一种提高植物多不饱和脂肪酸产量的方法与流程

本发明涉及参与fad2转基因沉默的多个遗传因子的鉴定和利用，尤其涉及植物中多不饱和脂肪酸的提高方法。

背景技术

油脂是植物重要的贮藏物质之一，其主要成分是三酰甘油。甘油骨架上的脂肪酰，由于碳链长短以及不饱和键位置的差异而具有不同的理化特性。一般简单地用碳原子数:双键数(x:y)表示脂肪酸碳链长度和不饱和键多少，如最常见的脂肪酸有棕榈酸(hexadecanoicacid，简写为16:0)、硬脂酸(octadecanoicacid，简写为18:0)、油酸(9-octadecenoicacid,(9z)-，cis-δ9octadecenoicacid，顺式十八碳一烯[9]酸，简写为18:1)、亚油酸(9,12-octadecadienoicacid,(9z,12z)-，cis,cis-δ⁹,δ¹²octadecadienoicacid,顺式-十八碳二烯[9,12]酸，简写为18:2)和亚麻酸(9,12,15-octadecatrienoicacid,(9z,12z,15z)-，δ⁹,δ¹²,δ¹⁵octadecatrienoicacids,顺式十八碳三烯[9,12,15]酸，简写为18:3)等种类。

多不饱和脂肪酸是维持细胞膜系统流动性的关键组分。由于人和其它哺乳动物中不能合成多不饱和脂肪酸，必须从食物中摄取。因此，多不饱和脂肪酸对人类和家畜也被为必须脂肪酸，摄取富含多饱和脂肪酸的食物，对于人类和家畜有着极其重要的意义。在植物油脂贮藏器官中，多不饱和脂肪酸主要是通过真核途径完成。在油脂积累过程中，fad2(fattyaciddesaturase2)主要催化卵磷脂(phosphatidylchline)上的油酸酰基形成亚油酸酰基。亚油酸又会在fad3(fattyaciddesaturase3)的作用下，在ω3位形成双键，生成α-亚麻酸(ohlroggeandbrowse,1995)。自拟南芥fad2和fad3的功能被鉴定以来，在很多植物上也开展了对它们的研究，包括基因功能的鉴定和通过基因工程改良种子脂肪酸成分。过表达bnfad3能够成功地促使植物在种子发育过程中生成更多的亚麻酸。在种子特异启动子驱动下，在拟南芥中的过表达系bnfad3能将亚麻酸含量从19.7％提高到28.3-35.3％(carteaetal.1998)；由于亚油酸是亚麻酸形成的底物，只有通过提高亚油酸才可能进一步提高亚麻酸的含量。然而，过表达atfad2却不能有效地提高植物种子中亚油酸的含量。在上述表达bnfad3的研究中，也采用相同的启动子过表达atfad2，在41个转基因株系中，仅4个t2种子亚油酸含量有比较明显的提高，提高幅度不到4％。约半数过表达株系的表型与反义链株系相似，表现出亚油酸降低和油酸增加，油酸最高积累到野生型的1.8倍(carteaetal.,1998)。在发明人搜集到的所有文献中，提高幅度最大的是在拟南芥种子特异表达麻风树jcfad2，转基因系中亚油酸含量从野生型的31.6％仅提高到34.7-36.3％(wuetal.，2013)。

技术实现要素：

seqidno.8编码fad2酶。发明人研究发现，过表达atfad2不但很难提高亚油酸的含量，在绝大部分转基因株系中常常会造成fad2产物亚油酸的降低和其底物油酸的积累。极端株系中，脂肪酸表型类似fad2基因的突变体。在极少数株系中，亚油酸也只有很小幅度的提高(图1)。

进一步研究发现，过表达atfad2编码区的正义链，在大部分株系中引起内源和外源转入fad2的基因沉默(下文简称fad2转基因沉默)，fad2总表达水平与其产物多不饱和脂肪酸与底物油酸的比值密切相关(附图2)。在组成型表达atfad2的根部中，也发现了fad2转基因沉默(附图3)。

