一种高纯度rhNGF的制备方法与流程

本发明涉及一种高纯度rhngf的制备方法，特别涉及一种从cho细胞培养物中得到高纯度rhngf的方法。

背景技术：
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基因工程表达并在宿主细胞中产生的rhngf中通常含有多种杂质，包括宿主细胞的蛋白质、核酸，还有表达产物rhngf的变异体，诸如前体、n端截短及异常等；另外，还会存在内毒素、病毒污染物和细胞培养基成分等各种有机和无机成分的杂质。其中，n端截短及异常变异体与前体是影响重组人神经生长因子质量最关键的杂质，必须加以清除。

以上这些杂质的理化性质各不相同，最有效的清除方法也各不相同。

目前，对rhngf进行纯化的报道有：

专利cn102702341a采用阳离子交换及分子筛(superdex75)两步方法制备了纯度大于98％的rhngf，虽然猜测分子筛(superdex75)用以清除前体变异体，但该专利并未提及，且分子筛要求样品高度浓缩，上样量只能在柱体积1％-4％之间，树脂本身也较贵，规模化工业生产中不太适用。

专利cn1268639c采用高效阳离子交换以线性梯度洗脱方式分离rhngf氧化、异构、脱酰胺等变异体，采用疏水作用层析(优选苯基)用以去除前体，但该方法均采用了线性梯度的洗脱方式。

专利cn106478801a采用阳离子交换及疏水层析(优选苯基)两步方法制备的纯度大于99％的rhngf，该方法疏水作用层析同样采用了线性梯度的洗脱方式。线性梯度洗脱方式通常需要双泵层析系统，对设备要求较高，不利于大规模工业生产。

以上这些方法均未涉及清除n端截短及异常变异体，及采用阶段动态清洗方式清除前体变异体，且层析步骤采用线性梯度的洗脱方式，不利于大规模工业放大。

现有技术的每种层析方法虽然都能够除去rhngf中一部分相关杂质，但使用单一方法都不能满意地去除所有主要杂质。比如，阳离子交换层析主要用于清除n端截短及异常变异体，疏水作用层析主要用于清除前体变异体。

因此，有必要研究不同方法的联合使用，才能得到高纯度的rhngf。

技术实现要素：

本发明的目的是结合不同手段，提供一种从cho细胞培养物中得到高纯度rhngf的方法。

本发明采用依次进行阳离子交换层析和疏水作用层析两种层析方法，可以得到高纯度rhngf。其中，阳离子交换层析主要用于清除n端截短及异常变异体，疏水作用层析主要用于清除前体变异体。

关于疏水作用层析

本发明分析了rhngf及其前体的理化性质。由于ngf前体中含有糖基化修饰，而成熟rhngf不含糖基化修饰。前体由于存在糖链，比成熟rhngf疏水性更弱。本发明利用该性质，使用疏水作用层析分离前体与成熟rhngf，并使用疏水作用层析进行阶段清洗以清除前体变异体。而且本发明采用动态清洗的方式，提高了纯化rhngf的效率。

关于阳离子交换层析

阳离子交换层析的目的是清除重组人神经生长因子中n端截短及异常变异体。

n端截短及异常变异体是影响重组人神经生长因子质量最关键的杂质，必须加以清除。

本发明分析了rhngf及其变异体的理化性质，发现在弱阳离子交换高效液相色谱(wcx-hplc)分析中，n端截短及异常变异体出峰在主峰前，显示了其具有较低的等电点。因此，在本发明在用阳离子交换层析的纯化工艺中，采用阶段升高电导率的方法清除n端截短及异常变异体，效果良好。

