本发明涉及一种促进枯草芽孢杆菌乙酰氨基葡萄糖合成的方法，属于遗传工程领域。
背景技术：
在人体中，乙酰氨基葡萄糖是糖胺聚糖二糖单元的合成前体，其对修复和维持软骨及关节组织功能具有重要作用。因此，乙酰氨基葡萄糖被广泛添加在药物和营养膳食中来治疗和修复关节损伤。此外，乙酰氨基葡萄糖在化妆品和制药领域也具有诸多应用。目前，乙酰氨基葡萄糖主要采用酸解虾壳或蟹壳中甲壳素生产，然而，此方法产生的废液对环境污染较为严重，而且得到的产品易引起过敏反应，不适宜海鲜过敏的人群服用。
枯草芽孢杆菌(bacillussubtilis)是一种被广泛用作食品酶制剂及重要营养化学品的生产宿主，其产品被fda认证为gras(generallyregardedassafe)安全级别。枯草芽孢杆菌发酵生产乙酰氨基葡萄糖反应式为：
5/2glucose+atp+5nad++2nh3→glcnac+glutamate+adp+5nadh+2co2+phosphate
该方程是通过计算从头合成乙酰氨基葡萄糖的3个前体6磷酸果糖、乙酰辅酶a和谷氨酰胺得到，从方程中可以看出在乙酰氨基葡萄糖合成的过程中伴随着大量的nadh的产生。过量生成的nadh对n-乙酰氨基葡萄糖途径最大理论得率(yc)产生巨大的消极影响。因为细胞要维持还原力平衡，过量产生的nadh将通过两种方式消耗，一个参与其他代谢的合成(导致副产物的产生)，另外一方面被氧化产生atp(导致发酵过程需要消耗大量o2，同时也会造成菌体量大量生成)。此外，利用枯草芽孢杆菌合成乙酰氨基葡萄糖时会伴随着代谢溢流，导致副产物乙偶姻的大量合成。因此，如何有效处理在伴随乙酰氨基葡萄糖生成的nadh及乙酰氨基葡萄糖合成效率，同时避免中心碳代谢溢流，提碳原子经济性，是微生物发酵法生产乙酰氨基葡萄糖产量的亟待解决问题。
技术实现要素：
为解决上述技术问题，本发明提供了一种消除枯草芽孢杆菌中心碳代谢溢流、平衡胞内还原力促进乙酰氨基葡萄糖合成的方法，该构建方法是外源引入来源于蜡样芽孢杆菌的丙酮酸羧化酶balpyca，消除枯草芽孢杆菌中心碳代谢溢流，避免副产物乙偶姻的合成。进一步引入5个外源还原力代谢反应替换糖酵解途径、三羧酸循环中产生nadh的反应，重构胞内还原力代谢，具体包括甘油醛-3-磷酸铁氧还蛋白脱氢酶、异柠檬酸nad+脱氢酶、苹果酸醌脱氢酶、酮酸铁氧还蛋白氧化还原酶和固氮酶铁蛋白。操作简单，便于使用，且所构建的重组枯草芽孢杆菌完全避免中心碳代谢以溢流、平衡胞内还原力nadh代谢。
本发明的第一个目的是提供一种枯草芽孢杆菌重组菌，所述重组菌整合表达了丙酮酸羧化酶balpyca、甘油醛-3-磷酸铁氧还蛋白脱氢酶gapn、异柠檬酸nad+脱氢酶icd、苹果酸醌脱氢酶mqo、丙酮酸铁氧还蛋白氧化还原酶porab和固氮酶铁蛋白cyh。
在本发明的一种实施方式中，所述重组菌是以枯草芽孢杆菌bsgnkap2作为出发菌株，所述枯草芽孢杆菌bsgnkap2如专利申请号为cn201610517961.9的专利申请所述。
在本发明的一种实施方式中，所述丙酮酸羧化酶balpyca来源于蜡样芽胞杆菌，所述丙酮酸羧化酶balpyca编码基因balpyca，如ncbi-proteinid:aas42897所示。
