本发明涉及一种氟代氧化膦类化合物，特别涉及该化合物在正电子发射显像剂制备中的应用。
背景技术：
正电子发射显像(positronemissiontomography，pet)是目前唯一用解剖形态方式进行功能、代谢和受体显像的技术，具有很高的灵敏度和特异性，可以从体外无损伤地定量地动态地从分子水平观察药物或代谢物在人体内的生理生化变化，已成为诊断和指导治疗肿瘤心血管病和神经精神疾病的最优手段。
近年来，基于非碳原子的18f标记方法越来越多的被用于pet探针的制备，这类标记方法选择性好、放化产率高(radiochemicalyields，rcys)，能够获得高比活度(specificactivity，sa)体内代谢稳定的放射性示踪剂，但是，这类非碳原子的18f标记方法存在如下缺点：1)标记反应温高；2)需要在较强酸性下才能标记；3)标记前体分子量大；4)体内脱氟等等。
p-f键与c-f键的键能相当，可以在室温下有水的情况下被构建。基于p-18/19f标记方法的系统研究有望获得一种水相中一步或两步完成多肽、蛋白、敏感分子等的18f标记，对于正电子药物、正电子发射分子影像的发展具有重要的意义。
技术实现要素：
本发明通过引入18f-19f同位素交换的策略来实现快速、温和的构建p-18f键。通过提高位阻来阻止p-f键的水解，通过引入大位阻的叔丁基结构来获得体内代谢稳定的标记前体。并将此温和的标记方法应用于铃蟾肽(bombesin)、c(rgdfk)[环(arg-gly-asp-dphe-lys)]和e[p4-c(rgdfk)]2等众活性多肽和蛋白的18f标记，可望获得一批制备简单、体内稳定性好、高靶向性的新型疾病早期诊断探针。
本发明的第一目的在于提供一种氟代氧化膦类化合物(应用于正电子发射显像剂的18f标记)，其具有如式i所示结构：
其中，r1和r2各自独立地选自：
其中，p为0-7，m为0-7，n为0-7，x选自-h或-cho，a选自18或19。
优选r1和r2各自独立地选自
作为一种理想方案，本发明所述氟代氧化膦类化合物为不对称结构；
当所述氟代氧化膦类化合物为不对称结构时，优选，r1为
作为另外一种理想方案，本发明所述氟代氧化膦类化合物为对称结构；
优选，r1和r2均选自
更优选，本发明所述氟代氧化膦类化合物选自如下化合物中的一种，a选自18或19：
本发明提供的上述叔丁基氧化膦氟化物在体内稳定性好，不易脱氟，且叔丁基氧化膦氟化物结构体积小、分子量低，可以最低限度地减少标记辅助基团对探针活性的影响。
本发明首次以氟代氧化膦类化合物作为18f标记辅助化合物，通过18f-19f同位素交换的策略来构建正电子核素探针，这种标记方法条件温和、可直接在含有18f-的有机相溶剂、水溶液以及他们的混合溶剂中反应，无需吹干18f-，放射化学产率高、后处理方便，在热敏感和溶剂敏感的多肽或蛋白质等生物分子的正电子药物开发具有广阔的应用前景。
本发明的第二目的在于提供利用上述氟代氧化膦类化合物进行18f标记的方法。
具体而言，本发明依据上述氟代氧化膦类化合物的结构差异，提供了两种不同合成路线，具体如下：
作为并列方案之一，当r1和r2均选自
(1)以四氢呋喃为溶剂，化合物a与亚磷酸二乙酯经亲核加成反应得化合物b；
(2)以四氢呋喃为溶剂，化合物b与氯化铜，氟化铯经亲核取代反应得式i1所示化合物。
(3)在水相或有机相溶剂中将含19f化合物i1溶解，加入18f-水溶液或有机溶剂，充分混匀后，室温静止或轻微加热15分钟左右，通过18f-19f同位素交换反应得式i2所示18f标记的化合物。
更具体的，所述方法包括如下步骤：
(1)将亚磷酸二乙酯置于反应瓶中，氩气保护下加入四氢呋喃后，放在-70℃～-90℃(优选-80℃)下搅拌20-50分钟(优选30分钟)；向其中加入化合物a(即r1基溴化镁)，室温反应过夜；加入稀盐酸淬灭反应，用乙酸乙酯萃取，减压旋干，柱色谱纯化得到化合物b。
(2)将化合物b、氯化铜和氟化铯干燥后置于反应瓶中，加入四氢呋喃，在室温下反应5～9小时(优选7小时)后，柱色谱纯化，得式i1所示化合物。