操作方法如下：

一种高纯度rhngf的制备方法，包括对cho细胞培养物依次进行疏水作用层析和阳离子交换层析；

其特征是，在两种方法层析前，分别具有清洗步骤：

疏水作用层析前，清除前体；

阳离子交换层析前，清除n端截短及异常变异体。

具体地，按以下3个步骤进行：

1前处理：将cho细胞培养物经过柱层析纯化，进行一次或多次；

所述cho细胞培养物是中国仓鼠卵巢(cho)细胞重组宿主细胞培养物表达的重组生产的人神经生长因子，含有大量杂质；

所述柱层析的方式不限，按本领域技术人员熟知的所有柱层析方法均可进行，目的是除去一般性的杂质。

虽然经过常规方法前处理，所得物质中仍含有常规手段难以去除的重组人神经生长因子变异体(如n端截短、前体及异常变异体等)等多种污染物。

2在疏水层析柱中清洗和洗脱

2.1清除前体：用“疏水层析清洗液”清洗步骤1的产物，弃去流出的液体；这个步骤可以除去前体类变异体；

2.2层析：从流出的洗脱液中得到疏水层析产物；

3在阳离子层析柱中清洗和洗脱

3.1清除n端截短及异常变异体：用“阳离子层析清洗液”清洗步骤2的产物，弃去流出的液体；

3.2层析：从流出的洗脱液中得到rhngf纯品；

步骤2.1中，所述疏水层析清洗液是醇和nacl的水溶液，且同时满足以下条件：

①醇的含量低于步骤2.2所用的洗脱液中醇的含量；所述醇，优选乙醇；在本发明的实例中，所用的清洗缓冲液是4％-6％乙醇(体积比)；

②nacl的含量是200～400mm；

③ph与步骤1所得物质范围相同；

步骤3.1中，所述阳离子层析清洗液是含nacl的缓冲液，其电导率高于阳离子层析样品原料的电导率。

步骤2中：

电导率：清洗液高于层析洗脱液；

醇在溶液中的浓度：清洗液低于层析洗脱液。

步骤2.1采用“动态清洗”方式，即根据步骤1柱层析洗脱产物峰面积线性关系式得出清洗体积，按下式计算：

清洗体积(cv)＝8.5-峰面积/ml树脂/1000。

步骤2.2中，洗脱液是醇的水溶液，或醇和nacl的水溶液，含7％-20％醇，0-100mmnacl。

步骤3.2所用的洗脱液的电导率高于步骤3.1所述清洗液的电导率

步骤3.2中所用的洗脱液，是含nacl的缓冲液。所述nacl的含量是350～600mm，电导率为35-60ms/cm。

步骤2和步骤3的顺序可以调换，即纯化方法的操作顺序可以是：1—2—3，也可以是1—3—2。

本发明对层析材料进行了研究：

疏水作用层析材料：经实验发现，固相颗粒粒径较大的疏水作用层析材料，例如来自ge的octylff、captobutyl、captophenylhs、butylff及phenylff等，对前体的清除效果不明显。本发明所用的疏水作用层析介质配基为苯基或丁基，优选使用butylsepharosehighperformance。

阳离子交换材料:包含高交联琼脂糖固相，例如来自ge的sphp或苯乙烯-二乙烯基苯固相，例如来自appliedbiosystems的poros50hs柱，对于固相颗粒粒径较大的其它阳离子交换材料，例如来自ge的captos，对变异体的清除效果不明显。经实验发现，层析介质阳离子交换配基为丙磺基较好。

在本发明的一个实例中，疏水作用层析纯化方案包括以下按序步骤：(1)平衡疏水作用层析材料；(2)将粗品加载到疏水作用层析材料；(3)使用平衡缓冲液进行顶洗；(4)使用清洗缓冲液进行中间清洗；(5)使用洗脱缓冲液洗脱期望的重组人神经生长因子。

本发明采用疏水作用层析，可用各种流动相条件进行清洗重组人神经生长因子前体(主要为前体)，该流动相条件包括降低盐浓度，也包括增加极性溶剂的浓度，ph同样对重组人神经生长因子与树脂的结合有影响，优选中性ph。本发明的实施方案中，缓冲液所用缓冲盐包括乙酸钠、磷酸盐、mes、mopso，优选地，选用磷酸盐作为缓冲盐。缓冲液所用洗脱盐包括但不限于氯化钠、乙酸钠、氯化钾及硫酸铵，优选地，选用氯化钠作为洗脱盐。缓冲液中所用有机溶剂包括但不限于乙醇、丙二醇、乙二醇及己二醇，优选地，选用乙醇作为所用有机溶剂。