这些结果表明，过表达fad2在植物的不同组织中都会引发转基因沉默，并且这种基因沉默发生的比例高、幅度大。

进一步，发明人研究发现如下遗传因子参与了fad2过表达引起的基因沉默，利用这些突变体，可以解除fad2共抑制、提高多不饱和脂肪酸的含量：

seqidno.1所示序列编码rna-dependentrnapolymerase6(rdr6)蛋白，在该蛋白的突变体中过表达atfad2，在全部株系中，fad2转基因沉默现象被解除，确定了rdr6参与fad2转基因沉默；在rdr6中过表达fad2，可以将亚油酸和亚麻酸的含量提高10％以上，超过之前所有相关研究的幅度(附图4)。进一步分析在rdr6突变体背景下过表达fad2的株系，在多不饱和脂肪酸提高的株系中，fad2总表达水平可以大幅度提高，幅度可以高达十倍以上(附图5)。

seqidno.2所示序列编码suppressorofgenesilencing3(sgs3)蛋白，在该蛋白的突变体中过表达atfad2，在全部株系中，多不饱和脂肪酸大幅度积累，fad2转基因沉默现象被解除(附图6)，确定了sgs3参与fad2转基因沉默；可以利用sgs3突变体在fad2过表达中提高多不饱和脂肪酸的含量。

seqidno.3所示序列编码dicerlike2(dcl2)蛋白，在该蛋白的突变体中过表达atfad2，在部分株系中，多不饱和脂肪酸上升，fad2转基因沉默现象被解除，确定了dcl2参与fad2转基因沉默(附图7)。

seqidno.4所示序列编码dicerlike4(dcl4)蛋白，在该蛋白的突变体中过表达atfad2，在少部分株系中，多不饱和脂肪酸上升，fad2转基因沉默现象被解除，确定了dcl4参与fad2转基因沉默(附图8)。

seqidno.3和seqidno.4所示序列编码dcl2和dcl4蛋白，在该两种蛋白的双突变体中过表达atfad2，几乎在所有株系中，多不饱和脂肪酸明显增加，fad2转基因沉默现象被解除，确定了dcl2和dcl4在参与fad2转基因沉默中功能部分重叠，同时敲除的双突变体，可以非常有效的解除上述转基因沉默(附图9)；在dcl2dcl4双突变体背景下过表达fad2，十八碳多不饱和脂肪酸与饱和单不饱和脂肪酸的比值最高可以提高约2倍。

seqidno.5所示序列编码modifierofsnc12(mos2)蛋白，在该蛋白的突变体中过表达atfad2，在全部株系中，多不饱和脂肪酸明显增加，fad2转基因沉默现象被解除，确定了mos2参与fad2转基因沉默(附图10)。

seqidno.6所示序列编码dicerlike1(dcl1)蛋白，在该蛋白的突变体中过表达atfad2，在大部分株系中，多不饱和脂肪酸明显增加，fad2转基因沉默现象被解除，确定了dcl1参与fad2转基因沉默(附图11)。在dcl1突变体背景下过表达fad2，十八碳多不饱和脂肪酸含量最高可以从40％提高到60％。

seqidno.7所示序列编码argonaute1(ago1)蛋白，在该蛋白的突变体中过表达atfad2，在大部分株系中，多不饱和脂肪酸明显增加，fad2转基因沉默现象被解除，确定了ago1参与fad2转基因沉默(附图12)。在ago1突变体背景下过表达fad2，十八碳多不饱和脂肪酸与饱和单不饱和脂肪酸的比值从对照的3最高可以提高5。

seqidno.1、seqidno.2、seqidno.3、seqidno.4、seqidno.5、seqidno.6和seqidno.7分别编码rdr6、sgs3、dcl2、dcl4、mos2、dcl1和ago1蛋白，在这些突变体中，fad2转基因沉默被解除，过表达atfad2可以提高fad2的表达量、提高亚油酸含量和总的多不饱和脂肪酸的含量。在基因工程中，可以利用这些蛋白的突变体过表达fad2、提高多不饱和脂肪酸的含量。