(3)在水相或有机相溶剂中将含19f化合物i1溶解，加入18f-水溶液或有机溶剂，充分混匀后，室温静止或轻微加热15分钟左右，通过18f-19f同位素交换反应得式i2所示18f标记的化合物。
作为并列方案之二，当r1为
(1)以四氢呋喃为溶剂，化合物c与2-r2-2-溴丙烷经亲核加成反应得化合物d；
(2)以四氢呋喃为溶剂，化合物d与氯化铜，氟化铯经亲核取代反应得式i3所示化合物。
(3)在水相或有机相溶剂中，通过18f-19f同位素交换反应得式i4所示18f标记的化合物。
更具体的，所述方法包括如下步骤：
(1)将化合物c(即r1基二氯化磷)加入干燥的反应瓶后，在氩气保护下，先加入四氢呋喃，然后缓慢加入2-r2基2-溴丙烷，反应过夜；加入稀盐酸淬灭反应，用乙酸乙酯萃取，减压旋干，柱色谱纯化得到化合物d。
(2)将化合物d、氯化铜和氟化铯干燥后置于反应瓶中，加入四氢呋喃，在室温下反应5～9小时(优选7小时)后，柱色谱纯化，得式i3所示化合物。
(3)在水相或有机相溶剂中将含19f化合物i2溶解，加入18f-水溶液或有机溶剂，充分混匀后，室温静止或轻微加热15分钟左右，通过18f-19f同位素交换反应得式i4所示18f标记的化合物。
本发明所提供的上述制备方法，原料和溶剂等的相对用量，以及减压旋干，柱色谱纯化等操作均为本领域的常规技术手段，本发明对此不作特别限定。
本发明的第三目的在于提供上述18/19f标记的氟代氧化膦类化合物在正电子发射显像领域的应用；
优选在正电子发射显像剂或其制备中的应用；
进一步优选在标记多肽或蛋白质用于制备正电子发射显像剂中的应用。
特别是上述氟代氧化膦类化合物在标记多肽或蛋白质用于制备正电子发射显像剂中的应用；
所述多肽或蛋白质优选自铃蟾肽、rgd衍生物、人血清白蛋白或前列腺特异性膜抗原；所述rgd衍生物优选为c(rgdfk)[环(arg-gly-asp-dphe-lys)]或e[p4-c(rgdfk)]2。
本发明至少实现了如下有益效果：(1)首次利用氟代氧化膦作为18f标记的标记辅助基团；(2)首次引入大位阻的叔丁基来改善氟代氧化膦的体内稳定性；(3)首次利用氟代氧化膦制备标记前体用于正电子发射显像剂的18f标记；(4)首次实现了氟代氧化膦化合物的常温水相18f标记等是本发明的创新之处。
此外，氧化膦结构新颖功能多样，改变氧化膦的取代基可以有效调控多肽或蛋白探针在体内稳定性、药代动力学和肿瘤的靶向性是本发明的特色。
附图说明
图1为实施例2所制备的化合物7所示18f标记的氟代氧化膦标记(实验组)hplc结果示意图；
图2为n-琥珀酰亚胺基-4-[18f]氟苯甲酸酯([18f]sfb)标记(对照组)hplc结果示意图；
图3为实验例实验组化合物动态60分钟正电子发射成像显像结果；
图4为化合物7所示18f标记的氟代氧化膦标记(实验组)在小鼠体内生物分布结果；
图5为化合物7所示18f标记的氟代氧化膦标记(实验组)在小鼠体30分钟后，骨头，胆囊，肠，膀胱中放射性随时间的变化情况，其中，横坐标为时间(单位：分钟)；
图6是18f标记带有人血清白蛋白的氟代氧化膦合物([18f]dbpof-hsa)并在大鼠体内进行60分钟动态血池显像；
图7是18f标记带有c(rgdyk)的氟代氧化膦合物([18f]dbpof-c(rgdyk))并在(u87)恶性脑胶质瘤肿瘤鼠体内进行动态90分钟显像，箭头所指即为肿瘤；
图8是18f标记带有hsa的氟代氧化膦合物([18f]dbpof-hsa)和并dbpof-has共进样并通过赛默飞液相色谱进行鉴定分析的结果示意图；
图9为合成的化合物c(rgdyk)-dbopf并用质谱进行表征鉴定的结果示意图；
图10为18f标记化合物c(rgdyk)-dbopf与化合物c(rgdyk)-dbopf共进样并通过赛默飞液相色谱进行鉴定分析的结果示意图；
图11为化合物1的1hnmr图谱；
图12为化合物1的13cnmr图谱；
图13为化合物1的31pnmr图谱；
