本发明属于天然药物领域，涉及两个化合物及其制备方法和应用，具体涉及两种来源于异叶三宝木的具有新颖化学结构的γ-内酯衍生物类化合物的制备方法及它们在抗肿瘤药物中的应用。
背景技术：
恶性肿瘤是当前直接危及人类生命和健康的一类最常见、最严重的疾病，目前恶性肿瘤已取代心血管疾病成为导致死亡人数最多的一类疾病。随着现代医学和生物学的快速发展人们对肿瘤本质的认识不断深入，恶性肿瘤逐渐被认为是一类全身性疾病，单纯的局部治疗已逐步突显其局限性。作为现代肿瘤治疗的三大支柱手段中的手术治疗和放射治疗均为局部治疗方法，其治疗的重点往往是控制恶性肿瘤的局部生长和扩散，但这些方法均难以彻底根除肿瘤病灶，且对中晚期恶性肿瘤患者的治疗效果更差。而药物治疗是可以发挥全身治疗作用的手段，除了有效的抑制恶性肿瘤的生长外，还可以在一定程度上控制恶性肿瘤的全身扩散和转移，这些优势都使药物治疗在恶性肿瘤治疗中的地位不断提升。
随着肿瘤发生机制的不断被阐明以及抗肿瘤作用靶点的不断被发现，靶向抗肿瘤药物的发现已成为新型抗肿瘤药物开发的重要方向。靶向药物通过与肿瘤发生、肿瘤生长所必需的特定分子靶点的作用来阻止肿瘤细胞的生长。由于其针对特定的作用靶点，因此靶向药物相比于传统化疗药物不仅治疗效果好，而且副作用也小得多。在众多的抗肿瘤药物作用靶点中，以蛋白酪氨酸激酶为靶点的抗肿瘤药物研发已成为国际上的研究热点。酪氨酸激酶通过一个复杂的细胞内网络通路控制细胞增殖、生存、凋亡、血管生成、侵袭和转移，肿瘤组织最初可能对单靶点酪氨酸激酶抑制剂有反应，但可以通过多种机制获得拮抗能力，肿瘤存在这些逃逸机制是多靶点治疗必要性的基础。临床实践同样表明，单靶点酪氨酸激酶抑制剂类抗肿瘤药物，如厄洛替尼和吉非替尼，尽管选择性强、毒副作用小，但在使用过程中易产生耐药性，无法彻底杀灭肿瘤细胞，而联合用药又会带来严重的不良反应，影响各自的药动学特性。相对于单靶点药物和多种单靶点药物联合用药来说，多靶点药物具有更多的优越性。多靶点药物可有效避免产生药物之间的相互作用，减少不良反应，治疗作用更全面等优点。很多多靶点酪氨酸激酶抑制剂类抗肿瘤药物，因其疗效高、毒性小的临床特点，已逐渐成为某些肿瘤治疗的一线用药，如伊马替尼和舒尼替尼等。
大戟科三宝木属(Trigonostemon)植物全世界约有50种，分布于亚洲的热带和亚热带地区，我国有10种，产于海南、云南以及广西等南部省区[中国科学院中国植物志编委会.中国植物志.第44(2)卷.科学出版社.北京:1996,pp162-169.]。三宝木属因富含抗肿瘤活性成分和抗HIV活性成分而受到国内外学者的广泛关注，截至目前已从该属多种植物中分离鉴定了大量并具有显著的生物活性的化合物，如生物碱类、二萜类以及菲类等多种类型化合物[Jayasuriya H,Zink DL,Singh SB,Borris RP,Nanakorn W,Beck HT,Balick MJ,Goetz MA,Slayton L,Gregory L,Zakson-Aiken M.Structure and stereochemistry of rediocide A,a highly modified daphnane from Trigonostemon reidioides exhibiting potent insecticidal activity.J.Am.Chem.Soc.2000,122:4998-4999.；Tan CJ,Di YT,Wang YH,Zhang Y,Si YK,Zhang Q,Gao S,Hu XJ,Fang X,Li SF,Hao XJ.Three new indole alkaloids from Trigonostemon lii.Org.Lett.2010,12:2370-2373.；Dong SH,Liu HB,Xu CH,Ding J,Yue JM.Constituents of Trigonostemon heterophyllus.J.Nat.Prod.2011,74:2576-2581.；Dong SH,Zhang CR,Xu CH,Ding J,Yue JM.Daphnane-type diterpenoids from Trigonostemon howii.J.Nat.Prod.2011,74:1255-1261.