本发明涉及微生物技术领域，特别涉及菌株及其应用。
背景技术：
氯酸根阴离子(clo3-)，或简称为“氯酸盐”，是一类具有毒性的强氧化剂，可以稳定存在于水环境中，具有高度可溶性、迁移性等特点，并且不易被土壤、沉积物颗粒吸附或生物性聚集。氯酸盐已经被工业生产多年，在农业上，它被作为除草剂、脱叶剂、土壤杀菌剂而大量使用，并且在反季节龙眼生产中作为产期调控剂被应用；在工业中，它被用来制造高氯酸盐、亚氯酸盐，用作苯胺染色的氧化剂和媒染剂，用作二氧化氯生产中的漂白剂；它也是使用二氧化氯对水体消毒的副产物。
目前对于氯酸盐没有确定的排放标准，但是根据之前的研究发现，氯酸盐对一些生物体有明显的毒害效应。它对许多微生物和藻类有强毒性，且饮用水中较高剂量的氯酸盐可能是贫血症的诱因之一。
目前对于氯酸盐这种环境污染物的去除方法主要有物理化学法和生物法，其中物化法包括吸附、离子交换、膜技术和化学还原等。一般物化法耗资较大，且需要二次处理。微生物去除氯酸盐的能耗低、效率高，不需要二次处理，因此具有很好的可行性，受到了越来越多的关注。生物修复的方法，其中需要进行研究的很重要的一部分就是可以进行氯酸盐还原的微生物。目前主要用来还原氯酸盐的细菌包括氯酸盐还原菌和高氯酸盐还原菌，其中大部分均属于变形菌门中的α、β、γ、ε变形菌纲。氯酸盐还原菌的种类是影响氯酸盐还原效果的重要因素，因此很必要加强对于氯酸盐还原菌筛选和培养的研究，得到不同的高效的优势菌株，以期能实现处理大规模该类氯酸盐污染水体的问题。目前，虽然已经筛选出许多可以还原氯酸盐的细菌，如：dechlorospirillum、magnetospirillum、dechloromonas、dechlorobacter、propionivibrio、azospira、dechlorosoma、pseudomonas、dechloromarinus属的细菌。但是目前已报道的细菌进行氯酸盐呼吸时对ph的耐受范围不够宽泛，且大多数纯培养的细菌对较高浓度氯酸盐的耐受情况不明确。
技术实现要素：
有鉴于此，本发明提供一种菌株及其应用。本发明针对目前已有菌株进行氯酸盐呼吸时对ph的耐受范围不够宽泛，对较高浓度氯酸盐的耐受情况不明确的不足，提供一种可以耐受更广泛ph、更高浓度氯酸盐，且可以还原氯酸盐的新菌株，提供一种利用该菌株消除环境污染物氯酸盐的方法。
为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
本发明提供了菌株，具有如下所示的核苷酸序列中的任意一项：
ⅰ、具有seqidno:1所示的核苷酸序列；
ⅱ、具有seqidno:1所示的核苷酸序列经修饰、取代、缺失或添加一个或多个碱基获得的核苷酸序列；
iii、与seqidno:1所示的核苷酸序列具有至少80％同源性的序列；
iv、如ⅰ、ⅱ或iii所示序列的互补序列。
在本发明的一些具体实施方案中，本发明提供的菌株保藏编号为cctccno：m2018048。
本发明还提供了菌株在还原氯酸盐中的应用。
本发明还提供了菌株在治理污水中的应用。
在本发明的一些具体实施方案中，所述污水含有氯酸盐。
本发明还提供了一种还原氯酸盐和/或处理含有氯酸盐的污水的方法，将本发明提供的菌株活化、扩大培养后接种于含有氯酸盐的培养基或污水中。
在本发明的一些具体实施方案中，所述菌株对ph的最低耐受值为4.5。
在本发明的一些具体实施方案中，所述培养基或污水的ph为4.5～8.0。
在本发明的一些具体实施方案中，所述菌株对氯酸盐的耐受浓度为132mm。
在本发明的一些具体实施方案中，所述方法具体为：将本发明提供的菌株单菌落接种于3mllb中培养12h，再转接到100mllb中培养12h，收集细菌加入到以氯酸钠作电子受体的无机盐培养基中，培养240h，定时取样测定溶液中细菌生长情况、氯酸盐浓度变化、氯离子浓度变化。
