本发明涉及抗氧化肽
技术领域：
，特别是涉及一种抗氧化肽及其制备方法及包含该抗氧化肽的化妆品。
背景技术：
：机体的新陈代谢过程中，可产生O2-、H2O2、ROO和-OH等自由基，体内自由基的积聚可导致脂质的过氧化，进而破坏细胞膜引起细胞的损伤致人体疾病发生。由于人工合成的抗氧化剂BHA、BHT、PC等具有毒副作用，不适合作为具有保健功能的化妆品添加剂。技术实现要素：基于此，有必要针对上述问题，提供一种无毒副作用、可替代人工合成抗氧化剂的天然抗氧化肽。一种抗氧化肽，所述抗氧化肽包括如下若干肽段：肽段M1的氨基酸序列组成为SEQIDNO.1：Asn-Glu-Ser-Cys-Lys-Leu肽段M2的氨基酸序列组成为SEQIDNO.2：Leu-Phe-Thr-Asp-Val-Asn-Gln肽段M3的氨基酸序列组成为SEQIDNO.3：Glu-Gly-Leu-Trp-Ala-Cys-Gly。上述抗氧化肽的抗氧化活性高，无毒副作用、可替代人工合成抗氧化剂的天然抗氧化肽。在其中一个实施例中，所述抗氧化肽的分子量为500Da-2000Da。本申请还包括一种抗氧化肽的制备方法。一种如本申请所述的抗氧化肽的制备方法，包括如下步骤：1)选取马面鱼鱼皮，并用水清洗干净，然后均质成肉泥；2)按质量体积比为1:6至1:8的料液比加水得到混合液，调节混合液的pH值7.0-8.0，加入蛋白酶酶解，蛋白酶的添加量为每克肉泥中加入500U-1500U，在40℃-60℃下酶解处理2h-3h，灭酶，离心，取上清液；3)将所述上清液用10000Da的超滤膜分离，并取分子量10000Da以下的超滤液，冷冻干燥制得肽粉A；4)将所述肽粉A按20mg/mL-25mg/mL浓度比例溶解于蒸馏水中，并经过层析柱分离纯化,收集分子量在500Da-2000Da之间的纯化液，浓缩，冷冻干燥得到肽粉B，然后用去离子水配制0.5mg/mL溶液，过0.20μm-0.25μm微孔滤膜，用反向液相色谱进一步分离纯化，再经活性筛选，干燥后得到抗氧化肽。在其中一个实施例中，所述蛋白酶包括风味酶或胰蛋白酶的一种或两种的组合。在其中一个实施例中，所述蛋白酶为胰蛋白酶和风味酶，所述胰蛋白酶与所述风味酶的质量比为1:3-1:5。在其中一个实施例中，所述层析柱为SephadexG-15层析柱或SephadexG-25层析柱。在其中一个实施例中，所述反向液相色谱的色谱柱为C18色谱柱。在其中一个实施例中，所述反向液相色谱采用梯度洗脱。在其中一个实施例中，所述梯度洗脱的洗脱条件为：0.001-10min，水洗脱；10-30min，0.01％-100％乙腈水溶液浓度由0.01％线性递增至100％；30-50min，乙腈洗脱。上述抗氧化肽的制备方法简单，基于酶解技术，反应条件温和，且全程不添加有害物质，制备得到的抗氧化活性高，无毒副作用、可替代人工合成抗氧化剂的天然抗氧化肽。本申请还包括一种抗氧化肽的化妆品。一种包括本申请所述的抗氧化肽的化妆品。上述含抗氧化肽的化妆品具有清除自由基、抗氧化、防止衰老的特性。具体实施方式为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合具体实施方式，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施方式仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。除非另有定义，本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的
技术领域：
