一种灵芝菌糠中总三萜和多糖的综合提取方法与流程

本发明涉及一种灵芝菌糠中总三萜和多糖的综合提取方法，属于农副产品精深加工的技术领域。

背景技术

近年来，灵芝生产技术日趋成熟，基本实现了室内栽培和工厂化栽培。随着袋栽灵芝逐年增加，每年有大量的灵芝菌糠被废弃，不仅造成了周围环境的污染，还造成了资源的严重浪费。灵芝中最主要的药理活性物质为灵芝三萜和多糖，灵芝三萜和多糖不仅存在于子实体中，同时也存在于灵芝菌糠的菌丝体中。灵芝三萜类化合物具有保肝、抗hiv-1及hiv-1蛋白酶活性、抗组胺释放、抑制血管紧张素等作用。灵芝多糖具有免疫调节、抗肿瘤、抗氧化、抗衰老和降血糖等生物活性。

虽然灵芝三萜的药理作用极强，但其含量较低，且灵芝菌糠结构坚硬、致密，使用传统的提取条件，如回流、浸提等提取时间长，溶剂量大，三萜提取率较低。灵芝总三萜类成分提取一般采用乙醇作为溶剂，超声波清洗器超声辅助提取或微波提取，随着提取时间延长溶剂温度变高，有机溶剂会大量挥发，甚至影响的三萜结构变化。

多糖的提取方法包括水提法、酶法、超声法、微波法等。溶剂浸提法具有操作简单、设备要求低的特点，故常被采用。其介质包括酸、碱、热水、乙醇等，但因为稀酸、稀碱条件下，易使多糖发生糖苷键断裂，部分多糖发生水解而使多糖的提取率减少，同时导致多糖立体结构破坏及生物活性改变，且提取液需中和，程序繁琐。因此相对而言，热水浸提法是提取多糖最常用的一种浸提方法，操作简单，耗间长且能耗高，多糖提取率不高。

目前，对灵芝菌糠二次利用的研究相对较少，对灵芝菌糠综合提取灵芝三萜和多糖尚未见报道。

技术实现要素：

发明目的：针对现有技术中存在的问题，本发明提供了一种灵芝菌糠中总三萜和多糖的综合提取方法，灵芝菌糠得到了充分的开发利用，避免了资源浪费和环境污染，变废为宝，不仅提取率高，还大大缩短了时间，耗能低，工艺简单。

技术方案：

一种灵芝菌糠中总三萜和多糖的综合提取方法，包括：

(1)将灵芝菌糠粉碎后加入乙醇，采用超声波细胞破碎仪进行超声提取，超声提取后离心，得滤渣和清液；

(2)对步骤(1)所得清液浓缩后用氯仿进行萃取，氯仿层减压蒸发浓缩至膏状，回收氯仿；

(3)步骤(2)得到的膏状物用乙醇洗下，然后挥干乙醇，得灵芝菌糠的总三萜；

(4)对步骤(1)所得滤渣用水浸提，浸提结束后过滤，得滤液；

(5)滤液浓缩后加入乙醇进行沉淀，取沉淀进行除盐干燥后，粉碎得灵芝菌糠多糖。

本发明以灵芝菌糠作为提取原料，选择菌丝洁白无污染的出菇采摘后的灵芝菌袋，去除外袋，即为灵芝菌糠。

为使有效成分充分浸出，对所述灵芝菌糠先进行粉碎，一般粉碎至可过20目筛。

粉碎后进行超声提取，所述超声提取的条件为：超声波功率为520～585w，优选为520w，提取时间为3～10min，优选为3～5min，更优选为5min，单次辐射时间为4s/5s～8s/5s，优选为6s/5s，提取料液比(g/ml)为1：15～20，优选为1:20，乙醇的浓度为75～85％，优选为75％。

超声提取后离心，离心的转速为2000～3000r/min，时间为5～10min。

离心后得滤渣和清液，所述清液采用减压蒸发的方法进行浓缩，回收乙醇，其中，减压蒸发的真空度为0.07～0.095mpa，温度为40～50℃。

清液浓缩后用等体积氯仿进行萃取，一般萃取2～3次，氯仿层减压蒸发的真空度为0.07～0.095mpa，温度为40～50℃。

步骤(4)中，滤渣用水浸提的条件为：温度为80～90℃，优选为80℃，提取时间30～40min，优选为30min，料液比为1:15～20，优选为1:15，浸提结束后降温至40～50℃过滤，得滤液。