在本发明的一些具体实施方案中，lb培养基成分为(g/l)：胰蛋白胨10；酵母提取物5；nacl10。
在本发明的一些具体实施方案中，无机盐培养基为(g/l)：nh4cl0.25；nah2po4·2h2o0.78；kcl0.1；nahco32.5；naclo31.064；葡萄糖1.802。
在本发明的一些具体实施方案中，转接入无机盐培养基中所述菌株的初始od600约为0.1。
在本发明的一些具体实施方案中，使用分光光度计测定od600绘制细菌生长曲线，使用离子色谱仪器测定溶液中氯酸盐浓度变化、氯离子浓度变化。所述菌株在ph4.5～8.0的条件下，以氯酸钠作电子受体，可以进行生长。在ph4.5～8.0的条件下，细菌的比生长速率均保持在较高水平，生长迅速。除在ph为4.5的条件下，该菌仅还原74％的氯酸盐，在ph为5.0～8.0的条件下，该菌均能100％还原氯酸盐。
在本发明的一些具体实施方案中，所述方法具体为：将本发明提供的菌株单菌落接种于3mllb中培养12h，再转接到100mllb中培养12h，收集细菌加入到以氯酸钠作电子受体的不同ph的无机盐培养基中，定时取样，测定细菌的生长曲线与氯酸盐还原曲线。
在本发明的一些具体实施方案中，所述无机盐培养基中缓冲体系为100mm的磷酸盐。
在本发明的一些具体实施方案中，所述菌株最高可耐受naclo3浓度为132mm。在120h内，可对初始浓度为9mm、19mm、24mm、48mm的氯酸盐分别实现100％、100％、88％、47％、48％的降解率。
在本发明的一些具体实施方案中，所述方法具体为：将分离得到的菌株单菌落接种于3mllb中培养12h，再转接到100mllb中培养12h，收集细菌加入到不同浓度氯酸钠的无机盐培养基中，定时取样测定溶液中细菌生长情况。
本发明还提供了一种还原氯酸盐和/或处理含有氯酸盐的污水的制剂，包括本发明提供的菌株及可接受的辅料。
本发明从微生物群中筛选得到可以还原氯酸盐的人苍白杆菌菌株xm-1，该菌为人苍白杆菌属中第一株被发现具有还原氯酸盐能力的细菌。该菌在合适的条件下可以完全还原水体中污染物氯酸盐为氯离子。
本发明公开的一种微生物菌株，该微生物菌株为xm-1，分类命名为人苍白杆菌(ochrobacterumanthropi)，在中国典型培养物保藏中心的保藏号为cctccno：m2018048。
本发明筛选得到的人苍白杆菌菌株xm-1进行氯酸盐呼吸时耐受ph范围广，可耐受ph范围为4.5～8.0。相比于以往筛选出的氯酸盐还原菌，该菌耐受酸性条件的能力明显更强，且在ph4.5～8.0的条件下，细菌的比生长速率均保持在较高水平，生长迅速，而之前分离出的氯酸盐还原菌在ph低于7的条件下，细菌的比生长速率显著降低；除在ph为4.5的条件下，该菌仅降解74％的氯酸盐，在ph为5.0～8.0的条件下，该菌均能100％降解氯酸盐。因此该菌在还原具有广泛ph的实际水体的氯酸盐中具有应用前景，尤其是酸性范围水体。
本发明筛选得到的人苍白杆菌菌株xm-1进行氯酸盐呼吸时耐受naclo3浓度高，最高可耐受naclo3浓度为132mm，在120h内，可对132mm氯酸盐实现约48％的降解。该菌在还原高浓度氯酸盐水中具有应用前景。
生物保藏说明
生物材料：人苍白杆菌xm-1；分类命名：人苍白杆菌xm-1(ochrobacterumanthropixm-1)；于2018年01月22日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏中心地址为：中国武汉武汉大学；保藏编号为cctccno：m2018048。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。
图1示本发明所述菌株的系统发育树；