的技术人员通常理解的含义相同。本文中在本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施方式的目的，不是旨在于限制本发明。本文所使用的术语“及/或”包括一个或多个相关的所列项目的任意的和所有的组合。本发明一实施例的抗氧化肽的制备方法，包括如下步骤：1)选取马面鱼鱼皮，并用水清洗干净，然后均质成肉泥。马面鱼又称剥皮鱼、橡皮鱼，是我国仅次于带鱼的海洋经济鱼类，而马面鱼的可食用部分较少，马面鱼的不可食用部分约占53％，其中鱼皮占8.5％～9.4％，马面鱼皮厚且硬，加工过程中鱼皮通常会被剥除丢弃，这样不仅污染环境，也造成了资源的浪费。其实，马面鱼皮中含有丰富的胶原蛋白，若对其进行开发利用制备活性肽，将会取得显著的经济效益和社会效益，但是，现有技术中，以马面鱼皮为原料制备胶原蛋白抗氧化肽的工艺鲜见报道。在一优选实施方式中，均质机均质速度为3000rpm-4000rpm，搅碎得到的肉泥均匀性好，利于酶解，水解度高。2)按1:6-1:8(质量体积比即m/v)的料液比加水得到混合液，调节混合液的pH值7.0-8.0，加入蛋白酶酶解，蛋白酶的添加量为每克肉泥中加入500U-1500U，在40-60℃下酶解处理2-3h，灭酶，离心，取上清液。例如，按m/v为1:7.5的料液比加水得到混合液，调节混合液的pH值7.2，加入蛋白酶酶解，蛋白酶的添加量为每克肉泥中加入1200U，在48℃下酶解处理2.5h，灭酶，离心，取上清液。在一优选实施方式中，蛋白酶的添加量为每克肉泥中加入800U-1500U，优选地，蛋白酶的添加量为每克肉泥中加入1000-1200U，例如1000U、1100U或1200U，酶解水解度高。在一优选实施方式中，蛋白酶包括风味酶、胰蛋白酶中一种或两种的组合。在一优选实施方式中，蛋白酶为胰蛋白酶和风味酶，胰蛋白酶与风味酶的质量比为1:3至1:5。此条件下酶解，其水解度较高，得到的多肽抗氧化性相比于其他组合也较高。例如，蛋白酶为胰蛋白酶和风味酶，胰蛋白酶与风味酶的质量比为1:4。其中，灭酶的主要作用是将酶的活性杀死，防止过度水解。在一优选实施方式中，灭酶为本领域所公知的灭酶活方式，在此不再过多赘述。作为优选的，灭酶为90℃-100℃下加热10-15min。灭酶效果更好。3)将所述上清液用10000Da的超滤膜分离，并取分子量10000Da以下的超滤液，冷冻干燥制得肽粉A。超滤的作用是去掉分子量过大的多肽和未水解的蛋白质，本申请发明人发现，分子量过大的多肽在小鼠抗氧化酶活力测定试验中与空白对照组(不摄入本申请的抗氧化肽)相比差异不显著，无抗氧化活性。4)将所述肽粉A按20mg/mL-25mg/mL浓度比例溶解于蒸馏水中，并经过层析柱分离纯化,收集分子量在500Da-2000Da之间的纯化液，浓缩，冷冻干燥得到肽粉B，然后用去离子水配制0.5mg/mL溶液，过0.20μm-0.25μm微孔滤膜，用反向液相色谱进一步分离纯化，再经活性筛选，干燥后得到抗氧化肽。其中，层析的主要作用是将特定分子量范围的小分子多肽分离出来并进行富集。在一优选实施方式中，层析柱为SephadexG-15层析柱或SephadexG-25层析柱。优选地，层析柱为SephadexG-25层析柱，本申请发明人发现SephadexG-25更适合小分子量多肽纯化，其适用的分离范围为500Da-10000Da的多肽纯化，提取率更高。其中，过微孔滤膜的作用是去除肽粉溶解液中的大分子杂质，防止在反向液相色谱柱上样时候阻塞色谱柱，再者，也可以避免出现杂峰，干扰分离纯化。其中，反向液相色谱的主要作用是对肽粉B进一步分离纯化。在一优选实施方式中，反向液相色谱的色谱柱为C18色谱柱。在一优选实施方式中，反向液相色谱为梯度洗脱。梯度洗脱肽段分离效果更好，不会出现拖尾的现象。在一优选实施方式中，所述梯度洗脱的洗脱条件为：0.001-10min，水洗脱；10-30min，0.01％-100％乙腈水溶液浓度由0.01％线性递增至100％；30-50min，乙腈洗脱。其中，活性筛选的主要是通过评定SOD、GSH-Px和CAT的抗氧化活性筛选出抗氧化活性高的抗氧化肽。上述抗氧化肽的制备方法简单，基于酶解技术，反应条件温和，且全程不添加有害物质，制备得到的抗氧化活性高，无毒副作用、可替代人工合成抗氧化剂的天然抗氧化肽。本发明还提供了一种抗氧化肽。一种抗氧化肽，包括如下若干肽段：肽段M1的氨基酸序列组成为SEQIDNO.1：Asn-Glu-Ser-Cys-Lys-Leu肽段M2的氨基酸序列组成为SEQIDNO.2：Leu-Phe-Thr-Asp-Val-Asn-Gln肽段M3的氨基酸序列组成为SEQIDNO.3：Glu-Gly-Leu-Trp-Ala-Cys-Gly。