所述滤液采用减压蒸发浓缩或常压蒸发浓缩，使滤液浓缩(一般浓缩至原体积1/5～1/10)后加入上述回收的乙醇至乙醇浓度达80％后进行沉淀，所述沉淀的时间为6～24小时；其中减压浓缩的真空度为0.07～0.095mpa，温度为60～80℃，常压蒸发浓缩温度为90～100℃。

所述除盐干燥的方法为：将所述沉淀加水溶解后进行超滤或透析，分子截留量为5～10kd，得截留液，截留液于50～70℃减压干燥或冷冻干燥至含水量低于4％，即得灵芝菌糠多糖。

有益效果：

1、本发明开发利用了灵芝菌糠，使灵芝菌糠得到了充分的开发利用，减少环境污染，避免了资源浪费，将其变废为宝。

2、本发明采用灵芝菌糠代替子实体提取多糖，大大的降低了生产灵芝多糖成本，提升产品竞争力。

3、本发明设计的灵芝菌糠中总三萜和多糖的综合提取工艺，大大缩短了提取时间，耗能低，工艺简单，总三萜和多糖提取率高。超声波细胞破碎仪超声波提取灵芝菌糠中总三萜提取时间仅3-5min，传统的超声波清洗器超声波提取时间一般为30-60min；超声波辅助热水提取灵芝菌糠中多糖提取时间30-40min，传统的热水提取时间一般为60-120min，本工艺大大缩短了提取时间，减少能耗。通过超声波辅助提取灵芝菌糠中总三萜提取率为(0.98±0.16)％，传统超声波清洗器超声波提取其总三萜提取率为(0.65±0.02)％，比超声波清洗器提取总三萜的提取率高1.51倍。通过超声波辅助提取灵芝菌糠中多糖提取率为(2.61±0.32)％，传统热水提取灵芝菌糠多糖平均提取率为(1.65±0.04)％，比热水提取灵芝菌糠多糖的提取率高1.58倍。

4、本发明以超声波辅助提取灵芝菌糠中的总三萜和多糖，找到灵芝菌糠中总三萜及多糖超声波法最佳综合提取工艺，为灵芝菌糠综合开发利用提供技术支持和理论依据。

附图说明

图1为乙醇浓度对灵芝菌渣总三萜提取率的影响；

图2为超声波提取时间对灵芝菌渣总三萜提取率的影响；

图3为超声波提取功率对灵芝菌渣总三萜提取率的影响；

图4为超声波单次辐射时间对灵芝菌渣总三萜提取率的影响；

图5为料液比对灵芝菌渣总三萜提取率的影响；

图6为热水提取温度对灵芝菌渣多糖提取率的影响；

图7为热水提取时间对灵芝菌渣多糖提取率的影响；

图8为热水提取料液比对灵芝菌渣多糖提取率的影响；

图9为灵芝菌糠中总三萜和多糖的综合提取工艺路线图。

具体实施方式

下面结合具体实施例，进一步阐明本发明，应理解这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围，在阅读了本发明之后，本领域技术人员对本发明的各种等价形式的修改均落于本申请所附权利要求所限定的范围。

实施例1：

1)挑选：对出菇采摘后灵芝菌袋进行挑选，选择菌丝洁白无污染灵芝菌袋；

2)粉碎：将步骤1)灵芝菌袋去除外袋，并将灵芝菌糠粉碎，过20目筛；

3)超声波法提取：将步骤2)的粉碎菌糠中加入20倍菌糠重量的75％乙醇，在常温常压下采用超声波细胞破碎仪进行超声波法提取，超声波功率为520w，提取时间为5min，单次辐射时间6s/5s，将得到的物料备用。

