一种以白介素15为活性成分的融合蛋白型药物前体的制作方法

本发明属于医药生物领域，具体而言，涉及一种以白介素15为活性成分的融合蛋白型药物前体。

背景技术：

白介素15：1994年,grabstein等研究者在检测猴肾表皮细胞系cv-1/ebva上清液中发现了一种能维持ctll-2细胞增殖的可溶性细胞因子,命名为il15，即白细胞介素15(interleukin-15，il15)^[1]。il-15与il-2相似，属于4个螺旋细胞因子家族。人il15的基因定位于5号染色体q25-35。il15是一种分子量14～15ka的糖蛋白,成熟蛋白由112个氨基酸组成,含有3个可能的n连接糖基化位点。il15的表达受到严格调控。il15的mrna在很多组织和细胞中都可以检测到表达，如纤维组织，肌肉细胞，肾脏细胞，淋巴细胞，肥大细胞，肿瘤细胞等，但成熟的il15蛋白则主要表达于dc细胞，单核细胞，巨噬细胞和基质细胞中，t细胞不表达。gm-csf(granulocyte-macrophagecolony-stimulatingfactor，gm-csf),interfereons,和tlr可促进il15的表达。

白介素15受体(il15r)：il15r属于造血因子超家族,由α、β(又称cd122)、γ(又称cd132，commongammachain，γc)3个亚基构成。il2和il15共用β链受体。il2，il4，il7，il9，il15以及il21共用γ链受体。il2和il15的受体共用β和γc链，但il2和il15均有其各自特异性α受体链。人il15rα属于i型跨膜蛋白，il2rα和il15rα都有一个保守的蛋白结合基序(sushidomain)。il2r有三种不同的复合体：单独il2rα与il2的亲和较低，且不能传递信号；il2rβγ异源二聚体以中等亲和力结合il2并可介导信号传递；il2rαβγ异源三聚体以高亲和力结合il2并介导信号传递。il15与il15rα亲和力比较高(kd～10^-11m)，但不传递信号。il15与il15βγ异源二聚体的亲和力比较中等(kd～10^-9m)，可传导信号；il15与il15αβγ异源三聚体亲和力与前者相似(kd～10^-9m)，可传导信号。由于il2和il15的受体共用β和γ链，因此，il2和il15之间有许多相似的生物学功能，如都能促进t细胞，nk细胞增殖^[3]。

il15与受体的结合：il15rα主要表达于dc和单核细胞。在大多数情况下,il15/il15rα以trans-presented的形式与受体结合。即il-15和il-15ra在相同细胞中表达后，在胞内il-15与il-15rα的sushi结构域以高亲和力结合后转运至膜表面，然后与其反应性细胞(如t细胞或nk细胞)膜表面的βγ异源二聚体复合物或αβγ异源三聚体复合物结合，β和γ受体可分别活化下游jak1和jak3，导致stat-3和stat-5活化，激活级联反应，诱导特异性基因表达。il15以自分泌的形式作用于效应细胞时，可以cis形式与il15受体作用，活化下游信号产生效应功能。