；Tang GH,He HP,Gu YC,Di YT,Wang YH,Li SF,Li SL,Zhang Y,Hao XJ.3,4-seco-Diterpenoids from Trigonostemon flavidus.Tetrahedron 2012,68:9679-9684.；Tang GH,Zhang Y,Gu YC,Li SF,Di YT,Wang YH,Yang CX,Zuo GY,Li SL,He HP,Hao XJ.Trigoflavidols A–C,degraded diterpenoids with antimicrobial activity,from Trigonostemon flavidus.J.Nat.Prod.2012,75:996-1000.；Tang GH,Zhang Y,Yuan CM,Li Y,Gu YC,Di YT,Wang YH,Zuo GY,Li SF,Li SL,He HP,Hao XJ.Trigohowilols A–G,degraded diterpenoids from the stems of Trigonostemon howii.J.Nat.Prod.2012,75:1962-1966.；Kaemchantuek P,Chokchaisiri R,Prabpai S,Kongsaeree P,Chunglok W,Utaipan T,Chamulitrate W,Suksamrarn A.Terpenoids with potent antimycobacterial activity against Mycobacterium tuberculosis from Trigonostemon reidioides roots.Tetrahedron 2017,73:1594-1601.]。
异叶三宝木(T.heterophyllus)为大戟科三宝木属植物，为我国特有植物，仅分布于海南岛。截至目前有关异叶三宝木中化学研究及其药理活性的研究报道较为少见，在以前的研究中发现了倍半萜类、二萜类、木脂素类、酚酸类以及菲类衍生物类多种类型的化学成分[Dong SH,Liu HB,Xu CH,Ding J,Yue JM.Constituents of Trigonostemon heterophyllus.J.Nat.Prod.2011,74:2576–2581.；Tang GH,He HP,Gu YC,Di YT,Wang YH,Li SF,Li SL,Zhang Y,Hao XJ.3,4-seco-Diterpenoids from Trigonostemon flavidus.Tetrahedron 2012,68:9679–9684.；Tang GH,Zhang Y,Gu YC,Li SF,Di YT,Wang YH,Yang CX,Zuo GY,Li SL,He HP,Hao XJ.Trigoflavidols A–C,degraded diterpenoids with antimicrobial activity,from Trigonostemon flavidus.J.Nat.Prod.2012,75:996–1000.；Li YX,Mei WL,Zuo WJ,Zhao YX,Dong WH,Dai HF.Two new compounds from Trigonostemon heterophyllus.Phytochem.Lett.2012,5:41–44.；Li YX,Zuo WJ,Li XN,Mei WL,Dai HF.Anew lignan glycoside from Trigonostemon heterophyllus.J.Asian Nat.Prod.Res.2014,16:549–553.；Wang QY,Cui GX,Wu JC,Chen YG.Steroids from Trigonostemon heterophyllus.Chem.Nat.Compd.2015,51:1196–1198.；Li YX,Zuo WJ,Mei WL,Chen HQ,Dai HF.Anew diterpene from the stems of Trigonostemon heterophyllus.Zhongguo Tianran Yaowu 2014,12:297–299.