4)离心：将步骤3)的物料离心，转速3000r/min，时间为5min，得滤渣和清液。

5)浓缩：将步骤4)所述的清液进行减压蒸发，真空度为0.07-0.095mpa，温度为40-50℃，回收乙醇，得浓缩液。

6)萃取：将步骤5)所述的浓缩液进行萃取，加等体积氯仿，萃取3次，合并氯仿层。

7)浓缩：将步骤6)所述的氯仿层进行减压蒸发，真空度为0.07-0.095mpa，温度为40℃，回收氯仿，浓缩至膏状。

8)洗涤挥干：将步骤7)的膏状物倒出，用少量无水乙醇清洗瓶内壁并倒出，70℃水浴挥干乙醇，得灵芝菌糠的总三萜。超声波法提取灵芝菌糠中总三萜提取率为1.02％。

9)热水法提取：将步骤4)所述的滤渣，加入15倍滤渣重量的水，热水提取温度为80℃，提取时间40min，将得到的物料备用。

10)过滤：将步骤9)的物料降温至40-50℃，过滤，弃去滤渣，取滤液备用；

11)浓缩：将步骤10)所述的滤液进行浓缩，采用常压蒸发浓缩，温度为100℃，使提取液浓缩至原体积1/6，得灵芝菌糠多糖粗提浓缩液；

12)醇沉分离：在步骤11)所述的灵芝菌糠多糖粗提浓缩液中缓缓加入步骤5)中回收的乙醇，不断搅拌，至乙醇浓度达80％，静置沉淀6-24小时后，吸去上清液至原体积1/8，下部液体进行离心分离，上清液用步骤5)方法回收乙醇，沉淀即为灵芝菌糠粗多糖；

13)除盐：将步骤12)所述的沉淀加少量水充分溶解，进行超滤，分子截留量为5-10kd，得截留液。

14)干燥：在步骤13)所述的截留液60℃减压干燥，至含水量低于4％，粉碎即得灵芝菌糠多糖，提取率为2.81％。

实施例2：

1)挑选：对出菇采摘后灵芝菌袋进行挑选，选择菌丝洁白无污染灵芝菌袋；

2)粉碎：将步骤1)灵芝菌袋去除外袋，并将灵芝菌糠粉碎，过20目筛；

3)超声波法提取：将步骤2)所述的粉碎菌糠中加入15倍菌糠重量的75％乙醇，在常温常压下采用超声波细胞破碎仪进行超声波法提取，超声波功率为585w，提取时间为3min，单次辐射时间6s/5s，将得到的物料备用。

4)离心：将步骤3)中物料离心，转速3000r/min，时间为5min，得滤渣和清液。

5)浓缩：将步骤4)所述的清液进行减压蒸发，真空度为0.07-0.095mpa，温度为40-50℃，回收乙醇，得浓缩液。

6)萃取：将步骤5)所述的浓缩液进行萃取，加等体积氯仿，萃取3次，合并氯仿层。

7)浓缩：将步骤6)所述的氯仿层进行减压蒸发，真空度为0.07-0.095mpa，温度为40℃，回收氯仿，浓缩至膏状。

8)洗涤挥干：将步骤7)所述的膏状物倒出，用少量无水乙醇清洗瓶内壁并倒出，70℃水浴挥干乙醇，用得灵芝菌糠的总三萜，提取率为1％。

9)热水法提取：将步骤4)所述的滤渣，加入20倍滤渣重量的水，热水提取温度为90℃，提取时间30min，将得到的物料备用。

10)过滤：将步骤9)中物料降温至40-50℃，过滤，弃去滤渣，取滤液备用；

11)浓缩：将步骤10)所述的滤液进行浓缩，采用常压蒸发浓缩，温度为100℃。使提取液浓缩至原体积1/10，得灵芝菌糠多糖粗提浓缩液；

12)醇沉分离：在步骤11)所述的浓缩液中缓缓加入步骤5)中回收的乙醇，不断搅拌，至乙醇浓度达80％，静置沉淀24小时后，吸去上清液至原体积1/10，下部液体进行离心分离，上清液用步骤5)方法回收乙醇，沉淀即为灵芝菌糠粗多糖；

13)除盐：将步骤12)所述的沉淀加少量水充分溶解，进行透析，分子截留量为5-10kd，得截留液。

14)干燥：在步骤13)所述的截留液冷冻干燥，至含水量低于4％，即得灵芝菌糠多糖，提取率为2.68％。

实施例3

一、乙醇浓度对灵芝菌渣总三萜提取率的影响

准确称取5.00g灵芝菌渣，共3份，分别加入50ml乙醇溶液，乙醇浓度分别为65％、75％、85％、95％。提取功率为60％，单次辐射时间为6.0s/5.0s，在常温下超声提取20min。然后冷却至室温，摇匀，用滤纸过滤得提取液，取滤液，定容至100ml，溶液待测。