在本发明的一种实施方式中，外源引入来源于蜡样芽孢杆菌的丙酮酸羧化酶balpyca，消除枯草芽孢杆菌中心碳代谢溢流，避免副产物乙偶姻的合成。
在本发明的一种实施方式中，所述丙酮酸羧化酶balpyca编码基因balpyca使用强组成型启动子p43表达。
在本发明的一种实施方式中，所述丙酮酸羧化酶balpyca编码基因balpyca整合至枯草芽孢杆菌基因组mals位点。
在本发明的一种实施方式中，所述甘油醛-3-磷酸铁氧还蛋白脱氢酶编码基因gor如ncbi-proteinid:caf30501所示；异柠檬酸nad+脱氢酶编码基因icd如ncbi-proteinid:akc61181所示；苹果酸醌脱氢酶编码基因mqo如ncbi-proteinid:adk05552所示；丙酮酸铁氧还蛋白氧化还原酶编码基因porab如ncbi-proteinid:adk06337和ncbi-proteinid:adk06336所示；固氮酶铁蛋白编码基因cyh如ncbi-proteinid:acv00712所示。
在本发明的一种实施方式中，用甘油醛-3-磷酸铁氧还蛋白脱氢酶、异柠檬酸nad+脱氢酶、苹果酸醌脱氢酶、丙酮酸铁氧还蛋白氧化还原酶和固氮酶铁蛋白替换糖酵解途径、三羧酸循环中产生nadh的反应。
在本发明的一种实施方式中，所述甘油醛-3-磷酸铁氧还蛋白脱氢酶编码基因gapn、异柠檬酸nad+脱氢酶编码基因icd、苹果酸醌脱氢酶编码基因mqo、丙酮酸铁氧还蛋白氧化还原酶编码基因porab和固氮酶铁蛋白编码基因cyh分别使用强组成型启动子p43表达。
在本发明的一种实施方式中，所述甘油醛-3-磷酸铁氧还蛋白脱氢酶编码基因gapn、异柠檬酸nad+脱氢酶编码基因icd、苹果酸醌脱氢酶编码基因mqo、丙酮酸铁氧还蛋白氧化还原酶编码基因porab和固氮酶铁蛋白编码基因cyh依次整合至枯草芽孢杆菌基因组pyk、ywka、kdga、mela和pcka位点。
本发明第二个目的是提供了一种所述重组菌的构建方法，包括以下步骤：
(1)构建蜡样芽孢杆菌的丙酮酸羧化酶balpyca编码基因balpyca、甘油醛-3-磷酸铁氧还蛋白脱氢酶编码基因gor、异柠檬酸nad+脱氢酶编码基因icd、苹果酸醌脱氢酶编码基因mqo、丙酮酸铁氧还蛋白氧化还原酶编码基因porab和固氮酶铁蛋白编码基因cyh的同源重组整合框；
(2)经同源重组，用步骤(1)中得到的整合框整合至枯草芽孢杆菌基因组中。
在本发明的一种实施方式中，在步骤(1)中，用整合位点上游序列1000bp、博来霉素抗性基因zeo序列、强组成型启动子p43、目的基因序列以及上游序列1000bp，构建整合框。
在本发明的一种实施方式中，蜡样芽孢杆菌的丙酮酸羧化酶balpyca编码基因balpyca来自bacilluscereus，通过基因合成获得。
在本发明的一种实施方式中，甘油醛-3-磷酸铁氧还蛋白脱氢酶编码基因gor来自methanococcusmaripaludiska1，通过基因合成获得，并进行密码子优化。
在本发明的一种实施方式中，异柠檬酸nad+脱氢酶编码基因icd来自clostridiumsporogenes，通过基因合成获得，并进行密码子优化。
在本发明的一种实施方式中，苹果酸醌脱氢酶编码基因mqo来自bacilluscereus，通过基因合成获得。