通常，在将包含重组人神经生长因子和一种或多种分子变异体的粗品加载到疏水作用层析材料上之前，使平衡缓冲液流过所述材料。在本发明的优选实施方案中，平衡缓冲液具有约5.5至约7.0的ph，例如约ph6.0，过低的ph(小于5.0)会导致疏水作用增强。平衡缓冲液盐浓度控制在约0.8m至1.2mnacl范围内，例如约1.1mnacl。一种示例性的平衡缓冲液包含20mmmes，1.1mnacl，ph6.0或20mmpb，1mnacl，ph7.0。

平衡后，将包含重组人神经生长因子和一种或多种分子变异体的粗品加载到疏水作用层析材料上，所述粗品的ph在ph5.5至ph7.0范围中，例如ph6.0或ph7.0，盐浓度控制在约0.8m至1.2mnacl范围内，例如约1.1mnacl。在一个实施方案中，将来自疏水层析洗脱的粗品加载到疏水作用层析，加载密度约5-10g/l树脂，重组人神经生长因子与前体结合至疏水作用层析填料。

加载后，使用平衡缓冲液进行顶洗，顶洗条件与平衡步骤相同，一般进行顶洗2-3个柱体积。

顶洗结束后，使用清洗缓冲液清洗疏水作用层析材料。在清洗过程中清洗缓冲液流过疏水作用层析材料。清洗缓冲液组成一般选择成自树脂洗脱尽可能多的杂质的分子变异体(前体)，而不洗脱期望的得到的重组人神经生长因子。清洗缓冲液ph控制在5.5-7.0范围内，例如约ph6.0或ph7.0，盐浓度控制在约0.2至约0.4mnacl范围内，例如约0.25m，有机溶剂控制在约4％至约6％乙醇，例如约5％。清洗体积采用动态控制的方式，根据疏水作用层析上一步层析的洗脱峰面积决定，一般为5-7cv。优选的清洗缓冲液包括20mmpb，0.4mnacl，6％乙醇，ph6.0或20mmpb，0.25mnacl，5％乙醇，ph7。

在所述清洗步骤后，自疏水作用层析材料洗脱期望的重组人神经生长因子。重组人神经生长因子的洗脱可以通过降低盐浓度或提高有机溶剂浓度来实现。在一个实施方案中，所述洗脱缓冲液包含约0至约100mmnacl，约7％至约20％的乙醇。洗脱缓冲液一般与清洗缓冲液具有大致相同的ph。一种优选的洗脱缓冲液包含20mmpb，0.1mnacl，7％乙醇，ph7.0。另一种优选的洗脱缓冲液包含20mmpb，20％乙醇，ph6.0。

虽然涵盖别的其它步骤，但优选的是，本文中的疏水作用层析纯化方法只由下列步骤组成：平衡，加载包含重组人神经生长因子及分子变异体的粗品，用于洗脱分子变异体的清洗步骤，和洗脱重组人神经生长因子的洗脱步骤。

如果必要，依照本文中的疏水作用层析方法获得的重组人神经生长因子制备物可以进行别的纯化。上文已经讨论了示例性的进一步纯化步骤。

以上所述”电导”,通过加盐方式调节电导，所述盐包括但不限于氯化钠、氯化钾、硫酸钠、乙酸钠，优选地选用氯化钠。

清洗缓冲液和洗脱缓冲液所用的缓冲盐包括乙酸钠、磷酸盐、mes、mopso，优选地，选用mes作为缓冲盐。

本文中提到的术语解释如下：

所述“清洗”，指清洗缓冲液流过阳离子交换材料，流出的液体(可带走部分杂质)弃去。

所述“洗脱”，指洗脱缓冲液流过阳离子交换材料，收集流出的液体(含纯化目标产品。

“污染物”指与期望的重组人神经生长因子不同的过程相关杂质。污染物包括但不限于：宿主细胞物质，诸如中国仓鼠卵巢细胞蛋白质，核酸；内毒素；病毒污染物；细胞培养基成分。