由图1可知，在65％至95％乙醇浓度范围内，灵芝菌渣总三萜提取率逐渐增加到最高点后缓慢递减，在乙醇浓度75％、85％时灵芝菌渣总三萜提取率达到最高，分别为0.66％、0.65％，两者差异不显著(p＜0.05)。为了节省试剂的用量，选择75％为最佳乙醇浓度。

二、超声波提取时间对灵芝菌渣总三萜提取率的影响

准确称取5.00g灵芝菌渣，共3份，分别加入50ml的75％乙醇溶液。提取功率为390w，单次辐射时间为6.0s/5.0s，在常温下分别超声提取3、5、8、10min。然后冷却至室温，摇匀，用滤纸过滤得提取液，取滤液，定容至100ml，溶液待测。

由图2可知，在提取时间5min、8min、10min时，灵芝菌渣总三萜提取率没有显著差异(p＜0.05)。提取时间为5min时，灵芝菌渣总三萜提取率达到最高，为0.69％。为了节约时间，选择5min为超声波提取时间。

三、超声波提取功率对灵芝菌渣总三萜提取率的影响

准确称取5.00g灵芝菌渣，共3份，分别加入50ml的75％乙醇溶液。提取功率分别为325w、390w、455w、520w，单次辐射时间为6.0s/5.0s，在常温下超声提取5min。然后冷却至室温，摇匀，用滤纸过滤得提取液，取滤液，定容至100ml，溶液待测。

由图3可知，随着超声波提取功率增大灵芝菌渣总三萜提取率呈上升趋势。在提取功率为520w时，灵芝菌渣总三萜提取率最大，为0.81％。所以，选择520w为最佳超声波提取功率。

四、超声波单次辐射时间对灵芝菌渣总三萜提取率的影响

准确称取5.00g灵芝菌渣，共3份，分别加入50ml的75％乙醇溶液。提取功率80％(520w)，单次辐射时间为2.0s/5.0s、4.0s/5.0s、6.0s/5.0s、8.0s/5.0s，在常温下超声提取5min。然后冷却至室温，摇匀，用滤纸过滤得提取液，取滤液，定容至100ml，溶液待测。

由图4可知，在2s/5s至8s/5s单次辐射时间范围内，灵芝菌渣总三萜提取率逐渐增大至最高点后缓慢降低，在单次辐射时间6s/5s灵芝菌渣总三萜提取率达到最高点，为0.82％。所以，选择6s/5s为最佳超声波提取单次辐射时间。

五、料液比对灵芝菌渣总三萜提取率的影响

准确称取5.00g、3.33g、2.50g、2.00g灵芝菌渣，共3份，分别加入50ml的75％乙醇溶液，料液比分别为1:10(g/ml)、1:15(g/ml)、1:20(g/ml)、1:25(g/ml)。提取功率80％(520w)，单次辐射时间为6.0s/5.0s。在常温下超声提取5min。然后冷却至室温，摇匀，用滤纸过滤得提取液，取滤液，定容至100ml，溶液待测。

由图5可知，在1:10(g/ml)至1:25(g/ml)料液比范围内，灵芝菌渣总三萜提取率逐渐上升至最高点后迅速下降，在料液比1:20时灵芝菌渣总三萜提取率上升至最高点，为0.82％。所以，选择1:20(g/ml)为最佳料液比。

六、热水提取温度对灵芝菌渣多糖提取率的影响

准确称取5.00g灵芝菌渣，共3份，超声波提取后，分别加入50ml的蒸馏水，在60℃、70℃、80℃、90℃水浴中加热提取1h，冷至室温，摇匀，用滤纸过滤得提取液，缓缓加入95％乙醇，使浓缩液与乙醇比例1:4(v/v)，静置过夜，离心，用蒸馏水溶解沉淀物，乙醇用60℃水浴挥尽，用50ml容量瓶定容，溶液待测。

由图6可知，在60℃至90℃热水提取温度范围内，灵芝菌渣多糖提取率缓慢上升，在热水提取温度80℃、90℃时多糖提取率达到最高，分别为1.42％、1.43％，两者没有显著差异(p＜0.05)。所以，为了减少能耗，选择80℃为热水提取温度。