il-15的免疫功能：il15是一个多效性的细胞因子，可维持和活化天然免疫和适应性免疫反应。包括：

(1)促进cd8+t细胞活化，增殖，活化以及存活；

(2)对记忆性t细胞的活化和维持及其重要；

(3)对nk细胞和nkt发育至关重要，此外和促进nk和nkt细胞活化和增殖；

(4)促进抗肿瘤抗体的产生；

(5)通过自分泌的形式促进dc活化，增殖和分化，促进mhcii和cd80/cd86的表达，促进dc诱导cd8+t反应的能力。

(6)活化巨噬细胞和单核细胞；

(7)还可抑制il-2诱导的活化诱导的细胞死亡(aicd)，保护t细胞免遭treg的抑制，打破对肿瘤相关抗原的免疫耐受。

il-15在肿瘤治疗中的应用：虽然il-2已被fda批准用于治疗特异肿瘤，但该细胞因子治疗策略仍然存在一些不足，譬如il-2在活化效应t细胞的同时也大量扩增treg细胞，此外il-2会诱导aicd，这些都限制了il-2的治疗效果。研究发现il-15与il-2有许多相似的生物学功能，并且il-15几乎不诱导treg，也会抑制aicd。研究者认为il-15在肿瘤治疗中具有更好的应用前景。基于il-15是以trans-presented形式与其受体结合，有研究者将il-15蛋白与il-15rα-fc蛋白体外按照比例将它们混合，发现该复合物与il-15相比具有更长的半衰期，且扩增t细胞和nk细胞的能力显著提高^[3]。研究者将il-15与il-15rα的sushi结构域融合成融合蛋白，即为il15-il15rαsushi-fc(又称superil-15)，该融合蛋白也可显著提高il15的半衰期，且扩增t细胞和nk细胞的能力提高了100多倍。在小鼠黑色素瘤(b16f10模型)和化学诱导的肝癌模型中,该融合蛋白可显著抑制肿瘤生长和降低肿瘤的迁移^[4]。此外,il15可与化疗，或免疫激活性抗体(如anti-cd40mab),或肿瘤疫苗，或tlr激动剂，或过继t细胞转移，或免疫检查点的阻断抗体如anti-ctla4，anti-pd1/pdl1联合，具有明显的协同作用，控制肿瘤生长或清除肿瘤^[5]。

il15的副作用包括：

(1)触发细胞因子级联反应，包括tnfa，il1，il6，gm-csf以及促炎性细胞因子的产生；

(2)对有些肿瘤进展是起促进作用，帮助肿瘤的增殖，存活和扩散；

(3)可能会活化自身反应性t细胞并参与自身免疫性疾病过程；

(4)可能引起冠状心脏疾病；

(5)诱导表达免疫抑制性分子pd1/pdl1的表达。

技术实现要素：

本发明首先涉及一组融合蛋白，所述的融合蛋白包括如下结构单元：

(1)第一结构单元：白介素15(il15)受体的一个或一个亚基的片段；

(2)第二结构单元：具有活性的il15；

(3)位于所述融合蛋白c端的第三结构单元：抗体fc片段；

(4)连接片段1：用于连接所述的第一、第二和第三结构单元。

所述的融合蛋白的n端是第一结构单元时，第二结构单元位于第一结构单元和第三结构单元之间；

所述的融合蛋白的n端是第二结构单元时，第一结构单元位于第二结构单元和第三结构单元之间。

所述的抗体fc片段为人fc，优选为人igg-fc；最优选为氨基酸序列如seqidno.2所示的人igg1-fc；

所述的il15为人源或鼠源的il15，优选的，其氨基酸序列如seqidno.1所示；

所述的il15受体的亚基为il15受体的α亚基、β亚基或γ亚基，优选为α亚基；

所述的il15受体的亚基片段优选为为α亚基sushi结构域，其氨基酸序列如seqidno.3所示；

优选的，所述连接片段1的氨基酸序列为gggs的整数倍重复；最优选的，连接第三结构单元的连接片段1的氨基酸序列如seqidno.6所示，位于第一和第二结构单元之间的连接片段1的氨基酸序列如seqidno.5所示。

本发明还涉及一组融合蛋白，所述的融合蛋白包括如下结构单元：

(1)第一结构单元：白介素15(il15)受体的一个或一个亚基的片段；

(2)第二结构单元：具有活性的il15；

(3)位于所述融合蛋白c端的第三结构单元：抗体fc片段；

(4)连接片段1：用于连接所述的第一、第二和第三结构单元；

(5)位于所述融合蛋白n端的第四结构单元：il15受体的β亚基的胞外片段；

(6)连接片段2：用于连接所述第四结构单元和剩余结构单元。

连接在所述第四结构单元c端的是第一结构单元时，第二结构单元位于第一结构单元和第三结构单元之间；

连接在所述第四结构单元c端的是第二结构单元时，第一结构单元位于第二结构单元和第三结构单元之间；

所述的连接片段2能够被肿瘤微环境中特异性表达的蛋白水解酶识别并水解。

所述的抗体fc片段为人源igg1fc，其氨基酸序列如seqidno.2所示；

所述的il15为人源或鼠源的il15，优选的，其氨基酸序列如seqidno.1所示；

所述的il15受体的亚基为il15受体的α亚基、β亚基或γ亚基，优选为α亚基；

所述的il15受体的亚基片段优选为il15受体的α亚基sushi结构域，其氨基酸序列如seqidno.3所示；

优选的，所述的il15受体的β亚基的胞外片段的氨基酸序列如seqidno.4所示；

优选的，所述连接片段1的氨基酸序列如seqidno.5所示；

优选的，所述的肿瘤微环境中特异性表达的蛋白水解酶为基质金属蛋白酶，优选为基质金属蛋白酶9(mmp9),最优选的，所述的连接片段2的氨基酸序列如seqidno.7所示。

