专利名称：一种快速制备高纯度的N<sup>6</sup>-(2-羟乙基)腺苷的方法
技术领域：
本发明属于生物农药领域，特别的，本发明涉及一种可以从菌丝中快速提取N6- (2-羟乙基)腺苷的方法。背景N6- (2-羟乙基)腺苷是一种腺苷衍生物，是虫草的特有成分，已成为虫草制品的质量控制指标之一(徐红娟，莫志宏，余佳文，朱华李，毛先兵.蝉花生物活性物质研究进展[J].药学专论，2009，18 (4):19-21)。具有很强的抗紫外辐射、抗血小板 凝结(Furuya T, Hirotani M.Matsuzawa Μ.N6-(2-hydroxyethyl)adenosine, abiologically active compound from cultured mycelia of Cordyceps and IsariaSpecies [J].Phytochemistry, 1993，22(11):2509-2512.180)和镇痛等效用(柴一秋，韦忠民，陈祝安，厉晓腊等.N6- (2-羟乙基)腺苷在制备镇痛药物中的应用[P].中国，ZL200410094511.0.2006-11_8.)，潜在医药保健开发潜力的微生物来源的资源(梁宗琦，2007.中国真菌志[M].北京:科学出版社，2007.)，但其在抑制肿瘤生长方面的作用报道很少。本发明利用热回流提取，膜分离，大孔树脂分离，结晶技术联用等方法，从蝉拟青霉人工培养物中分离纯化得到高纯度的N6- (2-羟乙基)腺苷。在中国发明专利2004100094511.0中揭示了提取N6-(2-羟乙基)腺苷的方法，但是该方法繁琐，利用设备昂贵，条件比较苛刻，不利于大规模化工程生产。在中国专利申请201010566708.5中也披露了一种从蛹虫草的菌丝体中提取N6-(2-羟乙基)腺苷的方法，虽然该方法步骤较少，但是必须要经过树脂和液相色谱仪分离纯化，所需要设备仍然昂贵，操作方法复杂，需要专业的人员才能进行，也不能实现大规模的常规生产。这就需要提供一种更简单的方法从生物体内提取N6-(2-羟乙基)腺苷活性物质。本发明采用热回流提取，膜分离，大孔树脂分离，结晶技 术联用，可以快速高效分离纯化N6-(2-羟乙基)腺苷，此法所得的N6-(2-羟乙基)腺苷颜色白、纯度高，可达到95%以上，且该方法生产投资和运行成本低，生产的安全性高和可操作性强，适于工业化生产。
发明内容
本研究采用热回流提取，膜分离-大孔树脂联用技术大量得到高纯度的N6-(2-羟乙基)腺苷单品，从而为该活性物质在医学或农业上的应用提供必要的前体。一方面，本发明提供一种从生物体内提取N6-(2-羟乙基)腺苷的方法，其特征在于，该方法包括:1)、将蝉拟青霉子实体、液体培养的菌丝体或带培养基的固体培养菌丝体50-70°C烘干，粉碎过40-100目筛；2)、对粉末进行热回流提取，条件如下:以10%_80%的乙醇作溶剂，40-100°C的温度下提取0.5-5小时获得乙醇提取溶液。在一些优选的方式中，热回流提取步骤中，溶剂与菌丝体的比例为5-10ml/g。优选的，溶剂与菌丝体的比例为10ml/g。在另一些优选的方式中，作为溶剂的乙醇的浓度为10%-80% ;优选的为20-70% ;更优选的为30%-70%。最优选的，浓度为50_70%。在另一些实施方式中，回流提取的温度为40-100 V，优选的，温度为50-100 V，较优选的，温度为60-100°C，更优选的，温度为70-90°C，最优选的，温度为80°C。在另一些优选的方式中，提取的时间为1-3小时，优选的为1-2小时，也可是30分钟或1.5小时。一般，回流提取的循环次数为1-5次，在合适的条件下，回流提取的次数为2-3次，也可是2次或更多次。除了乙醇可以作为本发明的提取溶剂外，我们发现甲醇、水等也有较好的得率。在另一些优选的方式中，对回流提取获得醇溶液进行膜分离纯化。通过膜的分离纯化可以除去提取溶液中的一些杂质，例如蛋白、一些多糖。优选的，先让醇提取液体通过截留分子量为10000的超滤膜，然后再通过截留分子量为3000的膜进行超滤，最后还可以通过用截留分子量为150的纳滤膜浓缩获得浓缩溶液。在另外一些优选的方式中，还可以让以上膜在压力下进行浓缩和纯化，例如在膜上施加0.2-3Mpa的压力进行分离纯化，还可以是l-2Mpa的压力。优选的，对截留分子量为10000和3000的超滤膜施加的压力都为IMpa ;对截留分子量为150纳滤膜的操作压力为2Mpa。在另外一些优选的方式中，经过膜过滤获得的溶液可以通过大孔树脂进行进一步的浓缩和纯化，大孔树脂可以是型号为AB-8、DlOU DM130、DM2、DA201、HN60、HB60或HPD100，优选的AB-8。经过膜浓缩的溶液上大孔树脂纯化，先以水、5%的乙醇溶液洗脱除去杂质，然后以30%的乙醇溶液洗脱，分段收集洗脱液，合并#-(2-羟乙基)腺苷高含量洗脱液。