本发明属于细胞生物学领域，具体涉及一种基于蛋白质错误折叠的用于抗氧化药物筛选的细胞模型的构建方法。
背景技术
蛋白质是生物体内一切功能的执行者。人体内的任何功能，从催化化学反应到抵御外来侵略都是蛋白质作用的结果。蛋白必须精确折叠成为正确的三维结构，才能在人类细胞中执行功能。近年发现蛋白质的错误折叠可以导致一些疾病。蛋白质的错误折叠与疾病的关系已成为分子生物学新的研究前沿。构建一种简单、安全、高效的药物筛选细胞模型是解决当前国际上流行的神经退行性疾病如阿尔兹海默症、帕金森病及遗传性骨病、苯丙酮尿症等蛋白质错折叠疾病防治的瓶颈与难点。
在药物筛选过程中，药筛模型的模型构建是最初的也是最重要的一个环节，对于新药发现的效率和效果起着至关重要的作用。高通量筛选(high-throughputscreening,hts),是在组合化学、基因组学、药理学等学科推动下出现的一项高效率大规模药物筛选技术。hts主要分为基于单纯靶标(靶蛋白得到分离纯化,在细胞外环境下进行)的筛选和基于细胞模型的筛选。基于单纯靶标(细胞外)的筛选必须在确切知道作用靶标并且作用靶蛋白能分离纯化的条件下才能进行,在此模型上进行的药物筛选作用机制明确,靶标单一。基于细胞的筛选是在细胞模型上进行,特别适用于功能蛋白难以分离、生化分析不能完成的复杂靶标，基于细胞模型的高通量筛选是今后高通量筛选的主要筛选模型。
多发性骨骺发育不良（med）是一种的罕见的遗传性软骨发育不良疾病，由于软骨细胞外基质蛋白（例如，软骨寡聚基质蛋白；comp）及细胞膜转运蛋白等的缺陷所造成的全身性骨骼发育异常，属于蛋白质的错误折叠所引起的疾病之一。正常人体内的comp蛋白会分泌到细胞外，行使正常的功能，而对于med患者，comp基因发生突变，突变的comp蛋白沉积在软骨细胞的粗面内质网上，使错误折叠的蛋白在内质网上大量堆积，不能正常分泌和转运，引发内质网应激反应，最终导致软骨细胞的凋亡和细胞的增殖速率降低，从而诱发疾病的发生。
目前的研究发现，在compd469del突变的小鼠模型中，抗氧化剂和抗炎症药物能有效减少软骨细胞的上comp蛋白的积累，尤其是乙酰水杨酸（阿司匹林）和白藜芦醇药物，从而营救了突变小鼠的骨骼发育异常，该突变的小鼠模型会导致严重的假性软骨发育不全（psach），但对于研究comp突变导致的med疾病还存在一定的局限性。
技术实现要素：
本发明针对蛋白质错折叠目前无法在活体细胞内实时定量评估的缺陷，提供了一种基于蛋白质错误折叠的用于抗氧化药物筛选的细胞模型的构建方法。
本发明由如下技术方案实现的：一种基于蛋白质错误折叠的用于抗氧化药物筛选的细胞模型的构建方法，采用分子生物学基因重组技术构建荧光蛋白标记的野生和突变报告基因comp基因慢病毒载体，在人胚肾293t细胞中包装病毒，转导hela细胞，嘌呤霉素筛选获得稳定表达comp蛋白的细胞模型。
具体步骤如下：
（1）用携带抗生素抗性基因、报告基因、目的基因的慢病毒载体转染人胚肾293t细胞，获得抗性基因和报告基因的慢病毒颗粒；
（2）用步骤（1）获得的慢病毒颗粒感染人宫颈癌hela细胞，抗生素筛选获得细胞模型；
其中：所述慢病毒载体为hiv-1载体系统，包括三种质粒：表达报告基因的plvx-ires-puro质粒、包装质粒pspax2、包膜蛋白质粒pmd2.g，其中plvx-ires-puro质粒含有嘌呤霉素抗性基因和氨苄青霉素抗性基因，包装质粒pspax2包含有hiv病毒的gag基因，包膜蛋白质粒pmd2.g包含有单纯疱疹来源的vsv-g基因；所述抗生素为嘌呤霉素；所述报告基因为egfp-comp融合基因；所述目的基因为野生型comp基因和突变型comp基因p.d401n。