本发明还涉及一种药物前体，所述的药物前体为同源或异源二聚体，构成所述的二聚体的单体为前述的融合蛋白。

优选的，所述的药物前体为如下药物前体1～3：

(1)药物前体1(ra-il15-fc)为同源二聚体

组成的单体为：il15受体的α亚基sushi结构域、连接片段1、人源或鼠源的il15、连接片段1、人源igg1fc连接成的融合蛋白，其氨基酸序列结构如seqidno.8所示；

(2)药物前体2(il15-ra-fc)为同源二聚体

组成的单体为：人源或鼠源的il15、连接片段1、il15受体的α亚基sushi结构域、连接片段1、人源igg1fc连接成的融合蛋白，其氨基酸序列结构如seqidno.9所示；

(3)药物前体3(rb-il15-ra-fc)为同源二聚体

组成的单体为：il15受体的β亚基的胞外片段、连接片段2、人源或鼠源的il15、连接片段1、il15受体的α亚基sushi结构域、连接片段1、人源igg1fc连接成的融合蛋白，其氨基酸序列结构如seqidno.10所示。

本发明还涉及编码所述融合蛋白的核苷酸片段。

本发明还涉及所述融合蛋白、融合蛋白二聚体、药物前体在制备药物中的应用；

优选的，所述的药物为抗肿瘤药物，最优选的，所述药物为抗b细胞性淋巴瘤或抗结直肠癌的药物。

本发明还涉及所述的融合蛋白或药物前体的制备方法，所述的制备方法包括如下步骤：

(1)构建包含所述编码所述融合蛋白或药物前体的编码基因的表达载体，优选的，所述的表达载体是pee12.4表达载体；

(2)通过瞬时转染宿主细胞的方法构建包含所述表达载体的宿主细胞，优选的，所述的宿主细胞是293f细胞；

(3)培养所述宿主细胞并收集细胞上清；

(4)通过proteina/g的亲和层析柱纯化蛋白纯化所述融合蛋白或药物前体。

本发明的有益效果包括：

1、设计了两种形式的superil15，它们体外生物学功能是相似的，并且与普通il15-fc相比，它们扩增t细胞的能力均增加了100倍。

2、在a20肿瘤模型中，superil15进行瘤内给药可以完全清楚肿瘤。

3、prodrug毒副作用显著降低的，其肿瘤治疗效果与superil15相似。

附图说明

图1、融合蛋白的结构示意图，1a，il15-fc融合蛋白结构示意图；1b，两种不同结构的融合了il15受体α亚基的sushi结构域(il15-ra-fc)的两种superil15的结构示意图(ra-il15-fc和il15-ra-fc)；1c，融合了il15受体β亚基的胞外端(il15rbecd)的融合蛋白(rb-il15-ra-fc)结构示意图。

图2、三种融合蛋白的sds-page电泳图。

图3、il15-fc和superil15促淋巴细胞增殖实验结果图。

图4、rb-il15-ra-fc、superil15促淋巴细胞增殖实验结果图。

图5、superil15治疗小鼠a20肿瘤模型结果图，5a，瘤内给药小鼠的肿瘤体积对比图；5b，瘤内和眼静脉给药的小鼠存活时间对比图；5c，瘤内给药治愈后再次接种肿瘤细胞后肿瘤体积对比图。

图6、superil15治疗小鼠mc38肿瘤模型结果图，6a，瘤内和眼静脉给药小鼠的肿瘤体积对比图；6b，瘤内和眼静脉给药的小鼠存活时间对比图。

图7、降低给药剂量后superil15治疗小鼠a20肿瘤模型结果图。

图8、rb-il15-ra-fc与superil15在小鼠a20肿瘤模型中的治疗效果对比图，8a，眼静脉给药后小鼠的肿瘤体积对比图；8b，给药后细胞因子的定量数据图。