在优选的方式中， 对经过大孔树脂纯化获得洗脱液进行低温甲醇结晶。本发明的N6-(2-羟乙基)腺苷可以从生物体中提取，一般生物体包括菌丝体或子实体，这种菌丝体可以是蝉拟青霉固体培养的培养基中获得，也可以从蝉拟青霉液体培养的菌丝体中获得；子实体可以从蝉拟青霉固体培养所长出的子实体中获得。。这些菌丝体或子实体可以来源于人工通过培养基生产而来，也可以取自天然的虫草里的菌丝作为原料。在一些优选的方式中，菌丝体或子实体经过干燥然后粉碎获得粉末。有益效果采用热回流提取，膜分离-大孔树脂联用技术得到的#-(2_羟乙基)腺苷不仅颜色淡、纯度高，可达到95%以上；且该技术生产成本低，污染小，可以成为工业上生产N6-(2-羟乙基)腺苷产品的一种新技术。
图1是本发明一个具体实施例子中N6-(2-羟乙基)腺苷检测标准曲线图；图2是本发明一个具体实施例子中不同的膜孔径在120min内膜通量的变化图；图3是本发明一个具体实施例子中不同的膜孔径对N6-(2-羟乙基)腺苷转移率及除杂率的影响；图4为AB-8型本发明一个具体实施例子中大孔树脂对N6-(2-羟乙基)腺苷的动态吸附容量图。
具体实施例方式以下列举有限的实施例子来说明书本发明是如何实施的，这些说明并不是对本发明的权利要求的限制。实施例1热回流法从蝉拟青霉中提取Ns-(2_羟乙基)腺苷的工艺1.材料
带培养基的蝉拟青霉固体培养菌丝体，在60°C下烘干，粉碎过80目筛。#-(2-羟乙基)腺苷标准品(从中科院大连化学物理研究所药物购买)。所有的药品均为市售，除HPLC流动相使用的药品为色谱纯外，其他的药品均为分析纯。2.热回流提取方法参数的筛选本试验采用热回流法从带培养基的蝉拟青霉固体培养菌丝体中提取N6-(2-羟乙基)腺苷。具体方法为:取干燥粉碎后的菌丝体，用乙醇和水的混合溶液作溶剂，进行2次的热回流提取。我们采用多因素进行试验，我们发现，溶剂中乙醇的浓度(A，％)、料液比(B，ml/g)、提取时间(C，h)、提取温度(D，°C)是影响提取率的重要几个因素。因此，我们设计了一个四因素三水平的正交试验来确定最佳的提取工艺参数。该试验按照L9 (34)正交表进行试验设计，因素水平见表1，试验共作9个处理，每个处理4个重复(表I)。表I正交试验因素水平表
权利要求
1.一种提取N6-(2-羟乙基)腺苷的方法，其特征在于，该方法包括:I)、对菌丝体进行干燥，粉碎获得菌丝体粉末；2)、对粉末进行热回流提取，条件如下:以10%-80%的乙醇作溶剂，50-100摄氏度的温度下提取0.5-5小时获得乙醇提取溶液。
2.根据权利要求1所述的方法，其中，所述的步骤2中的热回流提取方法中，溶剂与菌丝体的比例为5-10ml/g。
3.根据权利要求1所述的方法，其中，作为溶剂的乙醇的浓度为30%-70%，提取的温度为50-100摄氏度，提取的时间为1-3小时。
4.根据权利要求1所述的方法，其中，该方法还包括对所述的醇提取溶液进行膜分析纯化，其中，先将醇提液先通过截留分子量为10000的超滤膜拦截，后用截留分子量为3000的膜进行超滤，最后用截留分子量为150的纳滤膜浓缩获得浓缩溶液。
5.根据权利要求4所述的方法，其中，对所述的经过膜浓缩的溶液上大孔树脂纯化，先以水、5%的乙醇溶液洗脱除去杂质，然后以30%的乙醇溶液洗脱，分段收集洗脱液，合并N6-(2-羟乙基)腺苷高含量洗脱液。
6.根据权利 要求4所述的方法，其中，对经过大孔树脂纯化获得洗脱液进行低温甲醇结晶。
7.根据权利要求4所述的方法，其中，对纯化的膜施加压力，其中，对截留分子量为10000和3000的超滤膜施加的压力都为IMpa ;对截留分子量为150纳滤膜的操作压力为2Mpa。
8.根据权利要求5所述的方法，其中，大孔树脂的型号为AB-8。
9.根据权利要求1-7之一所述的方法，其中，作为溶剂的乙醇的浓度为50%，提取的温度为80摄氏度。
10.根据权利要求9所述的方法，其中，溶剂与菌丝体的比例为10ml/g，同时进行连续循环提取1-3次。
全文摘要
本发明提供一种从生物体内提取N6-(2-羟乙基)腺苷的方法，该方法包括1)对菌丝体进行干燥，粉碎获得菌丝体粉末；2)对粉末进行热回流提取，条件如下以10%-80%的乙醇作溶剂，40-120℃的温度下提取0.5-5小时获得乙醇提取溶液。3)经过膜分离，大孔树脂柱纯化，低温甲醇结晶获得高纯度N6-(2-羟乙基)腺苷。该技术生产成本低，污染小，得率高，可以成为工业上生产N6-(2-羟乙基)腺苷产品的一种新技术。
文档编号C07H19/167GK103242402SQ20131015154
公开日2013年8月14日 申请日期2013年4月26日 优先权日2013年4月26日
发明者柴一秋, 金轶伟, 朱碧纯, 厉晓腊, 陈官菊, 刘又高 申请人:浙江省亚热带作物研究所