在本发明的一种实施方式中，丙酮酸铁氧还蛋白氧化还原酶编码基因porab来自bacilluscereus，通过基因合成获得，并进行密码子优化。
在本发明的一种实施方式中，固氮酶铁蛋白编码基因cyh来自cyanothecesp.pcc8802，通过基因合成获得，并进行密码子优化。
在本发明的一种实施方式中，蜡样芽孢杆菌的丙酮酸羧化酶balpyca编码基因balpyca整合至枯草芽孢杆菌基因组mals位点。
在本发明的一种实施方式中，甘油醛-3-磷酸铁氧还蛋白脱氢酶编码基因gor整合于枯草芽孢杆菌基因组pyk位点。
在本发明的一种实施方式中，异柠檬酸nad+脱氢酶编码基因icd整合至枯草芽孢杆菌基因组ywka位点。
在本发明的一种实施方式中，苹果酸醌脱氢酶编码基因mqo整合至枯草芽孢杆菌基因组kdga位点。
在本发明的一种实施方式中，丙酮酸铁氧还蛋白氧化还原酶编码基因porab整合至枯草芽孢杆菌基因组mela位点。
在本发明的一种实施方式中，固氮酶铁蛋白编码基因cyh整合至枯草芽孢杆菌基因组pcka位点。
本发明还提供了一种所述重组菌制备乙酰氨基葡萄糖的方法，包括以下步骤：将所述重组菌在种子培养基中活化，然后将活化后的种子转入发酵培养基，加入诱导剂进行发酵培养，得到乙酰氨基葡萄糖。
在本发明的一种实施方式中，种子在35～38℃下在种子培养基中活化，活化后的种子在35～38℃下发酵培养。
在本发明的一种实施方式中，种子培养基包括以下成分：蛋白胨、酵母粉和氯化钠。
在本发明的一种实施方式中，种子培养基以其重量为基准，包括以下成分：5～15g/l蛋白胨、5～10g/l酵母粉和5～15g/l氯化钠。
在本发明的一种实施方式中，发酵培养基包括以下成分：葡萄糖、蛋白胨、酵母粉、硫酸铵、磷酸氢二钾、磷酸二氢钾、碳酸钙和微量元素溶液。
在本发明的一种实施方式中，发酵培养基以其重量为基准，包括以下成分：15～25g/l葡萄糖、5～8g/l蛋白胨、10～15g/l酵母粉、5～8g/l硫酸铵、10～15g/l磷酸氢二钾、2～3g/l磷酸二氢钾、4～6g/l碳酸钙和8～12ml/l微量元素溶液。
在本发明的一种实施方式中，微量元素溶液包括：硫酸锰、氯化钴、钼酸钠、硫酸锌、氯化铝、氯化铜、硼酸和盐酸。
在本发明的一种实施方式中，微量元素溶液以其重量为基准，包括以下成分：0.8～1.2g/l硫酸锰、0.2～0.6g/l氯化钴、0.1～0.3g/l钼酸钠、0.1～0.3g/l硫酸锌、0.1～0.3g/l氯化铝、0.1～0.3g/l氯化铜、0.04～0.06g/l硼酸和3～8mol/l盐酸。
在本发明的一种实施方式中，活化后的种子以5～15％的接种量转入发酵培养基中进行培养。
在本发明的一种实施方式中，诱导剂为木糖，每升发酵培养基的木糖用量为5～10g。
与现有技术相比，本发明具有以下优点：