图9、rb-il15-ra-fc与superil15在小鼠a20肿瘤模型中的治疗效果对比图，9a，腹腔注射给药后的小鼠存活时间数据；9b，给药后细胞因子的定量数据图。

具体实施方式

实施例1、融合蛋白的设计构建

1、设计构建以下四种融合蛋白：

(1)il15-fc的对照蛋白：

将小鼠il15与higgfc构建成融合蛋白(以下命名为il15-fc)结构见图1a；其中，鼠源il15的氨基酸序列如seqidno.1所示，higgfc的氨基酸序列如seqidno.2所示；

(2)两种不同连接次序的superil15融合蛋白：

il15-il15rαsushi-fc(以下命名为il15-ra-fc)和il15rαsushi-il15-fc(以下命名为ra-il15-fc)结构见图1b；其中，il15rαsushi为il15受体α亚基的sushi结构域，其氨基酸序列如seqidno.3所示，il15rαsushi与il15之间的连接片段(linker)的氨基酸序列如seqidno.5所示；

(3)在superil15的基础上进一步融合的il15受体β亚基胞外区片段的rb-il15-ra-fc(prodrug)：

il15rβecd-mmp9linker-il15-il15rαsushi-fc(以下命名为rb-il15-ra-fc)结构见图1c；其中，il15rβecd为il15受体β亚基的胞外结构域，其氨基酸序列如seqidno.4所示，mmp9linker为可以被基质金属蛋白酶9水解的连接片段，其氨基酸序列如seqidno.7所示。

2、融合蛋白的构建，转染，表达以及回收纯化

以上四种形式的融合蛋白基因构建于真核表达载体中，通过293f细胞进行瞬时表达，收集的细胞上清通过proteina进行纯化。纯化出的蛋白通过elisa进行定量。sds-page方法检测其纯度(每个样品2μg进行上样)。

具体的方法步骤如下：

2.1、质粒的构建

pee12.4-iggκ-higg1fc质粒来自本实验室，包含有小鼠iggκ的信号肽和人igg1恒定区序列。本申请涉及的所有基因(il15，il15ra和il15rb胞外端)都是通过公司合成，然后通过酶切连接到pee12.4表达载体上。用天根的质粒大提试剂盒提取质粒，-80℃保存。

2.2、瞬时转染快速无血清表达目的蛋白

(1)293f细胞用cdopticho^tm培养基，37℃，8％co2，135rpm悬浮培养；

(2)转染前两天，293f细胞传代至1l锥形培养瓶，细胞接种密度为0.6-0.8×10⁶cells/ml，细胞体积200ml；

(3)预计细胞密度2.5-3.5×10⁶cells/ml可进行转染。离心细胞悬液收集细胞。freestyle293培养基再洗1次；

(4)用200mlfreestyle293培养基重悬细胞；

(5)用5mlfreestyle293培养基稀释600μg质粒，过滤除菌；

(6)用5mlfreestyle293培养基稀释1.8mgpei并过滤除菌。随后立即将5ml质粒和5ml的pei混匀，室温静置5分钟；

(7)将质粒/pei混合物加入细胞悬液中，放置在37℃，8％co2，85rpm培养箱中培养，同时补加生长因子50ug/llong^tmr3igf-1；

(8)4小时后补加200mlex-cell^tm293培养基和2mmglutamine，将转速调至135rpm继续培养；

(9)24小时后加入细胞增殖抑制剂3.8mmvpa，72小时后加入40mlmediumd继续培养，转然后6-8天(细胞存活率低于70％)收集上清液进行下一步纯化。

2.3、利用proteina进行目的蛋白纯化

(1)样品准备：将细胞培养悬液，8,000rpm，离心2小时弃沉淀，上清0.45μm过滤除去除杂质，加入终浓度为0.05％nan3；

(2)分别用10倍柱体积的双蒸水和pbs冲洗和平衡proteina层析柱；

(3)利用恒流泵进行上样，流速为10倍柱体积/小时，收集流穿液，重复上样2次；

(4)用10倍柱体积以上的pbs冲洗柱子，洗去杂蛋白，冲洗至流出液无蛋白检出；

(5)使用elutionbuffer(0.1mglycine,ph2.7)进行洗脱，洗脱液分管收集，每1ml收集1管，并采用蛋白指示液(bio-radproteinassay)观察洗脱峰。将洗脱峰的收集管混合后加入适量的1mtris，ph9.0中和(调节ph值至6-8，应于所纯化蛋白等电点相差0.5以上)；