；Li YX,Zuo WJ,Wang H,Mei WL,Liu S,Dai HF.Chemical constituents from twigs of Trigonostemon heterophyllus.Zhongguo Yaowu Huaxue Zazhi 2012,22:120–123.；Tang GH,Zhang Y,He HP,Hao XJ.Chemical constituents from leaves of Trigonostemon flavidus.Tianran Chanwu Yanjiu Yu Kaifa 2013,25:912–915.]。
技术实现要素：
本发明的目的是提供从异叶三宝木枝叶中分离得到的具有新颖化学结构的γ-内酯衍生物类化合物trigoheterophine A(1)和trigoheterophine B(2)。这两种化合物具有显著地体外抗肿瘤活性，可以进一步开发成以蛋白酪氨酸激酶为靶标的靶向抗肿瘤药物。
为了实现上述目的，本发明的技术方案为：提供γ-内酯衍生物类化合物trigoheterophine A(1)和trigoheterophine B(2)，其化学结构分别如下：
本发明的另一目的是提供从异叶三宝木枝叶分离纯化化合物trigoheterophine A(1)和trigoheterophine B(2)的制备方法，包括以下步骤：
A.将异叶三宝木枝叶用甲醇或85％乙醇溶液提取三次，过滤，收集滤液，再减压浓缩干燥，获得醇提取物；
B.将醇提取物加水制成混悬液，依次用石油醚和乙酸乙酯进行萃取，石油醚萃取液经减压浓缩，得石油醚萃取浸膏；
C.将石油醚萃取浸膏进行柱色谱分离纯化，得到单体化合物trigoheterophine A(1)和trigoheterophine B(2)。
进一步地，所述步骤C包括：①将石油醚萃取浸膏用硅胶柱层析划段，分别按体积比90:10，80:20，70:30，50:50进行石油醚-乙酸乙酯梯度洗脱，收集体积比为70:30的石油醚-乙酸乙酯洗脱物；②取石油醚-乙酸乙酯(体积比70:30)洗脱物经MCI树脂柱层析去除色素，分别按体积比50:50，70:30，90:10用甲醇-水梯度洗脱，收集体积比为70:30的甲醇-水洗脱物；③取甲醇-水(体积比70:30)洗脱物进行反相硅胶柱层析，分别按体积比65:35，70:30，75:25用甲醇-水梯度洗脱，收集体积比为70:30的甲醇-水洗脱物浓缩；④取甲醇-水(体积比70:30)洗脱物用制备型高效液相色谱分离，流动相为乙腈-水，体积比为60:40，得到化合物trigoheterophine A(1)和trigoheterophine B(2)。
本发明的再一目的在于提供trigoheterophine A(1)和trigoheterophine B(2)在制备抗肿瘤药物中的应用，尤其是提供trigoheterophine A(1)和trigoheterophine B(2)在制备以蛋白酪氨酸激酶为靶标的靶向抗肿瘤药物方面的应用。
进一步地，所述肿瘤细胞株包括HL-60(人原髓细胞白血病细胞)、A549(人肺癌细胞)、SMMC-7721(人肝癌细胞)、MCF-7(人乳腺癌细胞)和SW480(人结肠癌细胞)等5种肿瘤细胞株。
本发明首次从异叶三宝木枝叶的醇提取物的石油醚萃取部位中分离鉴定了两个化学结构新颖的γ-内酯衍生物类化合物trigoheterophine A(1)和trigoheterophine B(2)。多种体外活性评价结果表明：该化合物具有显著地体外抗肿瘤活性，可以进一步开发成以蛋白酪氨酸激酶为靶标的靶向抗肿瘤药物。
具体实施方式
下面结合实施例，对本发明的具体实施方式作进一步详细描述。以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规实验条件。
实施例一：化合物trigoheterophine A(1)和trigoheterophine B(2)的制备方法(一)