具体筛选评估方法为：用抗氧化药物作用细胞模型，激发波长485nm、发射波长530nm条件下检测egfp的荧光强度，测定gfp含量，用细胞裂解液的吸光度与细胞培养基的吸光度的比值来表示comp蛋白在细胞内的滞留情况，通过检测评估稳定表达野生型和突变型comp基因的细胞模型中comp蛋白的含量，评估抗氧化药物的效果。
所述抗氧化药物为乙酰水杨酸asa和白藜芦醇res，其中乙酰水杨酸的浓度为75mm，白藜芦醇的浓度为100μm，药物作用细胞模型的时间为24h。
本发明建立了一套comp单碱基突变的细胞模型，利用抗氧化剂乙酰水杨酸和白藜芦醇作用细胞模型，通过测定egfp的荧光强度，可有效评估抗氧化剂的作用效果。
本发明基于目前在药物筛选的过程中将错折叠导致遗传性骨病的comp蛋白作为研究靶标，针对蛋白质错折叠目前无法在活体细胞内实时定量评估的缺陷，采用分子生物学基因重组技术构建含有可用于实时定量追踪检测的荧光蛋白标记的野生和突变报告基因作为筛选标记，然后分别将重组载体转入体外培养的细胞系中使之稳定表达得到药物筛选细胞模型。使用荧光分光光度计技术作为分子水平的定量检测手段，对那些可以改变蛋白质折叠和分泌水平的小分子在细胞水平上进行筛选，将功能反应作为筛选指标，建立一个具有国际水平、自主创新的药物筛选细胞模型，进行蛋白质错折叠疾病药物筛选的研究。本发明不仅能为今后的蛋白质错折叠药物筛选产业化研究提供关键参数，并且为解决我国重大疾病的可持续性研究提供相关科学依据。所述的细胞模型具有高染色体整合度、高荧光强度、遗传性状稳定且对抗氧化药物敏感的特点，是一种理想的研究蛋白质错误折叠药物筛选的模型。
附图说明
图1为病毒表达载体plvx-ires-puro示意图；图2为慢病毒包装质粒pspax2示意图；图3为慢病毒包膜蛋白质粒pmd2.g示意图；图4为流式细胞术分析细胞模型的阳性率；图5为野生型和突变型comp的含量比较；图6为乙酰水杨酸作用细胞模型的最适浓度和最佳时间；图7为白藜芦醇作用细胞模型的最适浓度和最佳时间。
具体实施方式
本发明人经过长期的研究和筛选，构建了一种对抗氧化药物敏感的可稳定表达慢病毒载体携带的comp基因的细胞模型。该细胞模型是一种理想的研究抗氧化药物筛选的模型。
本发明提供了一种基于蛋白质错误折叠的用于抗氧化药物筛选的细胞模型的构建方法。一种新的可表达慢病毒载体携带的抗生素抗性基因和报告基因的人宫颈癌细胞模型，能用于抗氧化药物筛选。
本发明通过构建comp基因慢病毒载体，在293t细胞中包装病毒，转导hela细胞，嘌呤霉素筛选到稳定表达comp蛋白的细胞模型，随后利用抗氧化药物乙酰水杨酸和白藜芦醇作用细胞模型，通过评估突变型细胞内comp的含量，得到抗氧化药物的最适作用浓度和时间。
实施例1：包装慢病毒颗粒
慢病毒系统包括三种质粒：表达报告基因的plvx-ires-puro质粒（图1）、包装质粒pspax2（图2）、包膜蛋白质粒pmd2.g（图3）。其中plvx-ires-puro质粒含有嘌呤霉素抗性基因和氨苄青霉素抗性基因，包装质粒pspax2包含有hiv病毒的gag基因，编码病毒的主要结构蛋白，包膜蛋白质粒pmd2.g包含有单纯疱疹来源的vsv-g基因，提供病毒包装的所需的包膜蛋白。
报告基因构建：用已知还有egfp-comp融合基因的质粒为模板，进行聚合酶链式反应扩增目的片段（takara公司），试剂盒回收目的片段（上海生工生物工程有限公司），酶切目的片段和载体利用t4dnaligase连接，常温过夜，连接产物用于转化实验，构建完成的质粒经菌液pcr和酶切鉴定后，上海生工生物工程有限公司进行测序鉴定。