七、热水提取时间对灵芝菌渣多糖提取率的影响

准确称取5.00g灵芝菌渣，共3份，超声波提取后，分别加入50ml的蒸馏水。在80℃水浴中加热提取15min、30min、45min、60min。冷至室温，摇匀，用滤纸过滤得提取液，缓慢加入95％乙醇，使浓缩液与乙醇比例1:4(v/v)，静置过夜，离心，用蒸馏水溶解沉淀物，乙醇用60℃水浴挥尽，用50ml容量瓶定容，溶液待测。

由图7可知，在15min至60min热水提取时间范围内，灵芝菌渣多糖提取率逐渐增加，到最高点后之间差异不显著(p＜0.05)，在热水提取时间30min时，灵芝菌渣多糖提取率达到最高点，为1.78％。所以，30min为最佳热水提取时间。

八、热水提取料液比对灵芝菌渣多糖提取率的影响

准确称取5.00g、3.33g、2.50g、2.00g灵芝菌渣，共3份，超声波提取后，分别加入50ml的蒸馏水，料液比分别为1:10(g/ml)、1:15(g/ml)、1:20(g/ml)、1:25(g/ml)。在80℃水浴中加热提取15min。冷至室温，摇匀，用滤纸过滤得提取液，缓慢加入95％乙醇，使浓缩液与乙醇比例1:4(v/v)，静置过夜，离心，用蒸馏水溶解沉淀物，乙醇用60℃水浴挥尽，用50ml容量瓶定容，溶液待测。

由图7可知，在1:10至1:25料液比范围内，灵芝菌渣多糖提取率逐渐增加至最高点后缓慢递减，在料液比1:15时灵芝菌渣多糖提取率达到最高点，为1.92％。所以，选择1:15为最佳热水提取料液比。

实施例4

提取溶剂为75％乙醇浓度，超声波单次辐射时间为6s/5s，料液比为1:20，其他方法同实施例1，考察超声波功率和提取时间两因素对灵芝菌渣总三萜提取率的影响。

表1灵芝菌渣中提取总三萜的两因素试验结果

由表1可知，超声波提取功率为520w、提取时间5min，超声波提取功率为585w、提取时间3min，超声波提取功率为585w、提取时间5min，灵芝菌渣总三萜提取率最高，分别为0.97％、0.99％、0.98％，三者之间没有显著差异(p＜0.05)。为了降低能耗，选择超声波提取功率为520w、提取时间5min或超声波提取功率为585w、提取时间3min为最佳工艺。

实施例5

提取溶剂为75％乙醇浓度，超声波单次辐射时间为6s/5s，料液比为1:20，其他方法同实施例1，根据表2变换超声波功率和提取时间两因素对灵芝菌渣总三萜进行提取，提取后菌渣进一步热水提取多糖，料液比1:15(g/ml)，根据表2变换热水提取温度和时间，考察超声波功率、提取时间以及热水提取温度、时间四因素对灵芝菌渣多糖提取率的影响。

表2灵芝菌渣中提取多糖的正交试验结果

通过表2直观分析可知，超声波提取灵芝菌渣多糖的最优提取工艺条件为a2b1c2d3，即超声波提取时间5min，超声波功率70％，热水提取温度80℃，热水提取时间40min。通过表2极差分析可知，各因素对灵芝菌渣多糖提取率的影响为：热水提取温度c>热水提取时间d>超声波提取时间a≥超声波功率b。超声波功率b对灵芝菌渣多糖提取率影响最小，考虑要提高灵芝菌渣中总三萜提取率，结合灵芝菌渣中总三萜两因素试验结果和多糖正交试验结果进行综合考虑，最佳提取工艺条件为a2b2c2d3，即超声波提取时间5min，超声波功率80％，热水提取温度80℃，热水提取时间40min。

因此，超声波提取灵芝菌渣中总三萜，最佳工艺为：乙醇浓度75％，超声波提取功率80％，提取时间5min，单次辐射时间6s/5s，料液比1:20(g/ml)；菌渣进一步热水提取多糖，热水提取温度80℃，提取时间40min，料液比1:15(g/ml)。