与现有fad2在植物基因工程中利用现状相比，本发明具有以下特点和效果：

(1)进一步明确了fad2过表达正义链，在绝大部分株系中会引发强烈的基因沉默。

(2)首次发现了rdr6、sgs3、dcl2、dcl4、mos2、dcl1和ago1等遗传因子参与了上述fad2转基因沉默过程。

(3)在rdr6突变体中，过表达fad2可以提高fad2的转录水平十倍以上。在rdr6、sgs3、dcl2、dcl4、mos2、dcl1和ago1等基因的单突变体或它们组合的多突变体中过表达fad2，多不饱和脂肪酸提高幅度可以超过10％，或者十八碳多不饱和脂肪酸与单不饱和脂肪酸的比值提高2倍以上。尤其是植物种子和根部中的多不饱和脂肪酸明显提高。

附图说明

图1为fad2在拟南芥野生型种子中过表达t2代株系的脂肪酸变化。图例中的脂肪酸种类：红色柱子为油酸(18:1)，代表fad2的底物；绿色柱子为亚油酸(18:2)和亚麻酸(18:3)的和，代表fad2的产物。横坐标pphaseolin：fad2/col-0表示fad2在种子特异性phaseolin启动子驱动下转化拟南芥col-0野生型所获得的独立转基因系，fad2-1是fad2的一个突变体。纵坐标相对于对照的净变化量是指，转基因系中所示脂肪酸与拟南芥野生型col相应脂肪酸含量的差值，横坐标之上为净增加，横坐之下为净减少。过表达atfad2在大部分转基因株系中表现出其产物亚油酸的降低。fad2转基因系中，油酸的积累和多不饱和脂肪酸的减少接近甚至超过了fad2突变体的表型。

图2为拟南芥fad2转基因株系脂肪酸组分和fad2表达水平分析。横坐标为野生型及fad2转基因t2株系。a图纵坐标表示fad2产物亚油酸与亚麻酸之和与底物油酸的比值。b图纵坐标为fad2的表达水平，用与野生型的表达量的比值表示。表达水平采用q-pcr技术定量，利用5’utr引物检测内源fad2，采用编码区引物检测总fad2。图中横坐标代表野生型col-0以及atfad2在col-0中的转基因株系。在种子中过表达atfad2株系中，fad2基因表达水平与多不饱和脂肪酸水平一致。亚油酸降低的株系中，内源和外源fad2表达水平降低，个别亚油酸提高的株系中，总fad2大量积累。

图3为35s启动子组成型表达atfad2株系的根部发生fad2转基因沉默。a图横坐标为脂肪酸种类，包括油酸、亚油酸和亚麻酸。纵坐标为相关脂肪酸的含量。不同颜色的柱子代表野生型col-0和col-0转基因株系1,2,3,4,5和7。b图横坐标为野生型col-0和转基因株系，转基因株系为35s驱动的atfad2过表达系。纵坐标为fad2表达水平，用与野生型的表达量的比值表示。不同颜色柱子表示总fad2和内源fad2的表达水平。表达水平采用q-pcr技术定量，采用5’utr引物检测内源fad2，采用编码区引物检测总fad2。fad2底物油酸升高、产物多饱和脂肪酸降低，内源和外源fad2表达水平降低。

图4为在rdr6突变体中过表达fad2大幅度提高多不饱和脂肪酸含量。横坐标pphaseolin：fad2/rdr6-11表示rdr6-11和fad2在种子特异性phaseolin启动子驱动下fad2在拟南芥rdr6-11突变体中的转基因系(pphaseolin：fad2/rdr6-11)。rdr6-11为rdr6的一个功能缺失突变体。纵坐标表示fad2产物亚油酸与亚麻酸之和与底物油酸的比值。图例中的黑色为rdr6-11突变体，褐色为pphaseolin：fad2/rdr6-11。与fad2在野生型中表达大部分株系产物降低不同，在rdr6突变体中表达fad2时都没有发生沉默，并且大量株系中产物亚油酸与亚麻酸之和与底物油酸的比值可以提高一倍以上。