慢病毒的包装：转染前24h将293t细胞铺于25t的培养瓶中，待细胞贴壁生长至80%左右，更换成无抗生素的dmem的培养液（10%胎牛血清）；b.取无菌1.5mlep管加入opti-mem233.5μl，fugene®6transfectionreagent16.5μl，轻柔混匀，室温孵育5min，另取无菌1.5mlep管加入opti-mem250μl、pmd2.g质粒0.5μg、pspax2质粒2.5μg、重组质粒comp-plvx-ires-puro2.5μg以及孵育后的转染试剂，轻柔混匀，室温孵育20min后，均匀加入到25t的培养瓶中并摇匀，于37℃（5%co2）的培养箱中培养；c.48h后收集细胞培养上清液，加入新鲜的培养液，继续培养；72h后继续收集细胞培养上清液，将两次收集的上清液于3000g离心10min，沉淀细胞碎片，收集上清，用0.45μm滤器过滤除菌，分装后于-80℃保存备用；
实施例2：病毒转导hela细胞
收集的上清中含有重组comp的慢病毒，利用包装后的病毒进一步转导hela细胞，筛选稳定转染的细胞株，具体操作如下：
转导前24h将hela细胞铺于6孔板中，待细胞贴壁生长至80%左右，吸去旧的培养基，加入新鲜的mem的培养基（10%胎牛血清，1%penicillin-streptomycin）1.8ml、重组comp的慢病毒200μl以及hexadimethrinebromide（转染增强剂）1.6μl，轻柔混匀后，于37℃5%co2的培养箱中培养；
24h后吸去含病毒的培养基，更换新鲜的培养基2ml，继续培养；
48h后更换培养基，加入新鲜的培养基2ml的同时加入puromycin（2μg/ml）；
之后每3-4天更换一次培养基（含puro），直到筛选到稳定的单克隆细胞。
通过流式细胞术分析，转导后的hela细胞的阳性率达到99%以上（图4），细胞模型可用于后期的药物筛选研究。
实施例3：利用荧光分光光度计评估细胞模型的细胞内comp含量
在稳定转染的hela细胞系中，comp蛋白和egfp是融合表达，所以可以通过检测gfp的含量，来间接反映comp蛋白的含量。
我们利用caryeclipsefluorescencespectrophotometer（agilenttechnologies）检测gfp的含量，初期探索发现gfp当激发波长485nm，发射波长530nm时，最能反映gfp的相对荧光强度。
我们收集野生型和突变型的细胞以及细胞培养液，用tris-edta溶液稀释后，利用caryeclipsefluorescencespectrophotometer（agilenttechnologies）测量gfp荧光强度，结果分析采用细胞内的gfp与细胞培养液中gfp的比值来表示细胞内comp的变化情况。
结果表明：突变型comp的gfp含量比值明显高于野生型comp，说明突变型comp在细胞内gfp的含量（即comp的含量）高，突变comp蛋白在细胞内发生滞留（图5）。
实施例4：利用抗氧化药物作用细胞模型，评估突变型细胞内comp的含量