本发明提供了一种消除枯草芽孢杆菌中心碳代谢溢流、平衡胞内还原力促进乙酰氨基葡萄糖合成的方法，bsgnkap8是通过外源引入来源于蜡样芽孢杆菌的丙酮酸羧化酶balpyca，消除枯草芽孢杆菌中心碳代谢溢流，避免副产物乙偶姻的合成。进一步引入5个外源还原力代谢反应替换糖酵解途径、三羧酸循环中产生nadh的反应，重构胞内还原力代谢，具体包括甘油醛-3-磷酸铁氧还蛋白脱氢酶、异柠檬酸nad+脱氢酶、苹果酸醌脱氢酶、酮酸铁氧还蛋白氧化还原酶和固氮酶铁蛋白获得。与出发菌株bsgnkap2相比，避免了中心碳代谢溢流，消除副产物乙偶姻的合成；同时在生成乙酰氨基葡萄糖的过程中，胞内的nadh有效的减少，同时促进了乙酰氨基葡萄糖的合成。在使用复合培养基摇瓶发酵过程中，重组菌株bsgnkap8乙酰氨基葡萄糖的产量为24.50g/l，乙酰氨基葡萄糖/葡萄糖得率为0.469g/g，分别是出发菌株bsgnkap2的1.97和2.13倍。本发明的重组枯草芽孢杆菌构建方法简单，便于使用，具有很好地应用前景。
附图说明
图1为枯草芽孢杆菌发酵生产乙酰氨基葡萄糖高效液相(hplc)示差检测色谱图，(a)bsgnkap2发酵液hplc检测结果，(b)bsgnkap3发酵液hplc检测结果；
图2为枯草芽孢工程菌株胞内nadh水平。
具体实施方式
下面结合具体实施例，对本发明的技术方案作进一步详细描述。以下实施例仅用于说明本发明，而不是对本发明的保护范围的限制。
实施例1：构建枯草芽孢杆菌bsgnkap3
枯草芽孢杆菌bsgnkap2为b.subtilis168δnagpδgampδgamaδnagaδnagbδldhδptaδglckδpckaδpykp43-glmsp43-pyca::lox72，以pp43nmk-gna1质粒游离表达gna1基因。然后在此基础上于枯草芽孢杆菌基因组mals位点整合蜡样芽孢杆菌的丙酮酸羧化酶balpyca(ncbi-proteinid:aas42897)编码基因balpyca，通过博来霉素抗性平板筛选、菌落pcr验证、测序，确认整合成功得到重组枯草芽孢杆菌bsgnkap3。
实施例2：构建枯草芽孢杆菌bsgnkap4
枯草芽孢杆菌bsgnkap3为宿主，以pp43nmk-gna1质粒游离表达gna1基因，然后在此基础上于枯草芽孢杆菌基因组pyk位点整合甘油醛-3-磷酸铁氧还蛋白脱氢酶(ncbi-proteinid:caf30501)编码基因gor，通过博来霉素抗性平板筛选、菌落pcr验证、测序，确认整合成功得到重组枯草芽孢杆菌bsgnkap4。
实施例3：构建重组枯草芽孢杆菌bsgnkap5
以bsgnkap4为宿主，以pp43nmk-gna1质粒游离表达gna1基因，然后在此基础上于枯草芽孢杆菌基因组ywka位点整合异柠檬酸nad+脱氢酶(ncbi-proteinid:akc61181)编码基因icd，通过博来霉素抗性平板筛选、菌落pcr验证、测序，确认整合成功得到重组枯草芽孢杆菌bsgnkap5。
实施例4：构建重组枯草芽孢杆菌bsgnkap6
以bsgnkap5为宿主，以pp43nmk-gna1质粒游离表达gna1基因，然后在此基础上于枯草芽孢杆菌基因组苹果酸醌脱氢酶(ncbi-proteinid:adk05552)编码基因mqo整合至枯草芽孢杆菌基因组kdga位点，通过博来霉素抗性平板筛选、菌落pcr验证、测序，确认整合成功得到重组枯草芽孢杆菌bsgnkap6。
实施例5：构建重组枯草芽孢杆菌bsgnkap7
以bsgnkap6为宿主，以pp43nmk-gna1质粒游离表达gna1基因，然后在此基础上于枯草芽孢杆菌基因组mela位点整合丙酮酸铁氧还蛋白氧化还原酶(ncbi-proteinid:adk06337和ncbi-proteinid:adk06336)编码基因porab，通过博来霉素抗性平板筛选、菌落pcr验证、测序，确认整合成功得到重组枯草芽孢杆菌bsgnkap7。