图5为fad2/rdr6转基因系脂肪酸表型与fad2表达水平分析。横坐标为rdr6和在其背景下过表达fad2的转基因系。a图纵坐标表示fad2产物亚油酸与亚麻酸之和与底物油酸的比值。b图纵坐标为fad2的表达水平，用与野生型的表达量的比值表示。表达水平采用q-pcr技术定量，利用5’utr引物检测内源fad2，采用编码区引物检测总fad2。fad2在rdr6突变体中过表达可以在全部株系中提高多不饱和脂肪酸，过表达fad2转基因沉默在rdr6突变体中完全被解除，fad2总表达水平可以提高超过10倍以上。

图6为在sgs3突变体中过表达fad2大幅度提高多不饱和脂肪酸含量。横坐标为sgs3突变体和转基因株系，sgs3为sgs3的一个功能缺失突变体，fad2/sgs3表示fad2在sgs3突变体中表达的株系。纵坐标表示fad2产物亚油酸与亚麻酸之和与底物油酸的比值。fad2转基因沉默在突变体中完全被解除。与fad2在野生型中表达大部分株系产物降低不同，在sgs3突变体中表达fad2时全部株系没有发生沉默，且在大量株系中产物亚油酸与亚麻酸之和与底物油酸的比值可以提高一倍以上。

图7为在dcl2突变体中过表达fad2发生转基因沉默的比例降低。横坐标为dcl2突变体和转基因株系，dcl2为dcl2的一个功能缺失突变体，fad2/dcl2表示fad2在dcl2突变体中表达的株系。纵坐标表示fad2产物亚油酸与亚麻酸之和与底物油酸的比值。fad2转基因沉默在突变体中一部分被解除。与fad2在野生型中表达大部分株系产物降低不同，在dcl2突变体中表达fad2时发生转基因沉默的比例降低，且在一些株系中产物亚油酸与亚麻酸之和与底物油酸的比值可以提高一倍以上。

图8为在dcl4突变体中过表达fad2发生转基因沉默的比例降低。横坐标为dcl4突变体和转基因株系，dcl4为dcl4的一个功能缺失突变体，fad2/dcl4表示fad2在dcl4突变体中表达的株系。纵坐标表示fad2产物亚油酸与亚麻酸之和与底物油酸的比值。fad2转基因沉默在突变体中一部分被解除。与fad2在野生型中表达大部分株系产物降低不同，在dcl4突变体中表达fad2时发生转基因沉默的比例降低，且在一些株系中产物亚油酸与亚麻酸之和与底物油酸的比值最高可以提高一倍以上。

图9为fad2转基因沉默在dcl2dcl4突变体中几乎完全被解除。横坐标为dcl2dcl4突变体和转基因株系，dcl2dcl4为dcl2和dcl4的功能缺失双突变体，fad2/dcl2dcl4表示fad2在dcl2dcl4突变体中表达的株系。纵坐标表示fad2产物亚油酸与亚麻酸之和与底物油酸的比值。与fad2在野生型中表达大部分株系产物降低截然不同，在dcl2dcl4突变体中表达fad2时发生转基因沉默的情况几乎被完全解除，并且大量株系中产物亚油酸与亚麻酸之和与底物油酸的比值最高可以提高一倍左右。

图10为fad2转基因沉默在mos2突变体中完全被解除。横坐标为mos2突变体和转基因株系，mos2为mos2的一个功能缺失突变体，fad2/mos2表示fad2在mos2突变体中表达的株系。纵坐标表示fad2产物亚油酸与亚麻酸之和与底物油酸的比值。与fad2在野生型中表达大部分株系产物降低截然不同，在mos2突变体中表达fad2时，所检测株系中发生转基因沉默的情况全部被解除，并且大量株系中产物亚油酸与亚麻酸之和与底物油酸的比值可以提高一倍左右。

图11为fad2在拟南芥dcl1-9突变体种子中过表达t2代株系的脂肪酸变化。dcl1-9为dcl1的一个功能缺失突变体。图中纵坐标为脂肪酸百分比。橙色柱子为突变体，其他柱子为不同的转基因株系。转基因株系为fad2在种子特异性phaseolin启动子驱动下转化拟南芥dcl1-9突变体的转基因系。横坐标为脂肪酸组分：油酸(18:1)以及亚油酸和亚麻酸的总量(18:2+18:3)。大部分株系多不饱和脂肪酸大幅度提高。

