本发明属于医药技术领域，具体涉及一种含联苯结构的二芳基嘧啶类衍生物及其制备方法和用途。
背景技术
由人类免疫缺陷病毒(humanimmunodeficiencyvirus,hiv)感染所导致的艾滋病即获得性免疫缺陷综合征(acquiredimmunedeficiencysyndrome,aids)能够导致人体免疫缺陷并发一系列感染，是一种危害性极大的传染病。自1981年美国疾病控制中心(cdc)确认首例病例以来，已经造成3500多万人死亡。
逆转录酶(reversetranscriptase,rt)在hiv病毒复制的生命周期中起了关键的作用，负责病毒rna逆转录成dna-rna杂合体及杂合体中rna降解形成单链病毒dna，之后再由整合酶将病毒dna整合到宿主细胞，因此逆转录酶成为抗艾滋病药物设计的重要靶点之一。
在现有的靶向hiv-1逆转录酶化合物中，非核苷类逆转录酶抑制剂(nnrtis)具有较强的抗病毒活性和较低的细胞毒性。经美国fda批准上市的第二代抗hiv逆转录酶抑制剂依曲韦林(etravirine)、利匹韦林(rilpivirine)是高效抗逆转录病毒疗法(haart)的主要组成部分被用于艾滋病的临床治疗，具有较好的临床疗效。然而，逆转录酶上的氨基酸突变会使得原本有效的药物失去活性，即产生耐药hiv病毒株。因此研发具有广谱抗耐药性的新型高效非核苷类逆转录酶抑制剂成为药物化学家们研究的热点之一。
本发明旨在对依曲韦林及利匹韦林进行结构优化，通过联苯结构及嘧啶环上取代基来增强化合物与逆转录酶非核苷类药物的结合口袋内壁的保守芳香性氨基酸的π-π相互作用，以期能够提高这一系列化合物的抗耐药病毒株的生物活性。
技术实现要素：
本发明的目的在于提出一种hiv非核苷类逆转录酶抑制剂嘧啶类衍生物，具体涉及通式ⅰ所述含联苯结构的二芳基嘧啶类衍生物及其药用盐，其水合物和溶剂化物，其多晶和共晶，其同样生物功能的前体和衍生物。
本发明所提供的含联苯结构的二芳基嘧啶类衍生物，具有如下结构式：
其中，r1和r2分别独立选自氢、氰基、硝基、羟基、卤素、氨基，c3～6环烷氧基，c3～6环烷氨基，任选被取代的c1～6烷基，任选被取代的c2～6烯基，任选被取代的c2～6炔基或c1～6烷氧基，羧基，酯基，酰胺基，磺酰胺基；
x为-ch2-,-nh-,-o-,-s-,-s(o)-和-s(o)2-中一种链接基；
r3和r4分别独立选自氢，氰基，硝基，氨基，羟基，卤素，磺酸基，c1～6烷基，c1～6烷氧基，c3～6环烷基，c3～6环烷氧基，c3～6环烷氨基。
本发明中所述含联苯结构的二芳基嘧啶类衍生物的药用盐包括盐酸盐、氢溴酸盐、硫酸盐、磷酸盐、醋酸盐、甲磺酸盐、对甲苯磺酸盐、酒石酸盐、柠檬酸盐、富马酸盐或苹果酸盐。
本发明的化合物为hiv-1非核苷类逆转录酶抑制剂，不仅具有较强的生物活性，还具有较高的选择系数，细胞毒性较小。
本发明还提出含联苯结构的二芳基嘧啶类衍生物的制备方法，其制备的反应通式如下：
具体操作步骤如下：
在溶剂中，4-氯嘧啶类衍生物ii与联苯类衍生物iii为原料在碱的作用下反应，即可得到所述化合物i。其反应条件如下：
使用的溶剂为丙酮、乙腈、甲苯、二氯甲烷、四氢呋喃、n,n-二甲基甲酰胺、n,n-二甲基乙酰胺，乙醇，异丙醇，正丁醇，异丁醇中的一种或者多种；
使用的碱为：下述无机碱之一种：碳酸钠、碳酸钾、碳酸铯、氢氧化钠、氢氧化钾、钠氢，或者为下述有机碱之一种：n,n-二甲基氨基吡啶、三乙胺、二异丙基乙基胺、三丁胺、叔丁醇钾中的一种或者多种；
所述的化合物ii、化合物iii与碱的摩尔比为1:1:1.5-1:1.5:2.5(1:(1-1.5):(1.5-2.5))，优选摩尔比例为1:1.2:2；
反应温度为30～100℃；
反应时间为4～10h。
本发明还涉及一种药物组合物，该组合物含有有效剂量的上述化合物和相关的药用载体，以及所述化合物或组合物在制备预防和治疗艾滋病药物中的应用。