在一优选实施方式中，抗氧化肽的分子量在500Da-2000Da之间，本申请发明人发现，分子量在此区间的肽段抗氧化效果比其他大分子多肽抗氧化效果更好。对实施例2中的肽粉经过SephadexG-25层析后，在220nm波长下得到四段多肽，分别测定分子量并将四段多肽进行收集，冷冻干燥得到肽粉计做F1、F2、F3、F4。再将肽粉复溶于蒸馏水中，除阴性(空白)对照组外，其余各组灌喂10mL/(kg.d)多肽水溶液，每1mL多肽水溶液含有多肽粉8mg，连续八周。阴性对照组灌喂等量蒸馏水。所有实验动物均每天灌胃一次一次，连续八周。第八周最后一天灌喂后，动物眼眶静脉丛静脉取血。以丙二醛(MDA)考察抗氧化活性，丙二醛(MDA)是一种脂质过氧化物，可以反映机体自由基的含量。经测定大鼠试验测定其血浆中的MDA值进行比较，参见表1。表1肽段分子量MDA(nmol/mL)F110000Da左右20.47F25000Da左右18.87F32000Da左右16.75F4500Da左右16.21阴性对照组(即灌喂等量蒸馏水组)血浆中MDA值为20.53，而F1与阴性对照组之间基本无差别，也就是说，分子量在10000Da左右的多肽基本无抗氧化活性。相比较而言，分子量在500Da-2000Da左右的肽段抗氧化活性好，因此选择对该分子量区间的肽段进行富集，并进一步用反向液相色谱进一步分离纯化。上述抗氧化肽的抗氧化活性高，无毒副作用、可替代人工合成抗氧化剂的天然抗氧化肽。本申请还提供了一种化妆品。一种包括本申请所述的抗氧化肽的化妆品。上述含抗氧化肽的化妆品具有清除自由基、抗氧化、防止衰老的特性。在一优选实施方式中，化妆品可以为乳剂、水剂等。所述化妆品还包括涂抹系统，所述涂抹系统包括控涂抹笔，所述涂抹笔包括筒体、按摩部、弹簧、滚珠及抵持杆，所述筒体开设有容置腔，所述容置腔容置有如上任一实施例中所述的抗氧化肽，或者说，所述抗氧化肽容置于所述容置腔内。所述按摩部连接所述筒体，所述按摩部具有中空结构，所述按摩部邻近所述筒体的一端设置有固定杆，所述按摩部远离所述筒体的端部开设有出样孔，所述滚珠部分容置于所述出样孔内，所述抵持杆的第一端连接所述滚珠，所述抵持杆的第二端连接所述弹簧的第一端，所述弹簧的第二端连接所述固定杆，所述滚珠用于在所述滚珠受到外部压力时带动所述抵持杆压缩所述弹簧以开启所述出样孔，所述滚珠还用于在外部压力消失时在所述弹簧的回复力的作用下封闭所述出样孔。如此，上述所述涂抹系统，能够较好地涂抹所述抗氧化肽。又如，所述出样孔的形状适配于所述滚珠的形状。又如，所述筒体螺接所述按摩部。为了较好地安装所述弹簧，一实施例中，所述固定杆上设置有容置槽，所述弹簧的第二端容置于所述容置槽内，又如，所述弹簧的第二端与所述容置槽的底壁抵接。又如，所述弹簧的第二端嵌置于所述容置槽内，又如，所述弹簧的第二端嵌置于所述容置槽内且所述弹簧的第二端与所述容置槽的底壁抵接。又如，所述抵持杆设置有安装槽，所述弹簧的第一端容置于所述安装槽内，又如，所述弹簧的第一端与所述安装槽的底壁抵接。又如，所述弹簧的第一端嵌置于所述安装槽内，又如，所述弹簧的第一端嵌置于所述安装槽内且所述弹簧的第一端与所述安装槽的底壁抵接，如此，能够较好地安装所述弹簧。为了能够使所述滚珠能够较好地封闭和开启所述出样孔，一实施例中，所述出样孔具有圆形截面，又如，所述出样孔具有弧形内侧壁，又如，所述出样孔沿靠近所述筒体的方向逐渐变宽，又如，所述出样孔最窄处的截面的直径小于所述滚珠的直径，如此，能够使所述滚珠能够较好地封闭和开启所述出样孔。为了能够起到较好的按摩效果，一实施例中，所述按摩部的外侧壁设置有凸纹，又如，所述按摩部的外侧壁设置有若干凸纹，又如，若干所述凸纹呈圆周均匀分布于所述按摩部的外侧壁上，如此，能够使所述按摩部还能够起到较好的按摩效果。上述涂抹系统具有方便涂抹本发明所述的抗氧化肽的效果，而且具有按摩功效。以下进一步结合具体实施例对本发明作进一步的阐述。实施例11)选取马面鱼鱼皮，并用水清洗干净，均质机均质成肉泥。