“阳离子交换材料”指带有负电荷且有游离阳离子供与流过该固相的水溶液中阳离子交换的固相。商品化的阳离子交换材料包括在琼脂糖上固定化丙磺基(sp)、磺酰基(s)或经磺丙基官能化多羟基化聚合物包被的交联聚苯乙烯-二乙烯基苯固相颗粒等。

“载荷”指加载到阳离子交换材料上的组合物。

“平衡缓冲液”指用在将所述组合物加载到阳离子交换材料上之前平衡阳离子交换材料的缓冲液。

“再生缓冲液”可用于再生阳离子交换填料，使它能够再次使用。再生缓冲液具有自阳离子交换填料清除基本上所有污染物及重组人神经生长因子的电导率和ph。

“电导率”指水溶液在两个电极之间传导电流的能力。溶液电导率可以通过改变溶液的离子浓度来改变。

“顶洗”指在所述组合物加载后，使用平衡缓冲液将所述组合物从阳离子交换柱洗出的过程。

在本发明的一个实例中，阳离子交换纯化方案通常包括以下按序步骤：(1)平衡阳离子交换材料；(2)将组合物加载到阳离子交换材料；(3)使用平衡缓冲液进行顶洗；(4)使用清洗缓冲液进行中间清洗；(5)使用洗脱缓冲液洗脱，得到期望的重组人神经生长因子纯化产物。

通常，在将包含重组人神经生长因子和一种或多种分子变异体的粗品加载到阳离子交换材料上之前，使平衡缓冲液流过所述材料。在本发明的优选实施方案中，平衡缓冲液具有约5.5至6.5的ph，例如约ph6.2。一种示例性的平衡缓冲液包含20mmmes，110mmnacl，ph6.2。

平衡后，将包含重组人神经生长因子和一种或多种分子变异体的组合物加载到阳离子交换材料上，所述组合物的ph在ph5.5至ph6.5范围中，例如ph5.8或ph6.2，电导在10-14ms/cm范围中，例如13ms/cm。在一个实施方案中，将来自疏水层析洗脱的组合物加载到阳离子交换层析，加载密度约1-5g/l树脂，重组人神经生长因子与变异体结合至阳离子交换填料，大部分宿主细胞蛋白(hcp)流穿。

加载后，使用平衡缓冲液进行顶洗，顶洗条件与平衡步骤相同，一般进行顶洗2-3个柱体积。

顶洗结束后，使用清洗缓冲液清洗阳离子交换材料。在清洗过程中清洗缓冲液流过阳离子交换材料。清洗缓冲液组成一般选择成自树脂洗脱尽可能多的分子变异体(n端截短及异常)，而不洗脱期望的得到的重组人神经生长因子。清洗缓冲液ph控制在5.5-6.5范围内，例如约ph5.8或ph6.2，电导率控制在20-30ms/cm范围内，例如约29ms/cm。在此ph范围中缓冲的缓冲盐例子包括但不限于mes、mopos、乙酸钠、磷酸盐等。优选的清洗缓冲液包括20mmmes，290mmnacl，ph5.8或20mmpb，220mmnacl，ph6.2。

在所述清洗步骤后，自阳离子交换材料洗脱期望的重组人神经生长因子。重组人神经生长因子的洗脱可以通过提高电导率或离子强度来实现。洗脱缓冲液电导率需大于约35ms/cm，升高的电导率可以通过在洗脱缓冲液中包含相对较高的盐浓度来实现。用于此目的的盐的例子包括但不限于氯化钠、氯化钾、乙酸钠。在一个实施方案中，所述洗脱缓冲液包含约350至约600mmnacl。洗脱缓冲液一般与清洗缓冲液具有大致相同的ph。一种优选的洗脱缓冲液包含20mmmes，0.4mnacl，ph6.2。另一种优选的洗脱缓冲液包含20mmpb，0.5mnacl，ph6.2。

虽然涵盖别的其它步骤，但优选的是，本文中的阳离子交换纯化方法只由下列步骤组成：平衡，加载包含重组人神经生长因子及分子变异体的组合物，用于洗脱分子变异体的清洗步骤，和洗脱重组人神经生长因子的洗脱步骤。