图14为化合物2的1hnmr图谱；
图15为化合物2的13cnmr图谱；
图16为化合物2的31pnmr图谱；
图17为化合物3的1hnmr图谱；
图18为化合物3的31pnmr图谱；
图19为化合物3的13cnmr图谱；
图20为化合物4的1hnmr图谱；
图21为化合物4的13cnmr图谱；
图22为化合物4的31pnmr图谱；
图23为化合物4的19fnmr图谱；
图24为化合物6的1hnmr图谱；
图25为化合物6的13cnmr图谱；
图26为化合物6的31pnmr图谱；
图27为化合物6的19fnmr图谱；
图28化合物5用氟18标记后与化合物5进行hplc共进样表征hplc图。
具体实施方式
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。
实施例1
本实施例提供了一种用于正电子发射显像的18f标记的氟代氧化膦类化合物，其制备历程及具体步骤如下：
tetrahydrofuran：四氢呋喃dmf：n,n-二甲基甲酰胺
meoh：甲醇csf：氟化铯
pd/c：钯碳cucl2：氯化铜
dcc：二环己基碳二亚胺18f-a.q.：加速器打靶水
化合物1的合成步骤：
a：取7.5mmol锌粉于干燥的反应瓶中，氩气保护下加入5ml四氢呋喃。将1.2mmoli2溶于2ml的四氢呋喃中后，加入反应瓶。之后取8mmol2-溴异丁酸苄脂溶于3ml四氢呋喃中后，加入反应瓶。待锌粉完全反应完后，冰水浴下，将8mmol叔丁基二氯化磷溶于5ml四氢呋喃中后，缓慢加入反应瓶中，室温下反应过夜。回收处理：冰水浴下，加入20ml0.1mol/l稀盐酸，用乙酸乙酯萃取，然后旋干过柱分离，得化合物1，产率约80％；
化合物1核磁结果：1hnmr(600mhz,cdcl3)δ1.14(d,9h,j＝16.35hz)；1.55(s,3h)；1.62(d,6h,j1＝12.38hz,j2＝14.47hz)；5.14(d,2h,j1＝12.28hz,j2＝12.28hz)；6.51(d,1h,j＝464.93hz)；7.35(m,5h,j1＝7.31hz,j2＝8.76hz).31pnmr(600mhz,cdcl3)δ58.60(d,1p,j＝464.53hz)
化合物2的合成步骤：
b：取1.05mmol化合物1和3.3mmol钯碳于干燥后的反应瓶中，氢气氛围下加20ml无水甲醇，室温下反应24小时，旋干，色谱柱纯化。产率约95％；
化合物2核磁结果：1hnmr(600mhz,dmso-d6)δ1.13(d,9h,j＝15.73hz)；1.37(d,6h,j1＝14.38hz,j2＝14.38hz)；6.37(d,1h,j＝459.88hz)；13.07(s,1h).31pnmr(600mhz,dmso-d6)δ56.94(d,1p,j＝459.03hz).
化合物3的合成步骤：
c：将1mmol化合物2和1mmol四氟苯酚于干燥反应瓶中，氩气保护下加入1ml的n,n-二甲基甲酰胺(dmf)。将1mmol的二环己基碳二亚胺(dcc)溶于1mln,n-二甲基甲酰胺(dmf)后，加入反应瓶，室温下搅拌24小时，冷却至0℃，反应1小时，过滤后将溶剂旋干过柱，色谱柱纯化，得化合物3，产率约80％。
化合物3核磁结果：1hnmr(600mhz,cdcl3)δ1.13(d,9h,j＝17.11hz)；1.75(d,6h,j1＝14.55hz,j2＝13.28hz)；7.01(m,1h).
化合物4的合成步骤：
d：将2mmolcsf和2mmolcucl2于干燥后的反应瓶，氩气保护下，加入1ml无水丙酮。随后取1mmol化合物3，溶于1ml无水丙酮中后，加入反应瓶，室温下反应2小时，旋干，色谱柱纯化，得化合物4。产率约80％；
化合物4核磁结果：1hnmr(600mhz,cdcl3)δ1.13(d,9h,j＝17.11hz)；1.79(d,6h,j1＝14.55hz,j2＝13.28hz)；7.01(m,1h).