2)按1:6(m/v)的料液比加水得到混合液，调节混合液的pH值7.0，加入蛋白酶酶解，蛋白酶的添加量为每克肉泥中加入1000U，其中，胰蛋白酶与所述风味酶的质量比为1:3，在40℃下酶解处理2h，灭酶，离心，取上清液。3)将上清液用10000Da的超滤膜分离，并取分子量10000Da以下的超滤液，冷冻干燥制得肽粉A1。4)将肽粉A1按20mg/mL溶解于蒸馏水中，并经过SephadexG-25层析柱分离纯化,收集分子量在500-2000Da之间的纯化液，浓缩，冷冻干燥得到肽粉B1。然后用去离子水配制0.5mg/mL溶液，过0.22μm微孔滤膜，用反向液相色谱进一步分离纯化，色谱分析的条件为：紫外检测波长设定280nm,上样量为2mL，洗脱速度为1mL/min,C18HypersilBDS(250mm×4.6mm,5μm)，柱温，30℃；流动相为乙腈-水溶液，梯度洗脱的洗脱条件为：0.001-10min，水洗脱；10-30min，0.01％-100％乙腈水溶液浓度由0.01％线性递增至100％；30-50min，乙腈洗脱。冷冻干燥后得到抗氧化肽S1。实施例21)选取马面鱼鱼皮，并用水清洗干净，均质机均质成肉泥。2)按1:7(m/v)的料液比加水得到混合液，调节混合液的pH值7.5，加入蛋白酶酶解，蛋白酶的添加量为每克肉泥中加入800U，其中，胰蛋白酶与所述风味酶的质量比为1:4，在50℃下酶解处理2.5h，灭酶，离心，取上清液。3)将上清液用10000Da的超滤膜分离，并取分子量10000Da以下的超滤液，冷冻干燥制得肽粉A2。4)将肽粉A2按22mg/mL溶解于蒸馏水中，并经过SephadexG-25层析柱分离纯化,收集分子量在500-2000Da之间的纯化液，浓缩，冷冻干燥得到肽粉B2。然后用去离子水配制1mg/mL溶液，过0.26μm微孔滤膜，用反向液相色谱进一步分离纯化，色谱分析的条件同实施例1，冷冻干燥后得到抗氧化肽S2。实施例31)选取马面鱼鱼皮，去除内脏，并用水清洗干净，均质机均质成肉泥。2)按1:8(m/v)的料液比加水得到混合液，调节混合液的pH值8.0，加入蛋白酶酶解，蛋白酶的添加量为每克肉泥中加入1500U，其中，胰蛋白酶与所述风味酶的质量比为1:5，在50℃下酶解处理3h，灭酶，离心，取上清液。3)将上清液用10000Da的超滤膜分离，并取分子量10000Da以下的超滤液，冷冻干燥制得肽粉A3。4)将肽粉A3按25mg/mL溶解于蒸馏水中，并经过SephadexG-25层析柱分离纯化,收集分子量在500-2000Da之间的纯化液，浓缩，冷冻干燥得到肽粉B3。然后用去离子水配制1mg/mL溶液，过0.26μm微孔滤膜，用反向液相色谱进一步分离纯化，色谱分析的条件同实施例1。冷冻干燥后得到抗氧化肽S3。对比例11)选取马面鱼鱼皮，去除内脏，并用水清洗干净，均质机均质成肉泥。2)按1:6(m/v)的料液比加水得到混合液，调节混合液的pH值4.0，加入胃蛋白酶酶解，胃蛋白酶的添加量为每克肉泥中加入800U，在50℃下酶解处理2.5h，灭酶，离心，取上清液。3)将上清液用10000Da的超滤膜分离，并取分子量10000Da以下的超滤液，冷冻干燥制得肽粉D1。4)将肽粉A2按20mg/mL溶解于蒸馏水中，并经过SephadexG-25层析柱分离纯化,收集分子量在500-2000Da之间的纯化液，浓缩，冷冻干燥得到肽粉D2。然后用去离子水配制1mg/mL溶液，过0.26μm微孔滤膜，用反向液相色谱进一步分离纯化，色谱分析的条件同实施例1，冷冻干燥后得到抗氧化肽D1。性能测试：自由基是机体许多重要的生化反应的中间代谢产物，正常状况下，其产生和清除处于动态平衡。然而，自由基是有效的防御系统，如果机体不能维持这一动态平衡，则会使自己处于氧化压力状态下，自由基通过攻击机体大分子物质和细胞器，对机体造成损伤。然而，肌肉细胞含有复杂的内源性细胞防御机制以清除氧自由基(如谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)、超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT)等)，对机体由运动引发的氧化损伤和DNA损伤具有一定的保护作用，GSH-Px可加速H2O2和GSH的反应，并将它们转化为水和氧化性谷胱甘肽；SOD可以清除超氧阴离子自由基；CAT可以降解羟自由基。