本发明基于含联苯结构的二芳基嘧啶类衍生物与hiv逆转录酶的结合模式，结合计算机辅助药物设计，在嘧啶环左翼引入联苯结构，增强化合物与结合口袋中芳香性氨基酸残基tyr181,tyr188之间的π-π堆积作用。同时左翼上氰基能深入结合口袋加强与高度保守氨基酸残基phe227,trp229之间的结合力，进一步提高目标化合物抗耐药hiv病毒株的生物活性。体外细胞水平抗hiv-1活性实验结果显示，该系列化合物具有较显著的抗hiv-1活性，并且具有较低的细胞毒性。
具体实施方式
通过下述实施实例可以更好地理解本发明内容，但是不能限制本发明的内容。
实施例1：终产物ⅰ的合成
将化合物iii与碱加入到溶剂中，搅拌30min，然后加入化合物ii，30～100℃下搅拌4～10h。tlc监测反应直到原料消耗完全。反应液倒入乙酸乙酯中，依次用水、饱和食盐水洗涤，有机相经无水硫酸钠干燥过夜。过滤，浓缩，乙酸乙酯与石油醚重结晶，得到所需固体。
以含有不同取代基的原料利用上述方法分别制得目标化合物，部分结果如下：
室温下，将4’-羟基-3’,5’-二甲基[1,1’-联苯]-4-甲氰(4.48mmol)和碳酸钾(6.72mmol)加入到n,n-二甲基甲酰胺(20ml)中，搅拌30min，然后加入2-(4-氯苯基)氨基-4-氯嘧啶(4.93mmol)，60℃搅拌9h。tlc显示反应完全。反应液倒入乙酸乙酯(40ml)中，依次用水(20ml×3)、饱和食盐水(20ml×2)洗涤，有机相经无水硫酸钠干燥过夜。过滤，浓缩，乙酸乙酯和石油醚重结晶，得到所需固体。
白色粉状固体；收率88％；熔点：271–274℃；1hnmr(400mhz,dmso-d6)δ:10.13(s,1h),8.48(d,j＝5.2hz,1h),7.95(s,4h),7.64(s,4h),7.43(s,2h),6.66(d,j＝5.1hz,1h),2.16(s,6h).13cnmr(101mhz,dmso-d6)δ:168.80(o-c＝n),160.79(n2＝c-nh),159.47(arc),150.68(arc),144.81(arc),143.92(arc),135.92(arc),133.43(arc),131.73(arc),127.92(arc),119.13(arc),118.67(n≡c-c,2c),109.88(arc),102.26(arc),99.74(arc),95.12(arc),16.45(ch3).。
操作同上。白色粉状固体；收率84％；熔点：242–245℃；1hnmr(400mhz,dmso-d6)δ:10.12(s,1h),8.44(d,j＝5.3hz,1h),8.10–7.88(m,4h),7.66(d,j＝8.1hz,2h),7.59(s,1h),7.52–7.40(m,3h),7.36(d,j＝8.1hz,1h),6.63(d,j＝5.3hz,1h),3.90–3.76(m,3h).13cnmr(101mhz,dmso-d6)δ:170.21(o-c＝n),162.84(n2＝c-nh),159.85(arc),154.10(arc),145.82(arc),144.88(arc),142.84(arc),139.11(arc),135.19(arc),133.14(arc),129.09(arc),126.44(arc),122.07(arc),121.26(arc),120.80(arc),120.09(arc),119.48(arc),118.90(n≡c-c,2c),114.12(arc),111.45(arc),104.57(arc),101.62(arc),63.57(ch3).。
操作同上。白色粉状固体；收率75％；熔点：209–212℃；1hnmr(400mhz,dmso-d6)δ:10.19(s,1h),8.52(d,j＝5.2hz,1h),7.99(d,j＝7.5hz,2h),7.86(s,1h),7.72(d,j＝8.2hz,3h),7.60(d,j＝7.9hz,3h),7.55(d,j＝8.1hz,2h),6.72(d,j＝5.2hz,1h).13cnmr(101mhz,dmso-d6)δ:169.52(o-c＝n),160.87(n2＝c-nh),159.32(arc),152.84(arc),145.00(arc),143.74(arc),136.58(arc),134.05(arc),133.03(arc),132.51(arc),130.53(arc),126.56(arc),122.68(q,j＝283.5hz,cf3),119.96(arc),119.02(n≡c-c,2c),111.72(arc),103.34(arc),100.48(arc).。