利用zeba脱盐离心柱或浓缩离心柱将目的蛋白溶液置换到所需要的缓冲液中。通过sds-page电泳，nanodrop2000以及elisa确定蛋白浓度和纯度，蛋白分装-80℃保存；

(6)洗脱结束后，依次使用20倍柱体积的蒸馏水冲洗柱子，再用10倍柱体积的20％乙醇冲洗柱子，最后乙醇溶液要浸没凝胶介质，4℃保存。

对纯化后的融合蛋白的sds-page的电泳结果见图2，其中，s1泳道上样为il15-fc；s2泳道上样为ra-il15-fc；s3泳道上样为rb-il15-ra-fc。

实施例2、superil15融合蛋白的生物学功能研究

1、促淋巴细胞生成的功能，

促淋巴细胞增殖实验(cck8试验)步骤如下：

(1)ctll2细胞用含100u/ml商业化重组il2细胞因子的1640完全培养基培养；

(2)实验当天细胞用不含il2细胞因子的1640完全培养基培养清洗2遍，并计数调整细胞浓度为20000/ml；

(3)用不含il2细胞因子的1640完全培养基培养稀释样品il15-fc，il15-ra-fc，ra-il15-fc以及rb-il15-ra-fc。起始浓度为10μg/ml，10倍稀释，做8个稀释梯度；

(4)96孔细胞培养板中加入100μl细胞悬液和100μl样品，同时做只有细胞的对照孔和只有培养基的空白孔；

(5)培养48～72小时后，加入20μlcck8，继续培养2～4小时后，酶标仪检测450nm和630nm两个波长的od值。

检测结果如图3所示(ctr为不给药对照组)，表明：

(1)两种形式的superil15的生物学活性是相似的：也就是说，在融合蛋白中，不管il15片段在前，还是il15rαsushi片段在前，都不影响superil15的功能；

(2)superil15与il15-fc相比，生物学活性提高了约100倍。

2、il15rβecd的融合片段能够封闭superil15的生物学功能

通过cck8试验检测rb-il15-ra-fc和superil15对ctll2的促增殖能力，结果如图4所示(ctr为不给药对照组)，表明：rb-il15-ra-fc与superil15相比，生物学活性降低了100倍。说明il-15rβ的胞外端是可以封闭superil-15的生物学功能的。

3、在不同的小鼠肿瘤模型中检测superil15的肿瘤治疗效果和毒副作用

3.1、a20model

方法1(给药剂量25μg)：3×10⁶个a20细胞皮下接种到balb/c小鼠左下侧。待肿瘤长至60～80mm³，瘤内或眼静脉给药25μgsuperil15，给药2次，间隔2天，对照组采用同样方式给予pbs。测量肿瘤的体积(体积＝长×宽×高/2)，记录小鼠的生存曲线。

结果如图5所示，可见，

(1)通过瘤内给药的治疗组，肿瘤全部消掉，小鼠痊愈(图5a)；2个月后，痊愈的小鼠再次接种5倍数量的a20细胞，同时以wt小鼠作为对照，痊愈的小鼠最终没有长出新的肿瘤(图5c)。说明通过superil15治疗，使小鼠产生了记忆性保护反应。

(2)通过静脉给药的治疗组，小鼠在治疗两次后死亡(图5b)。说明superil15的毒副作用特别大。

方法2(给药剂量12.5μg)：3×10⁶a20细胞皮下接种到balb/c小鼠左下侧。待肿瘤长至60～80mm³，瘤内或眼静脉给药的superil15，给药2次，间隔2天，对照组采用同样方式给予pbs。测量肿瘤的体积(体积＝长×宽×高/2)

结果如图7所示：可见，通过瘤内给药的治疗组，100％小鼠的肿瘤都彻底清除；通过静脉给药的小鼠，20％小鼠发生肿瘤清除，其余小鼠肿瘤有一定的控制。

3.2、mc38model

方法：5×10⁵mc38细胞皮下接种到c57小鼠左下侧。待肿瘤长至60mm³，瘤内或眼静脉给药25μgsuperil15，给药2次，间隔3天，对照组采用同样方式给予pbs。测量肿瘤的体积(体积＝长×宽×高/2)，记录小鼠的生存曲线。