丙二醛(MDA)是一种脂质过氧化物，可以反映机体自由基的含量。本申请以SOD、CAT、GSH-PX、MDA作为抗氧化活性的评价指标，分别考察各实施例的抗氧化肽的抗氧化活性。1材料和试剂SD大鼠SPF级，体重200±20g，雄雌各半。总超氧化物歧化酶(SOD)测定试剂盒、丙二醛(MDA)测定试剂盒、过氧化氢酶(CAT)测试盒、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-PX)测定试剂盒(比色法)均由南京建成生物工程研究所提供。2试验2.1动物模型构建除阴性(空白)对照组外，其余各组灌喂10mL/(kg.d)多肽水溶液，每1mL多肽水溶液含有多肽粉8mg，连续八周。阴性对照组灌喂等量蒸馏水。所有实验动物均每天灌胃一次一次，连续八周。第八周最后一天灌喂后，动物眼眶静脉丛静脉取血，按照MDA、SOD、CAT、GSH-PX试剂盒说明操作。2.2酶解度测定对经10000Da的超滤膜分离后并冷冻干燥的肽粉(A1、A2、A3、D1)测定酶解度。2.3肽段序列测定选择denovo测序法测定。3结果表2注：与阴性(空白)对照比较*P＜0.05，与阴性(空白)对照比较**P<0.01从表2中可以看出，S1、S2、S3组中小鼠体内的SOD活性较阴性(空白)对照而言，差异显著(P＜0.05)，GSH-Px和CAT的活性与SOD具有相同趋势，S2组在上述三指标评价中效果均为最好，差异极显著(P＜0.01)。而对各组中小鼠血浆中MDA的检测结果可知，S1、S2、S3组均低于阴性对照组，差异显著(P＜0.05)，且S2组效果最好，差异极显著(P＜0.01)。D1组与阴性对照组无显著差异。此外，S1、S2、S3组相对于D1组而言，三指标在效果评定中也优于D1组。说明上述抗氧化肽的抗氧化活性高。对抗氧化效果最好的抗氧化肽S2进行测序，得到三段肽段序列为：肽段M1的氨基酸序列组成为SEQIDNO.1：Asn-Glu-Ser-Cys-Lys-Leu肽段M2的氨基酸序列组成为SEQIDNO.2：Leu-Phe-Thr-Asp-Val-Asn-Gln肽段M3的氨基酸序列组成为SEQIDNO.3：Glu-Gly-Leu-Trp-Ala-Cys-Gly。需要说明的是，各所述实施例中的所述重量份，即质量份，亦即质量份数，可以理解为克、毫克、千克、斤、公斤、英镑、吨等。以克为例，例如，1重量份为0.0001至10000克中的某一质量；例如，1重量份可以为0.001g、0.01g、0.02g、0.05g、0.1g、0.2g、0.5g、1g、2g、3g、4g、5g、10g、15g、20g、30g、50g、80g、100g、500g、1000g、5000g、10000g或50000g等，且不限于此，根据实际生产制造选用即可，各实施例以此类推。例如，1重量份为1克，0.1重量份即为0.1克，以此类推。以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。序列表<110>广州赛莱拉干细胞科技股份有限公司<120>抗氧化肽及其制备方法及包含该抗氧化肽的化妆品<141>2018-04-02<160>3<170>SIPOSequenceListing1.0<210>1<211>6<212>PRT<213>ArtificialSequence<400>1AlaGlySerCysLeuLeu15<210>2<211>7<212>PRT<213>ArtificialSequence<400>2LeuProThrAlaValAlaGly15<210>3<211>7<212>PRT<213>ArtificialSequence<400>3GlyGlyLeuThrAlaCysGly15当前第1页1 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