药物处理前24h将细胞均匀的铺于24孔板中（20×104cell/well），待细胞贴壁生长至80%左右，更换新鲜的无血清的培养液，以不同的时间梯度或者不同浓度药物处理细胞，待细胞处理后，收集细胞培养液以及细胞的总蛋白，之后取收集的细胞培养液100μl用tris-edta（ph8.0）稀释10倍，取细胞裂解液50μl用tris-edta（ph8.0）稀释20倍；用caryeclipsefluorescencespectrophotometer（agilenttechnologies）测定gfp含量（激发波长485nm，发射波长530nm），用细胞裂解液的吸光度与细胞培养基的吸光度的比值来表示comp蛋白在细胞内的滞留情况，以此来说明药物处理后是否对滞留的comp有影响，每组实验三个独立重复，显著性差异用spss17分析。
经文献考证，在comp突变的小鼠模型中，抗氧化剂乙酰水杨酸（asa）和白藜芦醇（res）能够减少突变comp在细胞内的滞留、降低软骨细胞的死亡以及恢复软骨细胞的增殖[poseykl,etal.antioxidantandanti-inflammatoryagentsmitigatepathologyinamousemodelofpseudoachondroplasia.hummolgenet,2015,24(14),3918-28.]，所以我们利用这两种药物处理我们建立的comp细胞模型。
1.利用乙酰水杨酸（asa）处理细胞模型，设置浓度依次为1、5、10、25、50、75、100mm的乙酰水杨酸药物处理comp细胞模型24h后，利用caryeclipsefluorescencespectrophotometer（agilenttechnologies）检测gfp的含量，结果如图6a所示，不同浓度的asa药物对野生型comp细胞几乎不产生影响，而对于突变型comp细胞，低浓度时，细胞内的gfp的含量升高，随着浓度的增大，10mm之后细胞内的gfp含量开始降低，在75mm和100mm时，细胞内gfp的含量趋于平稳，表明在药物浓度在75-100mm时对突变型comp细胞很好的作用效果。
为了进一步探索asa作用细胞的最适时间，我们选取75mm的asa作用细胞模型，设置不同的时间梯度，结果如图6b，随着时间延长，asa药物对野生的细胞在作用12h时明显降低，之后变化不明显，可能是由于药物在12h对蛋白的分泌有一定的促进作用，而突变的细胞在药物作用12h和24h时，明显降低，即细胞内的滞留减少，而之后的变化又有所升高，结果表明：75mm的asa药物作用24h时，对突变的细胞有很好的作用效果。
2.我们利用抗氧化剂白藜芦醇处理细胞模型，首先探索药物作用细胞的最适浓度。我们设置不同浓度的res药物处理comp细胞模型48h后，利用caryeclipsefluorescencespectrophotometer（agilenttechnologies）检测gfp的含量。结果如图7a所示，不同浓度的res药物对野生型comp细胞几乎不产生影响，而对于突变型comp细胞，低浓度时，对细胞内的gfp的含量有所升高，但是随着浓度的增大，25μm之后细胞内的gfp含量开始降低，在100μm之后，细胞内gfp的含量趋于平稳，表明在药物浓度在100μm时对突变型comp细胞有很好的作用效果。
为了进一步探索res作用细胞的最适时间，我们选取100μm的res作用细胞模型，设置不同的时间梯度，结果如图7b所示，随着时间延长，res药物对野生的细胞作用不明显，而突变的细胞在药物作用24h时，明显降低，即细胞内的滞留减少，而之后的变化不明显，结果表明：100μm的res药物作用24h时，对突变的细胞有很好的作用效果。
本发明涉及到的多个方面已做如上阐述。然而，应理解的是，在不偏离本发明精神的前提下，本领域专业人员可对其进行等同改变和修饰，所述改变和修饰同样落入本申请所附权利要求的覆盖范围。