如果必要，依照本文中的阳离子交换层析方法获得的重组人神经生长因子制备物可以进行别的纯化。上文已经讨论了示例性的进一步纯化步骤。

本发明阳离子交换层析方法的优点：

采用阶段清洗+洗脱的方式，区别于现有技术的线性梯度洗脱；

通过阶段电导增加的方式(即，在清洗阶段，清洗缓冲液的电导率高于待纯化的粗品；在洗脱阶段，洗脱缓冲液的电导率高于清洗缓冲液)清除分子变异体。

经实验证实，用本发明方法对n端截短(6-117)及异常分子变异体的清除效果好(见实施例)。

本发明人通过研究发现，虽然阳离子交换层析主要用于清除n端截短及异常变异体，疏水作用层析主要用于清除前体变异体。但阳离子交换层析同样能够清除少部分前体变异体，清除率为30％±10％，虽然具有清除效果，但相较疏水层析对前体清除贡献较小；而疏水作用层析同样能够清除n端截短及异常变异体，这是由于异常变异体通常具有较强的疏水性，因此控制疏水层析收集原则可清除部分n端截短及异常变异体，清除率为46％±4％，离子交换层析及疏水层析联合使用可清除约74％的n端截短及异常变异体，较单独使用有所提高。

实施例1的图1和表3是两种方法分别单用和联合使用情况下，rhngf变异体清除效果的对比。包括清除n端截短及异常、前体变异体。其中，a方法：阳离子交换层析；b方法：疏水作用层析；a+b：两种方法联合使用。从数据上可见两种方法联合使用可以达到单独方法不能达到的清除效果。