图2示本发明所述菌株在无机盐培养基中氯酸盐的降解曲线、氯离子生成曲线、细菌在无机盐中生长曲线；
图3示本发明所述菌株在不同ph条件下的生长曲线；
图4示本发明所述菌株在不同ph条件下的最大比生长速率；
图5示本发明所述菌株在不同ph条件下的氯酸盐的降解曲线；
图6示本发明所述菌株在不同浓度氯酸盐中的生长曲线；
图7示本发明所述菌株在不同浓度氯酸盐中的氯酸盐的降解曲线。
具体实施方式
本发明公开了一种菌株及其应用，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。
针对目前已有菌株进行氯酸盐呼吸时对ph的耐受范围不够宽泛，对较高浓度氯酸盐的耐受情况不明确的不足，提供一种可以耐受更广泛ph、更高浓度氯酸盐，且可以还原氯酸盐的新菌株，提供一种利用该菌株消除环境污染物氯酸盐的方法。
本发明使用的初始接种物来源于安徽省合肥市望塘污水处理厂的氧化沟工艺的活性污泥，在采样后的一周内使用。
本发明采用液体选择培养基富集法来富集所需菌株。取5g污泥接种到厌氧血清瓶中，向血清瓶中加入50ml无机盐培养基，以naclo3(10mm)作电子受体，ch3coona(10mm)作电子供体。无机盐培养基成分为(g/l)：nh4cl0.25；nah2po4·2h2o0.78；kcl0.1；nahco32.5；10ml微量元素，10ml维生素。微量元素组成为(g/l)：氨三乙酸1.5；mgso43.0；mnso4·h2o0.5；nacl1.0；feso4·7h2o0.1；cacl2·2h2o0.1；cocl2·6h2o0.1；zncl0.13；cuso40.01；alk(so4)2·12h2o0.01；h3bo20.01；na2moo40.025；nicl2·6h2o0.024；na2wo4·2h2o0.025。维生素组成为(mg/l)：生物素2；叶酸2；维生素b25；维生素b15；烟酸5；维生素b55；维生素b120.1；对氨基苯甲酸5。培养基ph为约7.2，无需额外的调ph的步骤。用n2/co2气体(n2:co2＝8：2)对血清瓶中培养基曝气20min，以除去瓶中的氧气保持瓶中厌氧环境，然后灭菌(121℃，20min)。血清瓶中初次接种污泥后，放入摇床(30℃，200rpm)中培养10d；第二次转接，取上一次转接的血清瓶中混合物的10％，转入新鲜的培养基中，放入摇床(30℃，200rpm)中培养；之后按同样的方法进行连续的转接，当转接大于等于三次后，经过过夜培养，血清瓶中溶液呈浑浊状态，停止富集步骤。
本发明采用固体选择培养基来分离所需菌株。取富集步骤中最后一次转接的血清瓶中的培养基，涂布于无机盐固体培养基上，无机盐固体培养基以naclo3(10mm)作电子受体，ch3coona(10mm)作电子供体，加入1.5％agar。将在平板上长出的形态各异的单菌落分别挑出，而后经过不断纯化的步骤得到纯种细菌。
本发明中通过验证分离得到纯种细菌还原氯酸盐的能力，得到目标菌株。挑选所得细菌的单菌落，入3ml的lb培养基中，lb培养基成分为(g/l)：胰蛋白胨10；酵母提取物5；nacl10，放入摇床(30℃，200rpm)中培养12h。取出定量(1ml，od600为2.472)的细菌转入100ml的lb培养基中，放入摇床(30℃，200rpm)中培养12h。将培养好的100ml的lb中的细菌离心(6000g，5min)，去除上清液收集菌体；使用无机盐培养基洗涤一次，离心(6000g，5min)，去除上清液收集菌体；使用无机盐培养基重悬细菌，将其注入到含有50ml无机盐培养基的血清瓶中(控制细菌初始od600约为0.1)，naclo3(10mm)作电子受体，葡萄糖(10mm)作电子供体，放入摇床(30℃，200rpm)中培养，定时取样。目标菌株可以在上述培养基中生长，且培养基中氯酸盐浓度随时间降低，判断得到目标菌株。