图12为fad2转基因沉默在ago1突变体中完全被解除。横坐标为ago1突变体和转基因株系，ago1-25为ago1的一个功能缺失突变体，fad2/ago1-25表示fad2在ago1-25突变体中表达的株系。纵坐标表示fad2产物亚油酸与亚麻酸之和与底物油酸的比值。与fad2在野生型中表达大部分株系产物降低截然不同，在ago1-25突变体中表达fad2时，所检测株系中发生转基因沉默的情况全部被解除，并且大量株系中产物亚油酸与亚麻酸之和与底物油酸的比值可以提高一倍左右。

具体实施方式

本发明编码rdr6、sgs3、dcl2、dcl4、mos2、dcl1或ago1蛋白的基因的拟南芥单突变体是指dna序列发生突变、造成编码序列seqidno.1、seqidno.2、seqidno.3、seqidno.4、seqidno.5、seqidno.6和seqidno.7的蛋白部分或完全丧失功能的植物材料。这些材料用于fad2过表达转基因系中，用来提高植物中多不饱和脂肪酸含量。编码rdr6、sgs3、dcl2、dcl4、mos2、dcl1或ago1蛋白的基因的拟南芥突变体相互组合形成的多于一个基因突变的材料，用于fad2过表达转基因系中，用来提高植物中多不饱和脂肪酸含量。

以下实施例中，仅对相对特殊的材料和研究方法给以介绍。常规的试验方法以及所涉及的常规生化试剂未进行详细描述，研究方法参考《分子克隆实验指南》(j.莎姆布鲁克等著)和《lipidanalysis》(williamw.christie和xianlinhan著)等。

实施例1：植物表达载体的构建

1.植物材料准备

本试验所用拟南芥为野生型col-0。拟南芥种子在4℃的环境下放置2-4天进行同步化处理后，在人工控制培养室的培养，生长条件为：温度条件为22℃，光周期是16小时光照/8小时黑暗，光强是100-130μem^-2s^-1。

2.拟南芥种子中rna提取

采用常规trizon法提取拟南芥种子总rna。

3.rna逆转录合成第一链cdna

采用takara试剂盒(codeno.rr047a)进行逆转录。

4.引物设计与基因克隆

根据seqidno.8序列设计全长引物，引物如下：

fad2-f：5’-atgggtgcaggtggaaga-3’

fad2-r:5’-ggtcataacttattgttgtaccag-3’

以逆转录所得cdna为模板，以fad2-f和fad2-r为引物，pcr得到fad2基因全长。

5.表达载体构建

将克隆得到的atfad2基因连接到克隆载体p-easy(全式金公司)上，转化后筛选阳性克隆，测序鉴定序列。利用限制性内切酶ecorⅰ和xbaⅰ双酶切连接，将atfad2基因连接到gateway前入门载体pgw-mcs上,为pgw-mcs+fad2。

用限制性内切酶hindⅲ将pk7wg2d上gfp表达盒切除，并用去磷酸化酶处理，利用t4连接酶反应连接上dsred表达盒，所构建的载体命名为pk7wg2d-dsred。

用限制性内切酶hindⅲ和speⅰ将pk7wg2d上gfp表达盒以及35s启动子切除，利用t4连接酶反应连接上phaseolin启动子，为pk7wg2d-pha；再用限制性内切酶hindⅲ将pk7wg2d-pha切开，并用去磷酸化酶处理，利用t4连接酶反应连接上dsred表达盒，所构建的载体命名为pk7wg2d-pha-dsred。

利用lr酶将pgw-mcs+fad2分别与上述pk7wg2d-dsred和pk7wg2d-pha-dsred进行lr反应，经过spec抗性筛选，得到的植物表达载体命名为pk7wg2d-dsred+fad2和pk7wg2d-pha-dsred+fad2。