异叶三宝木枝叶的干燥粉末(26.2kg，海南)用85％乙醇溶液冷浸提取三次，每次提取一周，过滤，收集滤液，减压浓缩得乙醇提取物2568.2g；将该醇提取物加水制成混悬液，依次用石油醚和乙酸乙酯萃取，乙酸乙酯萃取液经减压浓缩，得石油醚萃取物531.8g；将石油醚萃取物530.0g进行柱色谱分离纯化：将石油醚萃取浸膏用硅胶柱层析分段，石油醚-乙酸乙酯梯度洗脱(90:10，80:20，70:30，50:50)，收集石油醚-乙酸乙酯(体积比70:30)洗脱物，取石油醚-乙酸乙酯(体积比70:30)洗脱物MCI树脂柱层析去除色素，用甲醇-水梯度洗脱(体积比50:50，70:30，90:10)，收集甲醇-水(体积比70:30)洗脱物，取甲醇-水(体积比70:30)洗脱物进行反相硅胶柱层析，用甲醇-水梯度洗脱(体积比65:35，70:30，75:25)，收集甲醇-水(体积比70:30)洗脱物浓缩，取甲醇-水(体积比70:30)洗脱物用制备型高效液相色谱分离，流动相为乙腈-水(体积比60:40)得到纯的化合物trigoheterophine A(1)(103.2mg)和trigoheterophine B(2)(86.3mg)。
结构确证：通过旋光光谱、紫外光谱、红外光谱、核磁共振谱和质谱等多种现代波谱技术的综合解析，确定了化合物trigoheterophine A(1)和trigoheterophine B(2)的化学结构。
Trigoheterophine A(1)，无色油状物；IR(KBr)vmax3453,1756,1678,1608,1462,1380,1191,1075,1026,976和718cm–1；UV(CH3OH)λmax(logε)232(3.32)nm；1H NMR(400MHz,CDCl3)和13C NMR(100MHz,CDCl3)数据见表1；ESIMS m/z 365[M+H]+；HR-ESIMS m/z 365.2688([M+H]+；calcd for C22H37O4,365.2686)。
Trigoheterophine B(2)，无色油状物；IR(KBr)vmax3448,1758,1673,1612,1463,1382,1189,1078,1029,978和716cm–1；UV(CH3OH)λmax(logε)236(3.68)nm；1H NMR(400MHz,CDCl3)和13C NMR(100MHz,CDCl3)数据见表1；ESIMS m/z 363[M+H]+；HR-ESIMS m/z 363.2532([M+H]+；calcd for C22H35O4,363.2530)。
表1化合物trigoheterophine A(1)和trigoheterophine B(2)的1H and 13C NMR数据
aMeasured at 400MHz in CDCl3.
bMeasured at 100MHz in CDCl3.
实施例二：化合物trigoheterophine A(1)和trigoheterophine B(2)的制备方法(二)
异叶三宝木枝叶的干燥粉末(12.8kg，海南)用甲醇冷浸提取三次，每次一周，过滤，收集滤液，减压浓缩得甲醇提取物(1286.3g)。将甲醇提取物加水制成混悬液，依次用石油醚和乙酸乙酯萃取，石油醚萃取液减压浓缩，得石油醚萃取物268.8g；将石油醚萃取物268.0g进行柱色谱分离纯化：将石油醚部位浸膏用硅胶柱层析分段，石油醚-乙酸乙酯梯度洗脱(90:10，80:20，70:30，50:50)，收集石油醚-乙酸乙酯(体积比70:30)洗脱物，取石油醚-乙酸乙酯(体积比70:30)洗脱物MCI树脂柱层析去除色素，用甲醇-水梯度洗脱(体积比50:50，70:30，90:10)，收集甲醇-水(体积比70:30)洗脱物，取甲醇-水(体积比70:30)洗脱物进行反相硅胶柱层析，用甲醇-水梯度洗脱(体积比65:35，70:30，75:25)，收集甲醇-水(体积比70:30)洗脱物浓缩，取甲醇-水(体积比70:30)洗脱物用制备型高效液相色谱分离，流动相为乙腈-水(体积比60:40)得到化合物III(57.2mg)和化合物VI(48.3mg)。
化合物III的结构确证：无色油状物；HR-ESIMS显示化合物III的[M+H]+为365.2686；化合物III与实施例一中制备方法得到的化合物trigoheterophine A(1)共TLC，在三种展开体系下[石油醚-丙酮(7:3)、石油醚-乙酸乙酯(5:5)和氯仿-丙酮(8:2)]均为均一斑点，说明该化合物与化合物trigoheterophine A(1)为同一化合物。