通过测定分离菌株的16srdna序列，确定细菌分类。提取该菌株dna，利用引物27f和1492r扩增该菌株的16srdna基因，将产物与t载体连接，经测序确认该片段序列。将该序列与genbank中相关数据进行比对，该菌与人苍白杆菌(ochrobacterumanthropi)的同源性达到99％。可确认该菌株为人苍白杆菌(ochrobacterumanthropi)，命名为xm-1。
所述微生物保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为cctccno：m2018048。
本发明通过改变无机盐培养基ph，测定所得细菌在不同ph条件下的生长情况及还原氯酸盐情况。无机盐培养基中以naclo3(10mm)作电子受体，葡萄糖(10mm)作电子供体，将原培养基中碳酸氢盐-磷酸二氢盐的缓冲盐换成100mm的磷酸盐缓冲盐，分别调节培养基的ph为4.0、4.5、5.0、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、9.0。结果表明，该菌可耐受ph范围为4.5～8.0，在ph4.5～8.0的条件下，细菌的比生长速率均保持在较高水平，生长迅速；除在ph为4.5的条件下，该菌仅还原74％的氯酸盐，在ph为5.0～8.0的条件下，该菌均能100％还原氯酸盐。
本发明通过改变电子供体naclo3的浓度，测定所得细菌在不同浓度naclo3的条件下的生长情况及还原氯酸盐情况。结果表明，该菌最高可耐受naclo3浓度为132mm；在120h内，可对初始浓度为9mm、19mm、24mm、48mm的氯酸盐分别实现100％、100％、88％、47％、48％的降解率。
本发明的有益效果是：
一、本发明从微生物群中筛选得到可以还原氯酸盐的人苍白杆菌菌株xm-1，该菌为人苍白杆菌属中第一株被发现具有还原氯酸盐能力的细菌。该菌在合适的条件下可以完全还原水体中污染物氯酸盐为氯离子。
二、本发明筛选得到的人苍白杆菌菌株xm-1进行氯酸盐呼吸时耐受ph范围广，可耐受ph范围为4.5～8.0。相比于以往筛选出的氯酸盐还原菌，该菌耐受酸性条件的能力明显更强，且在ph4.5～8.0的条件下，细菌的比生长速率均保持在较高水平，生长迅速，而之前分离出的氯酸盐还原菌在ph低于7的条件下，细菌的比生长速率显著降低；除在ph为4.5的条件下，该菌仅降解74％的氯酸盐，在ph为5.0～8.0的条件下，该菌均能100％降解氯酸盐。因此该菌在还原具有广泛ph的实际水体的氯酸盐中具有应用前景，尤其是酸性范围水体。
三、本发明筛选得到的人苍白杆菌菌株xm-1进行氯酸盐呼吸时耐受naclo3浓度高，最高可耐受naclo3浓度为132mm，在120h内，可对132mm氯酸盐实现约48％的降解。该菌在还原高浓度氯酸盐水中具有应用前景。
本发明提供的菌株及其应用的整个试验过程中所用原料及试剂均可由市场购得。
下面结合实施例，进一步阐述本发明：
实施例1：本发明所述微生物菌株的筛选
液体选择培养基富集法：初始接种物使用安徽省合肥市望塘污水处理厂的氧化沟工艺的活性污泥，取5g污泥接种到厌氧血清瓶中，向血清瓶中加入50ml无机盐培养基，以naclo3(10mm)作电子受体，ch3coona(10mm)作电子供体。培养基ph为约7.2，无需额外的调ph的步骤。用n2/co2气体(n2:co2＝8：2)对血清瓶中培养基曝气20min，以除去瓶中的氧气保持瓶中厌氧环境，然后灭菌(121℃，20min)。血清瓶中初次接种污泥后，放入摇床(30℃，200rpm)中培养10d；第二次转接，取上一次转接的血清瓶中混合物的10％，转入新鲜的培养基中，放入摇床(30℃，200rpm)中培养；之后按同样的方法进行连续的转接，当转接大于等于三次后，经过过夜培养，血清瓶中溶液呈浑浊状态，说明可能有目标菌株被富集。