实施例6：构建枯草芽孢杆菌bsgnkap8
以bsgnkap7为宿主，以pp43nmk-gna1质粒游离表达gna1基因，然后在此基础上于枯草芽孢杆菌基因组pcka位点整合固氮酶铁蛋白(ncbi-proteinid:acv00712)编码基因cyh，通过博来霉素抗性平板筛选、菌落pcr验证、测序，确认整合成功得到重组枯草芽孢杆菌bsgnkap8。
实施例7：重组枯草芽孢杆菌发酵生产乙酰氨基葡萄糖
种子培养基的成分包括：10g/l蛋白胨、5g/l酵母粉、和10g/l氯化钠。
发酵培养基的成分包括：20g/l葡萄糖、6g/l蛋白胨、12g/l酵母粉、6g/l硫酸铵、12.5g/l磷酸氢二钾、2.5g/l磷酸二氢钾、5g/l碳酸钙10ml/l微量元素溶液。
其中微量元素溶液以其重量为基准，包括如下成分：1.0g/l硫酸锰、0.4g/l氯化钴、0.2g/l钼酸钠、0.2g/l硫酸锌、0.1g/l氯化铝、0.1g/l氯化铜、0.05g/l硼酸和5mol/l盐酸。
使用高效液相色谱法检测乙酰氨基葡萄糖的含量，高效液相色谱法测试条件：仪器型号agilent1200，rid检测器，柱子：nh2柱(250×4.6mm，5μm)，流动相：70％乙腈，流速0.75ml/min，柱温30℃，进样体积为10μl。
发酵液中葡萄糖浓度的检测：sba生物传感分析仪。
在种子培养基中将重组枯草芽孢杆菌bsgnkap1于37℃、220rpm下培养8h，然后将种子以5％的接种量转入发酵培养基，于500ml摇瓶中37℃、220rpm条件下培养48h。发酵结束时，检测发酵上清液中乙酰氨基葡萄糖的含量。
实施例8：重组枯草芽孢杆菌胞内nadh的检测
胞内nadh的检测检测使用青岛捷世康生物科技有限公司试剂盒。收集对数期菌体于离心管内(104个)，加入碱性提取液体积(ml)为500～1000:1的比例，超声波破碎(冰浴，功率20％或200w，超声3s，间隔10s，重复30次)，95℃水浴5min(盖紧，以防止水分散失)，冰浴中冷却后，10000g4℃离心10min，取500ul上清液加入500ul酸性提取液使之中和，混匀，10000g4℃10min，取上清，置于冰上按试剂盒标准程序检测nadh。
摇瓶发酵结束，bsgnkap8乙酰氨基葡萄糖的产量为24.50g/l，乙酰氨基葡萄糖/葡萄糖得率为0.469g/g，乙酰氨基葡萄糖/葡萄糖得率为0.469g/g，分别是出发菌株bsgnkap2的1.97和2.13倍(结果如表1所示)，实现了乙酰氨基葡萄糖在重组枯草芽孢杆菌胞外产量的提高。此外，乙偶姻得到完全消除(结果如图1所示)，同时bsgnkap3、bsgnkap4、bsgnkap5、bsgnkap6、bsgnkap7和bsgnkap8的胞内nadh水平入图2所示。该策略可以完全避免中心碳代谢溢流，并有效避免胞内还原力nadh的积累，促进乙酰氨基葡萄糖的合成。
表1乙酰氨基葡萄糖及乙酰氨基葡萄糖/葡萄糖比较
虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。