化合物VI的结构确证：无色油状物；HR-ESIMS显示化合物VI的[M+H]+为m/z 363.2531；化合物VI与实施例一中制备方法得到的化合物trigoheterophine B(2)共TLC，在三种展开体系下[石油醚-丙酮(7:3)、石油醚-乙酸乙酯(5:5)和氯仿-丙酮(8:2)]均为均一斑点，说明该化合物与化合物trigoheterophine B(2)为同一化合物。
实施例三：化合物trigoheterophine A(1)和trigoheterophine B(2)的抗肿瘤活性研究
1、实验方法：将五种常见肿瘤细胞株HL-60、A549、SMMC-7721、MCF-7和SW480分别用含10％小牛血清的RPMI-1640培养基，在37℃、5％CO2培养箱中培养。采用MTT法进行细胞增殖抑制试验，主要操作为：取对数生长期的肿瘤细胞株，用0.25％的胰蛋白酶消化，10％新生小牛血清的RPMI-1640培养液调制成5×104个/mL的细胞悬液，接种于96孔板中，每孔接种180μL。在37℃,5％CO2饱和湿度条件下培养8-10h，待其贴壁，每个孔加入用PBS配制的样品液，使得样品终浓度分别为0.1,1,和10μg/mL。每个浓度平行3孔，继续培养44h后，每孔加入50μL MTT(1mg/mL-1，PBS配制)，在37℃,5％CO2条件下继续温育4h，吸弃孔内培养上清液，每孔加入150μL DMSO，在微型振荡器上摇匀15min，结晶溶解后，在酶联免疫检测仪上选择570nm，测定各孔的吸光值，同时设置空白组(仅加入含细胞的培养液)和对照组(以培养液替代药物)，计算细胞增殖抑制率。抑制率(％)＝(1-实验组3孔OD值平均值/对照组3孔OD值平均值)×100％。以抑制率作纵坐标，作回归曲线，计算出样品IC50值。采用SPSS13.0统计软件包进行数据处理及统计分析。
2、抗肿瘤活性实验结果(见表2)
由实施例一得到的化合物trigoheterophine A(1)和trigoheterophine B(2)对所选肿瘤细胞株HL-60、A549、SMMC-7721、MCF-7和SW480均显示不同程度的增殖抑制活性。
表2化合物trigoheterophine A(1)和trigoheterophine B(2)的抗肿瘤活性评价结果
实施例四：化合物trigoheterophine A(1)和trigoheterophine B(2)的抑制蛋白酪氨酸激酶活性
大鼠脑组织中PTKs的提取：将大鼠大脑取出，剔除脑膜，称重，加入4倍量的冷匀浆液。冰浴中用玻璃匀浆器高速匀浆，离心，收集上清液，再离心10min。收集上清液，上清液中含有胞浆型酪氨酸激酶，而沉淀可作为受体型酪氨酸激酶使用。留取少量上清液用于提取物中蛋白质的含量测定，其余分装，置于-70℃保存备用。
酶标板包被：将底物稀释液加入96孔酶标板中(每孔125μL)，37℃孵育过夜。移除板中过量底物液，加入磷酸盐缓冲液(PBS-Tween 20)洗涤，于37℃干燥2h。4℃保存备用。
PTK抑制剂筛选：先将样品加入酶标板中，37℃孵育，加入用激酶缓冲液稀释的ATP，37℃孵育，移除板中的反应液，洗涤；加入抗体复合物，37℃孵育；移除板中抗体复合物，洗涤，加入四甲基联苯胺(TMB)显色液，室温避光反应，加入终止液，于450nm波长处测定吸光度(A)值。阳性对照药为伊马替尼。按下述公式计算化合物trigoheterophine A(1)和trigoheterophine B(2)的抑制率：抑制率％＝(A正常-A样品)/(A正常-A空白)*100％
结果表明，化合物trigoheterophine A(1)和trigoheterophine B(2)对蛋白酪氨酸激酶均具有显著的抑制作用(抑制率分别为78.26％和75.28％)，抑制活性和阳性对照药伊马替尼的抑制活性相当(抑制率71.86％)。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明技术原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。