产物5的合成步骤：
e：将化合物4溶于少量水相或有机相溶剂中溶解，加入18f-水溶液或有机溶剂，充分混匀后，室温静止或轻微加热15分钟左右，即得到18f标记的氟代氧化膦类化合物5。
其中，化合物1-5的核磁图谱见图11-图23；化合物5用氟18标记后与化合物5进行hplc共进样表征hplc图见图28。
实施例2
化合物1的合成步骤：
a：取7.5mmol锌粉于干燥的反应瓶中，氩气保护下加入5ml四氢呋喃。将1.2mmoli2溶于2ml的四氢呋喃中后，加入反应瓶。之后取8mmol2-溴异丁酸苄脂溶于3ml四氢呋喃中后，加入反应瓶。待锌粉完全反应完后，冰水浴下，将8mmol叔丁基二氯化磷溶于5ml四氢呋喃中后，缓慢加入反应瓶中，室温下反应过夜。回收处理：冰水浴下，加入20ml0.1mol/l稀盐酸，用乙酸乙酯萃取，然后旋干过柱分离；得化合物1。
化合物1核磁结果：1hnmr(600mhz,cdcl3)δ1.14(d,9h,j＝16.35hz)；1.55(s,3h)；1.62(d,6h,j1＝12.38hz,j2＝14.47hz)；5.14(d,2h,j1＝12.28hz,j2＝12.28hz)；6.51(d,1h,j＝464.93hz)；7.35(m,5h,j1＝7.31hz,j2＝8.76hz).31pnmr(600mhz,cdcl3)δ58.60(d,1p,j＝464.53hz).
化合物6的合成步骤：
f：将2mmolcsf和2mmolcucl2于干燥后的反应瓶，氩气保护下，加入1ml四氢呋喃。随后取1mmol化合物6，溶于1ml无水四氢呋喃中后，加入反应瓶，室温下反应2小时，旋干，色谱柱纯化，得化合物6。
化合物6核磁结果：1hnmr(600mhz,cdcl3)δ1.22(d,9h,j＝16.64hz)；1.61(d,6h,j＝14.76hz,)；5.17(d,2h,j＝6.61hz)；7.36(m,5h).19fnmr(600mhz,cdcl3)δ-94.59(d,1f,j＝10087.82hz).31pnmr(600mhz,cdcl3)δ68.72(d,1p,j＝350.70).
产物7的合成步骤：
将化合物7溶于少量水相或有机相溶剂中溶解，加入18f-水溶液或有机溶剂，充分混匀后，室温静止或轻微加热15分钟左右，得化合物7，即18f标记的氟代氧化膦类化合物。
其中，化合物6的核磁图谱见图24-图27。
实施例3
化合物8合成步骤：
取2mmol亚磷酸二乙酯于干燥反应瓶，在氩气保护下加入3ml四氢呋喃，置于-80℃下反应半小时后，加入6mmol异丙基溴化镁，在-80℃下反应2小时后置于室温下反应3小时，加入稀盐酸淬灭反应并用乙酸乙酯萃取，最后旋干过柱分离。
化合物8核磁结果：1hnmr(400mhz,cdcl3)δ1.24(d,9h,j＝39.46hz)；2.03(d,2h，j＝32.51hz)；6.33(d,1h,j＝431.69hz).31pnmr(400mhz,cdcl3)δ58.60(d,1p,j＝464.53hz).
化合物9合成步骤：
将2mmolcsf和2mmolcucl2于干燥后的反应瓶，氩气保护下，加入1ml四氢呋喃。随后取1mmol产物1，溶于1ml无水四氢呋喃中后，加入反应瓶，室温下反应2小时，旋干，色谱柱纯化，得化合物9。
化合物9核磁结果1hnmr(400mhz,cdcl3)δ0.89(s,12h)；3.70(s,2h).31pnmr(400mhz,cdcl3)δ77.53(d,1p,j＝1048.37hz).19fnmr(400mhz,cdcl3)δ-96.39(d,1f,j＝1045.05hz).