附图说明

图1n端截短及异常变异体清除效果。其中：

a方法：阳离子交换层析；

b方法：疏水作用层析。

该图可以看出，两种方法联用能够达到单独使用a或b不能达到的n端截短及变异体清除效果。

图2前体变异体清除效果。其中：a方法：阳离子交换层析；b方法：疏水作用层析；

该图说明前体变异体的清除主要取决于疏水作用层析，阳离子交换层析对清除帮助不大。

图3是疏水层析纯化重组人神经生长因子过程，包括平衡、加载、清洗及洗脱。

图4疏水层析前样品峰面积与清洗柱体积关系

揭示了疏水作用层析之前一步洗脱样品峰面积与疏水作用层析清洗体积之间的关系，峰面积越大，清洗体积越小。

图5装载上样前样品与洗脱样品sec-hplc分析

提供了疏水作用层析过程样品的sec-hplc分析结果，结果显示清洗过程清除了大部分前体变异体。

图6前体清除率及产品回收率数据总结

提供了多批次疏水作用层析数据统计结果，包括前体变异体清除率及产品回收率；

图7和图8：captos及sphp填料清除变异体能力对比；

两种离子交换层析材料清除变异体(n端截短及异常)能力的对比，相较于captos，sphp提供了卓越的变异体清除能力；

图9：阳离子交换材料纯化重组人神经生长因子过程图；

提供了阳离子交换层析的纯化过程，该过程一般分为平衡、加载、清洗及洗脱。

图10：阳离子交换纯化过程清洗样品及洗脱样品rp-hplc对比分析

提供了阳离子交换层析过程样品的rp-hplc分析结果，结果显示清洗过程清除了n端截短及异常变异体。

图11：变异体清除率及样品回收率数据总结

提供了多批次阳离子交换层析数据统计结果，包括变异体清除率及产品回收率。

具体实施方式

以下实施例仅用于举例说明本发明的方法和装置，并不限定本发明的范围。其中：

mes为2-(n-吗啉)乙磺酸；

mopos是3-(n-吗啉)-2-羟基丙磺酸；

sec-hplc是分子排阻高效液相色谱；

pb是磷酸盐缓冲液，

rp-hplc是反相高效液相色谱，

wcx-hplc为弱阳离子交换高效液相色谱，

tfa是三氟乙酸。

实施例1阳离子交换层析和疏水作用层析两种方法联用纯化rhngf

以下是操作方法的简述，阳离子交换层析和疏水作用层析两种方法的详细说明和操作见后附的对比实验。

1、方法

将经过至少一步柱纯化的rhngf粗品加载到离子交换填料。填料为sphp，柱高100mm，停留时间为6min。上样前预先使用上样缓冲液20mmmes，0.11mnacl，ph6.2平衡4cv，上样结束后平衡2cv，使用20mmmes，0.28mnacl，ph6.2缓冲液中间清洗，清洗8cv。使用20mmmes，0.4mnacl，ph6.2缓冲液进行洗脱，洗脱5cv。收集原则为起始点依照uv斜率大于30，结束点为第二个峰40mau处，该步可以清除n端截短、异常结构等变异体，并可清除大部分hcp。

离子交换层析洗脱产品添加0.7mnacl，进行下一步疏水作用层析。填料为butylhp，柱高100mm，停留时间6min。柱子预先使用上样缓冲液20mmmes，1.1mnacl，ph7平衡4cv，上样结束后平衡2cv，使用20mmpb，0.25mnacl，5％乙醇，ph7缓冲液进行中间清洗。中间清洗体积进行动态决策方式。使用20mmpb，0.1mnacl，7％乙醇，ph7缓冲液进行洗脱，收集原则为起始点依照电导斜率小于-2.9999，结束点为100-150mau。该步主要用来清除前体。

2、结果

见图1、图2，及表1数据。

表1两种方法单用和联用对rhngf分子变异体清除的比较

上表中，a：阳离子交换层析方法；b：疏水作用层析方法。

表中数值为清除的百分清除率。

3、结论

从图1、图2和表1数据都可清楚看出，阳离子交换层析和疏水作用层析两种方法联用，能够达到单独使用不能达到的n端截短及变异体清除效果，得到适于临床使用的高纯度产品。

对比实验1重组人神经生长因子的疏水作用层析

1.1总过程

以结合-洗脱模式操作层析柱，在环境温度中进行。所述层析柱使用疏水作用层析树脂(butylsepharosehighperformance)。该树脂由偶联丁基官能团的高交联琼脂糖基质组成。将疏水作用层析树脂装填入柱至9-11cm的床高度。在加载疏水层析洗脱产物前，使用平衡缓冲液将疏水作用层析柱中的贮存液清洗出，并且进行柱平衡。将离子交换层析洗脱产物加载到经过平衡的层析柱上，产物结合在树脂上。加载后，使用平衡缓冲液进行顶洗，将未结合载荷洗出。顶洗结束后，使用清洗缓冲液进行清洗，以清除分子变异体。然后使用洗脱缓冲液进行最多3cv的洗脱，收集洗脱产物。洗脱后，使用再生缓冲液(20％乙醇)及清洁液(0.5nnaoh)清洁柱子，之后在贮存液中贮存，直至下次使用(见图3)。

表2是本发明的重组人神经生长因子疏水作用层析的具体工艺条件。

表2重组人神经生长因子工艺

1.2动态控制中间清洗体积

根据装载上样量的不同，等度清洗过程的清洗体积是可变的，上样量与中间清洗体积存在着一定的关系。以疏水层析之前一步洗脱样品峰面积代替上样量，可以实时在线进行中间清洗体积决策。以清洗过程中第一个峰谷处(即图3圆圈处)清洗体积为基准，根据多批次疏水层析纯化数据统计清洗体积与疏水层析之前一步洗脱样品峰面积，两者之间的关系如图4所示。由图4可见，最高清洗体积可达8.5cv，随着上样量的增加，清洗体积随之减少。通常，正常清洗体积需大于第一峰谷。

1.3层析前后样品的分析对比

采用sec-hplc方法分析重组人神经生长因子回收率及前体变异体清除率。色谱柱为tskgelg2000swxlcolumn,7.8x300mm。流动相为0.15m磷酸氢二钠0.1m磷酸二氢钠溶液/乙腈＝85:15(体积比)。分析时上样体积20μl，流速0.5ml/min，柱温25度，检测波长280/214nm，分析时间40min。比例计算采用面积归一化方法。由于溶液体系温和，不会引起重组人神经生长因子两个亚基的解离，所以峰对应二聚体。sec-hplc可以较好的分辨成熟体和前体变异体。对纯化过程中的加载上样前及洗脱样品进行sec-hplc分析，结果如图5所示。由图可见，经过本发明所示工艺的纯化，产品中的前体变异体得到了清除。

