccagaagcaaacatggatggtgggtgaaaccacaggctggaccagaagccaggctgagaagggga-3’；cyp2d6*10野生型：5’-gtgctgagagtgtcctgcctggtcctctgtgcctggtggggtgggggtgccaggtgtgtccagaggagcccatttggtagtgaggcaggtatggggctagaagcactggtgcccctggccgtgatagtggccatcttcctgctcctggtggacctgatgcaccggcgccaacgctgggctgcacgctacccaccaggccccctgccactgcccgggctgggcaacctgctgcatgtggacttccagaacacaccatactgcttcgaccaggtgagggaggaggtcctggagggcggcagaggtgctgaggctcccctaccagaagcaaacatggatggtgggtgaaaccacaggctggaccagaagccaggctgagaagggga-3’。本发明还涉及所述的试剂盒在检测高血压用药基因中的应用。本发明还涉及一种利用上述试剂盒检测高血压用药基因的多重pcr熔解曲线检测方法，所述方法如下：(1)采集临床血样，通过样本稀释液稀释后直接使用，稀释倍数在5-40倍之间；(2)以引物探针组一和pcr反应试剂配制pcr反应液1，以引物探针组二和pcr反应试剂配制pcr反应液2，以引物探针组三和pcr反应试剂配制pcr反应液3，稀释后的血样为模板直接分别加入到pcr反应液1、pcr反应液2、pcr反应液3中，扩增总体积为20微升，其中样本体积为2微升；(3)设置pcr扩增程序及熔解程序；(4)结果判读，通过不同tm值熔解峰对应不同多态性位点直接进行判读。所述样本稀释液为下列之一：(1)氢氧化钠溶液，浓度0.01m～0.1m；(2)dmso、氢氧化钠溶液，其中dmso溶液浓度为1％～10％，氢氧化钠溶液浓度0.01m～0.1m；(3)甜菜碱、氢氧化钠溶液，其中甜菜碱浓度为1m～5m，氢氧化钠溶液浓度0.01m～0.1m；(4)甘露醇、氢氧化钠溶液，其中甘露醇浓度为1％～5％，氢氧化钠溶液浓度0.01m～0.1m。所述pcr反应液组成如下：pcr反应液1：tris(ph8.5)20mmol/l、kcl50mmol/l、mgcl22mmol/l、dntps2mmol/l、聚合酶1u、cyp3a5*3上游引物250nmol/l、cyp3a5*3下游引物50nmol/l、cyp3a5*3荧光探针100nmol/l、nppa上游引物250nmol/l、nppa下游引物50nmol/l、nppa荧光探针100nmol/l；pcr反应液2：tris(ph8.5)20mmol/l、kcl50mmol/l、mgcl22mmol/l、dntps2mmol/l、聚合酶1u、cyp2c9上游引物100nmol/l、cyp2c9下游引物500nmol/l、cyp2c9荧光探针500nmol/l、agtr1上游引物100nmol/l、agtr1下游引物500nmol/l、agtr1荧光探针500nmol/l、ace上游引物100nmol/l、ace下游引物500nmol/l、ace荧光探针500nmol/l；pcr反应液3：tris(ph8.5)20mmol/l、kcl50mmol/l、mgcl22mmol/l、dntps2mmol/l、聚合酶1u、dmso2％、adrb1上游引物100nmol/l、adrb1下游引物500nmol/l、adrb1荧光探针500nmol/l、cyp2d6上游引物100nmol/l、cyp2d6下游引物500nmol/l、cyp2d6荧光探针500nmol/l。本发明通过不同碱基的差异产生的tm值差异，很轻松的可区分不同突变类型。从本发明可以看出，总共7种基因涉及到21个亚型，本发明通过3个反应管轻松完成检测过程，同时检测过程无需核酸提取过程，简化操作步骤，判读方法简单。本发明的有益效果主要体现在：1)操作简单快捷，无需核酸纯化过程，节省时间。2)灵敏度高，可检测低至0.5ng的核酸。3)一次检测通量大：不仅涵盖7个等位基因的21种亚型，且所需反应液管数少。4)判读直观：可根据tm值的差异来区分不同亚型，仪器自动判读。(四)附图说明图1为1#样本结果图；图2为2#样本结果图；图3为3#样本结果图；图4为4#样本结果图；图5为6#样本结果图.(五)具体实施方式下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此：实施例1：1.反应液配制1)反应液1配制取2毫升冻存管，分别加入0.2mol/l的tris(ph8.5)200μl、0.5mol/l的kcl200μl、20mmol/l的mgcl2200μl、100mmol/l的dntps40μl、聚合酶100u、100μm的cyp3a5*3上游引物5μl、100μm的cyp3a5*3下游引物1μl、100μm的cyp3a5*3荧光探针2μl、100μm的nppa上游引物5μl、100μm的nppa下游引物1μl、100μmnppa荧光探针2μl。