产物10的合成步骤：
将化合物9溶于少量水相或有机相溶剂中溶解，加入18f-水溶液或有机溶剂，充分混匀后，室温静止或轻微加热15分钟左右，得化合物10，即18f标记的氟代氧化膦类化合物。
实验例1
为了进一步验证本发明所述18f标记的氟代氧化膦类化合物的应用效果，本发明同时提供了如下实验例：
实验对象：正常balb/c小鼠
实验试剂：
实验组：实施例2所制备的化合物7所示18f标记的氟代氧化膦；
对照组：sfb标记(其制备历程及结构式如下)
对照组的制备：
实验组的制备：
实验方法：
(1)将实验组和对照组的原料分别溶于5-10ul乙腈后，向实验组中加入氟水，对照组中加入氟水、tbuok,和tstu，将二者均在室温下反应15min，结果表明传统的标记方法无法实现在水中对原料化合物进行标记，而本发明所提供的方法能在水中实现对化合物的标记。实验结果见图1和图2；
其中，图1为实施例2所制备的化合物7所示18f标记的氟代氧化膦标记(实验组)hplc结果示意图；结果表明用本发明所提供的标记方法可以实现在有水条件下对化合物的标记，弥补了传统氟标记方法只能在有机溶剂中进行标记，而不能在有水条件下进行标记的缺点。
图2为n-琥珀酰亚胺基-4-[18f]氟苯甲酸酯([18f]sfb)标记(对照组)hplc结果示意图；结果表明sfb标记(对照组)结果表明传统的方法不能在水中实现对化合物的标记。
(2)将实验组标记上的化合物取约100μl/100μgi的化合物7注入正常balb/c小鼠体内，30分钟后进行60分钟的正电子发射显像，然后分别计算35min，40min，45min，50min，55min，60min，65min，70min，75min，80min放射性在骨头，胆囊，小肠，膀胱的摄取情况。实验结果见图3-图5。
其中，图3为实验例实验组化合物动态60分钟正电子发射成像显像结果。结果说明上述18f标记的氟代氧化膦合物在体内稳定，不易脱氟。图4为化合物7所示18f标记的氟代氧化膦标记(实验组)在小鼠体内生物分布结果；图5为化合物7所示18f标记的氟代氧化膦标记(实验组)在小鼠体30分钟后，骨头，胆囊，肠，膀胱中放射性随时间的变化情况，其中，横坐标为时间(单位：分钟)。
图4和图5的结果均说明18f标记的氟代氧化膦合物在随之时间变长，并没有明显骨头摄取，在体内稳定，不易脱氟，并能通过膀胱快速清除。
实验例2
为了进一步验证本发明所述18f标记的氟代氧化膦类化合物在生物分子上的应用效果，本发明同时提供了如下实验例：
实验对象：正常雄性大鼠和恶性脑胶质瘤裸鼠(u87裸鼠)
实验试剂：
将实施例1所制备的化合物5分别和人血清白蛋白(hsa)与环(rgdyk)(c(rgdyk))反应，并将得到的化合物通过质谱和hplc进行鉴定，具体合成步骤如下，鉴定谱图如附图所示：
化合物5和人血清白蛋白(has)反应
合成：将53mg的has溶于1.5mlph为8.6的碳酸氢钠缓冲液中，然后取0.5mg实例1制备的化合物5(dbopf)并溶于80ul的二甲基亚砜(dmso)后，加入含有has的碳酸氢钠缓冲液中，室温下反应过夜。
标记：然后对合成的化合物has-dbopf进行氟18的放射性标记，具体操作流程为，取0.5umol的has-dbopf溶于100ul的ph为7.4的磷酸盐缓冲液中，加入100ul带有10毫居活度的氟水中(直接从加速器生产出来，未做任何处理)，室温下反应15分钟后，用赛默飞液相色谱进行分析鉴定。鉴定结果如图8所示；
化合物5分别和环(rgdyk)(c(rgdyk))反应
将1.1mmolc(rgdyk)和1mmol的化合物5(dbopf)溶于200ul四氢呋喃中，室温下反应过夜，并用质谱进行鉴定是否合成dbopf-c(rgdyk)，高分辨质谱(hrms)计算(dbopf-c(rgdyk)c35h55fn9o10p+分子量为811.37,(dbopf-c(rgdyk)c35h55fn9o10p+加氢后分子量为812.52，结果如图9所示：
标记：然后对合成的化合物dbopf-c(rgdyk)进行氟18的放射性标记，具体操作流程为，取0.5umol的dbopf-c(rgdyk)加入200ul带有10毫居活度的氟水中(直接从加速器生产出来，未做任何处理)，室温下反应15分钟后，用赛默飞液相色谱进行分析鉴定。鉴定结果如图10所示：
图6是18f标记带有人血清白蛋白的氟代氧化膦合物([18f]dbpof-hsa)并在大鼠体内进行60分钟动态血池显像。
图7是18f标记带有c(rgdyk)的氟代氧化膦合物([18f]dbpof-c(rgdyk))并在(u87)恶性脑胶质瘤肿瘤鼠体内进行动态90分钟显像，箭头所指即为肿瘤。
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。