固体选择培养基分离法：取富集步骤中最后一次转接的血清瓶中的培养基，涂布于无机盐固体培养基上，无机盐固体培养基以naclo3(10mm)作电子受体，ch3coona(10mm)作电子供体，加入1.5％agar。将在平板上长出的形态各异的单菌落分别挑出，而后经过不断地在固体培养基上划线，纯化所得细菌。通过上述方法，本发明筛选出一株微生物菌株xm-1。
所述无机盐培养基成分为(g/l)：nh4cl0.25；nah2po4·2h2o0.78；kcl0.1；nahco32.5；10ml微量元素，10ml维生素。微量元素组成为(g/l)：氨三乙酸1.5；mgso43.0；mnso4·h2o0.5；nacl1.0；feso4·7h2o0.1；cacl2·2h2o0.1；c℃l2·6h2o0.1；zncl0.13；cuso40.01；alk(so4)2·12h2o0.01；h3bo20.01；na2moo40.025；nicl2·6h2o0.024；na2wo4·2h2o0.025。维生素组成为(mg/l)：生物素2；叶酸2；维生素b25；维生素b15；烟酸5；维生素b55；维生素b120.1；对氨基苯甲酸5。
实施例2：本发明所述微生物菌株的鉴定
根据生工ezup柱式细菌基因组dna抽提试剂盒步骤提取该菌株dna，利用引物：27f：5’-agagtttgatcctggctcag-3’和1492r：5’-ggttaccttgttacgactt-3’扩增该菌株的16srdna基因，将产物与t载体连接，经测序确认该片段实际长度为1443bp。将该序列与genbank中相关数据进行比对，在比对匹配度最高的结果中，该菌株所测得到的16srdna序列部分与人苍白杆菌(ochrobacterumanthropi)的同源性达到99％，可确认该菌株为人苍白杆菌(ochrobacterumanthropi)，命名为xm-1。
根据测得的分离菌株的16srdna基因序列(如seqidno.1所示)，以及genbank中与其比对结果匹配度较高的其他细菌和其他文献中报道的一些(高)氯酸盐还原菌的16srdna基因序列，使用mega6软件，根据邻接法做出分离菌株的系统发育树，如图1所示。由图1可知，目前已知的绝大多数(高)氯酸盐还原菌属于变形菌门，主要分布在β变形菌纲和α变形菌纲，本发明分离出的这株细菌属于α变形菌纲下面的苍白杆菌属，目前没有苍白杆菌属中其他细菌被报道具备还原氯酸盐的能力。
实施例3：利用菌株xm-1还原氯酸盐的方法
挑选该菌株单克隆入3ml的lb培养基中，于摇床(30℃，200rpm)中培养12h。取出定量(1ml，od600为2.472)的细菌转入100ml的lb培养基中，放入摇床(30℃，200rpm)中培养12h。将培养好的100ml的lb中的细菌离心(6000g，5min)，去除上清液收集菌体；使用无机盐培养基洗涤一次，离心(6000g，5min)，去除上清液收集菌体；使用无机盐培养基重悬细菌，将其注入到含有50ml无机盐培养基的血清瓶中(控制细菌初始od600约为0.1)，naclo3作电子受体，葡萄糖作电子供体，放入摇床(30℃，200rpm)中共培养240h，并定时取样。
使用分光光度计测定样品od600描绘其生长曲线，使用离子色谱仪器测定培养基中氯酸盐浓度，结果如图2、表1所示。在培养的120h内，该菌株可以利用葡萄糖和naclo3进行呼吸作用，实现细菌的增长，该菌株可以将培养基中所有的氯酸钠全部转化为氯离子。
表1
实施例4：菌株xm-1在不同ph条件下的生长情况及还原氯酸盐的情况