1.4数据统计分析

根据sec-hplc对上样前粗品及洗脱产物的分析，统计前体的清除率及产品的回收率。前体变异体清除率＝(1-洗脱产物前体变异体比例/上样前粗品前体变异体比例)*100％；产品回收率＝(洗脱产物单位进样量主峰峰面积*洗脱体积)/(上样前粗品单位进样量主峰峰面积*装载上样体积)*100％。对多批次疏水作用层析工艺进行数据分析，如图6所示。该工艺条件对前体变异体的清除率为98.0％±0.9％，回收率为58％±7％。

对比实验2重组人神经生长因子的阳离子交换层析工艺

1.1此实施例描述用于纯化重组人神经生长因子的阳离子交换层析工艺。

此实例总结了对改良重组人神经生长因子阳离子交换步骤实施的发展研究。在这些研究中评估了两种阳离子交换填料：captos及spsepharosehighperformance。对两种离子交换填料进行清除分子变异体(n端截短及异常)研究，发现spsepharosehighperformance具有显著地清除分子变异体的工艺性能(见图7和图8)，用于改良的纯化重组人神经生长因子的阳离子交换树脂。

以结合-洗脱模式操作层析柱，在环境温度中进行。所述层析柱使用阳离子交换树脂(spsepharosehighperformance)。该树脂由偶联有带负电荷的官能团的高交联琼脂糖基质组成。将阳离子交换树脂装填入柱至9-11cm的床高度。在加载疏水层析洗脱产物前，使用平衡缓冲液将阳离子交换柱中的贮存液清洗出，并且进行柱平衡。将疏水层析洗脱产物加载到经过平衡的层析柱上，产物结合在树脂上。加载后，使用平衡缓冲液进行顶洗，将未结合载荷洗出。顶洗结束后，使用清洗缓冲液进行清洗，以清除分子变异体。然后使用更高电导率的洗脱缓冲液进行最多5cv的洗脱，收集洗脱产物。洗脱后，使用再生缓冲液(1mnacl)及清洁液(0.5nnaoh)清洁柱子，之后在贮存液中贮存，直至下次使用(见图9)。

下表提供了本文中发明的重组人神经生长因子工艺条件的描述。

表3重组人神经生长因子工艺

1.2纯化产物分析

采用rp-hplc方法分析重组人神经生长因子回收率及分子变异体清除率。具体方法为：使用thermoultimate3000二元hplc系统分析。色谱柱为agilentc3rrhd，规格为2.1*100mm。流动相a为含0.1％tfa的水溶液，流动相b为含0.1％tfa乙腈溶液，梯度以a相比例计为0min95％，2min95％，4min73％，16min63％，18min5％，20min5％，22min95％，24min95％。流速0.5ml/min，检测波长280/214nm。比例计算采用面积归一化方法。重组人神经生长因子分子由两个亚基(肽链)通过非共价键结合而成。在反相分析中，由于有机溶剂，两个亚基会解离，故峰对应的是亚基类型。对纯化过程中的清洗及洗脱样品进行rp-hplc分析。

结果如图10所示。由图中可见清洗样品与洗脱样品在n端截短及异常变异体上的差异，经过本发明方法的纯化，产品中的n端截短及异常变异体含量大幅降低。

1.3数据统计分析

根据rp-hplc对上样前组合物及洗脱产物的分析，统计变异体的清除率及产品的回收率，按下式计算：

变异体清除率＝(1-洗脱产物变异体比例/上样前组合物变异体比例)*100％；

产品回收率＝(洗脱产物单位进样量主峰峰面积*洗脱体积)/(上样前组合物单位进样量主峰峰面积*装载上样体积)*100％。对多批次阳离子交换层析工艺进行数据分析。

分析结果为：对变异体的清除率52％±9％，产品回收率76％±7％。如图11所示。