结果如图6所示，可见，通过瘤内给药的治疗组，有50％小鼠的肿瘤发生的彻底的清除(图6a)，存活时间显著增加(图6b)；通过静脉给药组鼠，没有肿瘤发生清除，肿瘤稍微有些控制(图6a)，存活时间略有增加(图6b)。

以上结果表明：superil15发挥药用效果的部位主要是肿瘤。

实施例3、比较superil15与rb-il15-ra-fc的肿瘤治疗效果和毒副作用

1、在小鼠肿瘤模型中检测rb-il15-ra-fc对肿瘤的治疗效果和毒副作用

方法1：3×10⁶a20细胞皮下接种到balb/c小鼠左下侧。待肿瘤长至60～80mm³，瘤内或眼静脉给药25μgsuperil15或者rb-il15-ra-fc，给药2次，间隔2天，对照组采用同样方式给予pbs。第二次治疗后的20小时采血，通过cba检测血清的炎性因子的水平并另行记录抑瘤效果和小鼠的生存曲线。

cba实验步骤如下：

(1)小鼠眼静脉采血，收集血清-80℃保存；

(2)用bd公司的cba试剂盒检测血清中细胞因子il12p70，il-6，ifn-γ，tnfα，mcp1和il-10的水平。以下是主要步骤：

(3)稀释标准品：取一瓶固体标准品，加入200μl稀释缓冲液配成10×标准品母液，室温放置15min。取100μl10×标准品加入含有900μl稀释缓冲液的ep管中，即为原液管(5000pg/ml)，取300μl原液管，加入含有300μl稀释缓冲液的ep管中，即为1：2。随后倍比稀释依次为1:4，1:8，1:16，1:32，1:64，1:128，1:256；

(4)稀释样品：用稀释缓冲液稀释血清，使其有值在标准曲线的范围内；

(5)混合beads：根据样品数和标准品管数计算出总管数。由于每管需要每种beads的量是2μl，可以计算出每种beads的总量，并分别取出所需量的il12p70，il-6，ifn-γ，tnfα，mcp1和il-10beads混在一起；

(6)染色：取流式管标记后，每管加入50μl样品或标准品，加入10μl混合后的beads以及10μlpe标记的检测抗体，混匀室温避光反应2h；

(7)加入1ml清洗缓冲液，300g离心5min，小心弃掉上清；

(8)300μl清洗缓冲液重悬样品，充分混匀；

(9)用bd流式细胞仪收集数据；

(10)分析数据，根据标准品计算出样品中细胞因子的水平。

对肿瘤体积的治疗效果如图8a所示，表明通过静脉给药的rb-il15-ra-fc的治疗效果与superil15相当。

对血清炎性因子水平的比较结果如图8b所示，表明，与superil15相比，rb-il15-ra-fc的毒副作用是有所降低。

方法2：3×10⁶a20细胞皮下接种到balb/c小鼠左下侧。待肿瘤长至60～80mm³，腹腔注射给药25μgsuperil15或者rb-il15-ra-fc，给药2次，间隔2天，对照组采用同样方式给予pbs。第二次治疗后的20小时采血，通过cba检测血清的炎性因子的水平。记录小鼠的生存曲线。

小鼠生存实验结果显示，superil15治疗组中，在第二次给药后第一天，小鼠状态明显不健康，体温降低，皮毛不顺。给药后的第二天，所有小鼠发生了死亡。而rb-il15-ra-fc治疗组，治疗两次后，小鼠没有出现不健康状态。生存曲线明显长于superil15治疗组。给药后小鼠的生存曲线如图9a所示，血清炎性因子水平如图9b所示。

上述说明：rb-il15-ra-fc确实可以降低superil15的毒副作用。

最后需要说明的是，以上实施例仅用作帮助本领域技术人员理解本发明的实质，不用做的本发明保护范围的限定。

参考文献：

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sequencelisting

<110>中国科学院生物物理研究所

<120>一种以白介素15为活性成分的融合蛋白型药物前体

<130>cp11802105c

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