实施例2：农杆菌介导的拟南芥atfad2在野生型和多种突变体中转化

1、植物材料准备

本试验所用拟南芥为野生型col-0，rdr6-11、sgs3-14、mos2-2、dcl2-1、dcl4-2t、dcl1-9和ago1-25单突变体，dcl2-1/dcl4-2t双突变体。拟南芥种子在4℃的环境下放置2-4天进行同步化处理后，在人工控制培养室的培养，生长条件为：温度条件为22℃，光周期是16小时光照/8小时黑暗，光强是100-130μem^-2s^-1。

2、利用极速冻融法将上述pk7wg2d-dsred+fad2和pk7wg2d-pha-dsred+fad2表达载体转化入农杆菌(gv3101菌株)。

3、在拟南芥盛花期，利用花序浸染法对拟南芥及其他突变体进行遗传转化，将pk7wg2d-dsred+fad2载体转化到col-0植株中，将pk7wg2d-pha-dsred+fad2转化到野生型col-0以及rdr6-11、sgs3-14、mos2-2、dcl2-1、dcl4-2t、dcl2-1/dcl4-2t、dcl1-9和ago1-25单双突变体中。收集fad2基因转化得到拟南芥种子于1.5ml离心管，可在绿色光(激发波长为543nm)的条件下，激发出红色荧光。透过红色的滤光片，相对于未转化的野生型植株col-0来说，可以通过肉眼观察到阳性转化种子发出的红色荧光，依据此可以筛选出t1代转基因种子。将t1代种子萌发，为t1代转基因植株，将其移至以蛭石、珍珠岩、泥炭为基质的盆钵中，让其在培养室中继续生长至收获，为t2代种子。各不同遗传背景下获得的t2代种子，分别编号命名为col-0株系1、株系2直至标记完所有株系，所有株系均为随机获得的独立转基因系；如col-0背景的t2代种子标记为col-0株系1、col-0株系2…col-0株系n。突变体背景下转基因的t2代种子编号类似于col-0。根据所用启动子的不同，35s启动子载体的转化株系命名为35s:fad2,phaseolin启动子载体转化的株系命名为pphaseolin：fad2。无特殊注明外，均表示phaseolin启动子载体转化。转化的背景材料标注在斜线后，如在rdr6-11背景转化，标注为/rdr6-11。

实施例3：种子脂肪酸成分分析

1、植物及种子材料准备

挑选t1代和t2代种子中带有荧光的种子，用于脂肪酸分析。

2、种子脂肪酸分析

将t1或t2代阳性种子在自然光下通风干燥直至重量不发生变化。对(poirieretal.,plantphysiol,1999，121(4):1359-1366.)方法进行改进，对拟南芥种子脂肪酸进行提取与分析。改进后方法如下：

对于t1带种子，取一粒种子并加入100μl1m浓硫酸甲醇溶液提取液，随后放于的水浴进行脂肪酸提取并进行酯化反应，待其冷却至室温后，加入100μl0.9％nacl(w/v)终止反应，接着加入50μl正己烷，振荡混匀之后2300rpm离心3min提取脂肪酸甲酯，用移液器小心吸取上层的有机相，置于已用正己烷润洗过的hplc进样瓶中，用于脂肪酸组分的气相色谱分析，方法同前。

对于t2代种子，取10粒种子并加入200μl1m浓硫酸甲醇溶液提取液，随后放于的水浴进行脂肪酸提取并进行酯化反应，待其冷却至室温后，加入200μl0.9％nacl(w/v)终止反应，接着加入100μl正己烷，后面步骤同上。

根部样本取自40天植株的整个根，加入200μl1m浓硫酸甲醇溶液提取液，随后放于的水浴进行脂肪酸提取并进行酯化反应，待其冷却至室温后，加入200μl0.9％nacl(w/v)终止反应，接着加入100μl正己烷，后面步骤同上。在col-0背景下利用35s启动子在根部过表达fad2的结果见说明书附图3a。