将分离得到的纯培养菌株挑选单克隆入3ml的lb培养基中，于摇床(30℃，200rpm)中培养12h。取出定量的细菌转入100ml的lb培养基中，放入摇床(30℃，200rpm)中培养12h。将培养好的100ml的lb中的细菌离心(6000g，5min)，去除上清液收集菌体；使用无机盐培养基洗涤一次，离心(6000g，5min)，去除上清液收集菌体；使用无机盐培养基重悬细菌，将其分别注入到含有50mlph为4.0、4.5、5.0、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、9.0的无机盐培养基中(控制细菌初始od600约为0.1)。无机盐培养基以naclo3(10mm)作电子受体，葡萄糖(10mm)作电子供体，将原培养基中碳酸氢盐-磷酸二氢盐的缓冲盐换成100mm的磷酸盐缓冲盐，分别调节ph为4.0、4.5、5.0、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、9.0。
定时取样，测定细菌的生长曲线与氯酸盐还原曲线。如图3、表2～3所示，该菌可以在ph4.5～8.0的条件下进行生长。如图4、表4所示，在ph4.5～8.0的条件下，细菌的比生长速率均保持在较高水平，生长迅速。如图5、表5～6所示，除在ph为4.5的条件下，该菌仅还原74％的氯酸盐，在ph为5.0～8.0的条件下，该菌均能100％还原氯酸盐。
表2
表3
表4
表5
表6
实施例5：菌株xm-1在不同浓度氯酸盐环境中的生长情况及还原氯酸盐的情况
将分离得到的纯培养菌株挑选单克隆入3ml的lb培养基中，于摇床(30℃，200rpm)中培养12h。取出定量的细菌转入100ml的lb培养基中，放入摇床(30℃，200rpm)中培养12h。将培养好的100ml的lb中的细菌离心(6000g，5min)，去除上清液收集菌体；使用无机盐培养基洗涤一次，离心(6000g，5min)，去除上清液收集菌体；使用无机盐培养基重悬细菌，将其分别注入到含有50ml的不同氯酸盐浓度的无机盐培养基中(控制细菌初始od600约为0.1)。无机盐培养基以葡萄糖(10mm)作电子供体。
定时取样，测定细菌的生长曲线与氯酸盐还原曲线。如图6、表7所示，该菌最高可耐受naclo3浓度为132mm。如图7、表8所示，在120h内，可对初始浓度为9mm、19mm、24mm、48mm的氯酸盐分别实现100％、100％、88％、47％、48％的降解率。
表7
表8
对比例
培养条件同实施例4。
不同ph值条件下细菌的最大生长速率如表9所示：
表9
相同ph值条件下，对比例的菌株与本发明提供的菌株的最大生长速率具有极显著差异(p＜0.01)，表明本发明提供的菌株对ph值的耐受力极显著优于对比例的菌株。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
序列表
<110>中国科学技术大学
<120>菌株及其应用
<130>mp1800943
<160>1
<170>siposequencelisting1.0
<210>1
<211>1443
<212>dna
<213>人苍白杆菌(ochrobactrumanthropic)
<400>1
gagtttgatcctggctcagaacgaacgctggcggcaggcttaacacatgcaagtcgagcg60
ccccgcaaggggagcggcagacgggtgagtaacgcgtgggaacgtaccttttgctacgga120
ataactcagggaaacttgtgctaataccgtatgtgcccttcgggggaaagatttatcggc180
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acc1443