用纯化水补足体积至1.8ml，充分混匀后冷冻储存备用。2)反应液2配制取2毫升冻存管，分别加入0.2mol/l的tris(ph8.5)200μl、0.5mol/l的kcl200μl、20mmol/l的mgcl2200μl、100mmol/l的dntps40μl、聚合酶100u、100μm的cyp2c9上游引物2μl、100μm的cyp2c9下游引物10μl、100μm的cyp2c9荧光探针10μl、100μm的agtr1上游引物2μl、、100μm的agtr1下游引物10μl、100μmagtr1荧光探针10μl、100μm的ace上游引物2μl、100μm的ace下游引物10μl、100μm的ace荧光探针1μl。用纯化水补足体积至1.8ml，充分混匀后冷冻储存备用。3)反应液3配制取2毫升冻存管，分别加入0.2mol/l的tris(ph8.5)200μl、0.5mol/l的kcl200μl、20mmol/l的mgcl2200μl、100mmol/l的dntps40μl、聚合酶100u、100μm的adrb1上游引物2.5μl、100μm的adrb1下游引物15μl、100μm的adrb1荧光探针10μl、100μm的cyp2d6上游引物2μl、100μm的cyp2d6下游引物10μl、100μmcyp2d6荧光探针10μl。用纯化水补足体积至1.8ml，充分混匀后冷冻储存备用。4)样本稀释液配制配制氢氧化钠溶液，浓度为0.04m，分装在2毫升冻存管中，室温保存备用。5)阴性对照品配制使用纯化水，按照0.5ml分装在2毫升冻存管中，室温保存备用。6)阳性对照品配制取2毫升冻存管，分别加入10的6次方浓度的cyp2d6*10、cyp2c9*3、adrb1(1165g>c)、agtr1(1166a>c)、cyp3a5*3、nppa(t2238c)、ace(i/d)质粒，每个基因包含野生型和突变型。充分混匀后冷冻储存备用。2.样本前处理取10μl全血样本(室温融解并充分混匀)，添加290μl样本稀释液，充分混匀后备用，也可采用提取产物。3.加样单个反应总体积为20μl，因此往上述分装有18μl反应液的pcr薄壁管中按顺序分别加入2μl阳性对照、2μl阴性对照、2μl样品样本，盖紧8联管管盖，然后将8联管轻轻混匀后微离心，最后转移至pcr检测区。加样可参照96孔板建议布局(表2)。表2：pcr仪96孔板建议布局4.pcr扩增及荧光检测循环条件设置如下表3：反应程序仪器通道选择：反应液1和反应液3为fam和hex，反应液2为fam/hex/cy5。5.结果分析1)阴性对照应无明显熔解峰，若分析后出现熔解峰，可能为试剂受到污染或操作过程中的污染，请排除污染源后重新检测。2)阳性对照在熔解曲线分析后应每管每个通道都有2个熔解峰，若阳性对照管无熔解峰或只出现1个熔解峰，请确认所使用的试剂是否仍在有效期内，确定操作是否严格按照说明书进行。3)样本判读方法按照下表标准进行判读表4：靶基因及阳性对照熔解tm值范围根据检测结果，不同通道对应的不同熔解峰，代表不同的亚型。实施例2：1.试剂敏感度测试1)实验样本，各个基因亚型临床样本，提取产物稀释至试剂盒最低检测限0.5ng，重复测试3次，通过最后熔解分析判断阴性或阳性结果。2)实验上样在反应液1、反应液2、反应液3中分别加入敏感度样本2μl，每个样本重复测试3次后分析结果。3)检测结果三个反应液检测敏感性样本结果均为阳性，且重复结果均一致。表5：敏感度样本检测结果2.特异性样本测试1)实验样本，采用特异性样本对试剂的特异性进行验证，其中2份为大肠杆菌、2份为卡介苗、2份为大豆基因组。2)实验上样在反应液1、反应液2、反应液3中分别加入特异性样本2μl，同时设置阴性和阳性对照品，每个样本重复测试1次后分析结果。3)检测结果三个反应液检测特异性样本结果均为阴性，说明试剂盒特异性性能良好。表6：特异性样本检测结果敏感度样本反应液1反应液2反应液3大肠杆菌1阴性阴性阴性大肠杆菌2阴性阴性阴性卡介苗1阴性阴性阴性卡介苗2阴性阴性阴性大豆基因1阴性阴性阴性大豆基因2阴性阴性阴性实施例3：检测临床样本20例1)实验样本，临床样本来源于内蒙古赤峰市医院，通过试剂盒中样本稀释液，按照实施例1中方法将20例样本进行前处理。2)实验上样在反应液1、反应液2、反应液3中分别加入稀释后的临床样本2μl，每个样本重复测试1次后分析结果。3)检测结果三个反应液检测敏感性样本结果均为阳性，检测结果如下表：表7：临床样本检测结果以上实施例的说明只是用于帮助理解本发明方法及其核心思想。应当指出，对于本
技术领域：
的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以对本发明进行若干改进和修饰，这些改进和修饰也落入本发明权利要求保护范围内。当前第1页12