在col-0野生型、rdr6-11、sgs3-14、mos2-2、dcl2-1、dcl4-2t、dcl2-1/dcl4-2t、dcl1-9和ago1-25突变体背景下过表达fad2的结果分别见说明书附图1、4、6、7、8、9、10、11和12。多不饱和脂肪酸含量(18:2+18:3)或者是多不饱和脂肪酸与单不饱和脂肪酸的比值((18:2+18:3)/18:1)与对照相比提高，说明这些遗传因子参与了fad2共抑制。同时也证明，利用这些突变体或它们的沉默株系结合fad2的过表达，可以用来提高种子中多不饱和脂肪酸的含量。

实施例4：基因表达分析

1、植物材料准备

将t1代种子萌发，为t1代转基因植株，将其移至以蛭石、珍珠岩、泥炭为基质的盆钵中，让其在培养室中继续生长至开花。在花期标记拟南芥开花时间，开花后12-14天收获种子，即为发育中的拟南芥种子；没有标记的花结出的种子待成熟后收获。

2、拟南芥种子中rna提取与反转录方法同表达载体构建中方法。

3、基因表达分析

利用takara试剂盒(codedrr820a)在abiquantstudio7flex实时荧光定量pcr系统上进行基因表达分析。所用引物如下：

内源fad2分析引物：

qendo-f：cttcttcttcgtagggtg

qendo-r：tgtttctggagatggagc

总fad2分析引物：

qtotal-f：cggaaaccgacaccacaaa

qtotal-r：ttcagatctcccaccgagaaa

内参tubulin引物：

qtub-f：tttgtgctcatcttgccacggaac

qtub-r：ctcaagaggttctcagcagtacc

在fad2转野生型col发育种子中、根系中以及在fad2转rdr6发育种子中内源fad2和内外源总fad2的表达分析结果见说明书附图2b、3b和5b。内源和总fad2表达的降低(附图2b和3b)说明了fad2转基因产生了共抑制现象；内源和总fad2表达在rdr6突变体中大幅度提高(图5b)，说明rdr6参与了fad2的rna沉默，同时也说明，利用rdr6突变体或其沉默株系可以有效表达fad2。

定量参数设定：95℃预变性2min，然后进行以下循环；94℃变性15sec，60℃退火和延伸1min，共进行40个循环，最后65-95℃制备溶解曲线。

以上结合附图详细描述了本公开的优选实施方式，但是，本公开并不限于上述实施方式中的具体细节，在本公开的技术构思范围内，可以对本公开的技术方案进行多种简单变型，这些简单变型均属于本公开的保护范围。

另外需要说明的是，在上述具体实施方式中所描述的各个具体技术特征，在不矛盾的情况下，可以通过任何合适的方式进行组合，为了避免不必要的重复，本公开对各种可能的组合方式不再另行说明。

此外，本公开的各种不同的实施方式之间也可以进行任意组合，只要其不违背本公开的思想，其同样应当视为本公开所公开的内容。

核苷酸序列表电子文件

<110>西北农林科技大学

<120>一种提高植物多不饱和脂肪酸的方法

<141>

<160>

<210>1

<211>1196

<212>氨基酸

<213>rdr6

<220>

<223>

<400>1

1mgsegnmkksvvtqvsiggfgesttakqltdyledevgivwrcrlktswt

51ppgsypnfeiadtsnipsideykkvephafvhfavfesagramdaagqcn

101lildgqplkvslgpknpyslnqrrrttvpyklagitleigtlvsrddffv

151swraegvdflvdpfdntckfcfrkstafsfkdavmhavincdyklellvr

201diqtvrqyktlhgfvlilqlassprvwyrtadddiydtvpgdllddddpw

251irttdftqvgaigrchsyrvlispryenklrtaldyfrmrrvqeervrwp

301prirnepcfgepvsdhffcihhkegisfeimflvnsvlhrgvfnqfqlte

351rffdllrnqpkdvniaslkhlctykrpvfdaykrlklvqewiqknpkllg

401sheqsediseirrlvitptrayclppevelsnrvlrrykavaerflrvtf

451mdesmqtinsnvlsyfvapivkdltsssfsqktyvfkrvksiltdgfklc

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