操作同上。白色粉状固体；收率72％；熔点：247–250℃；1hnmr(400mhz,dmso-d6)δ:10.17(s,1h),8.50(d,j＝5.5hz,1h),7.99(d,j＝7.9hz,2h),7.82(d,j＝7.9hz,2h),7.77(d,j＝8.4hz,3h),7.55(d,j＝8.4hz,2h),7.47(d,j＝11.6hz,1h),7.31(s,1h),6.68(d,j＝5.5hz,1h).13cnmr(101mhz,dmso-d6)δ:170.99(o-c＝n),162.25(n2＝c-nh),160.27(arc),155.65(d,j＝228.3hz,f-c),154.30(arc),145.62(arc),141.01(arc),134.33(arc),132.52(arc),130.90(arc),125.65(arc),121.60(arc),120.61(arc),120.48(n≡c-c,2c),113.25(arc),112.87(arc),105.59(arc),102.23(arc).。
操作同上。白色粉状固体；收率65％；熔点：254–257℃；1hnmr(400mhz,dmso-d6)δ:10.20(s,1h),8.53(d,j＝5.4hz,1h),8.11(d,j＝37.3hz,1h),7.99(d,j＝7.8hz,2h),7.79(s,1h),7.77–7.70(m,3h),7.64(d,j＝7.8hz,2h),7.57(d,j＝8.3hz,2h),6.75(d,j＝5.4hz,1h).13cnmr(101mhz,dmso-d6)δ:170.34(o-c＝n),162.22(n2＝c-nh),160.13(arc),153.52(arc),150.53(arc),146.06(arc),143.46(arc),135.52(arc),134.93(arc),132.09(arc),130.14(arc),128.02(arc),121.29(arc),119.51(n≡c-c,2c),112.73(arc),104.22(arc),101.79(arc).。
操作同上。白色粉状固体；收率90％；熔点：254–257℃；1hnmr(400mhz,dmso-d6)δ:10.13(s,1h),8.48(d,j＝5.3hz,1h),7.96(s,4h),7.90(d,j＝7.9hz,2h),7.72(s,2h),7.51(s,2h),7.43(s,2h),6.65(d,j＝5.3hz,1h).13cnmr(101mhz,dmso-d6)δ:170.27(o-c＝n),161.12(n2＝c-nh),160.00(arc),153.76(arc),145.88(arc),144.46(arc),136.96(arc),133.42(arc),133.33(arc),129.49(arc),128.48(arc),123.54v,119.30(n≡c-c,2c),111.28(arc),103.92(arc),101.65(arc).。
操作同上。白色粉状固体；收率77％；熔点：253–256℃；1hnmr(400mhz,dmso-d6)δ:10.18(s,1h),8.52(d,j＝5.3hz,1h),8.05–7.92(m,5h),7.76(d,j＝8.4hz,1h),7.66(d,j＝8.2hz,2h),7.59(t,j＝8.2hz,1h),7.47(d,j＝8.3hz,2h),6.78(s,1h).13cnmr(101mhz,dmso-d6)δ:169.07(o-c＝n),161.06(n2＝c-nh),159.20(arc),156.16(d,j＝228.3hz,f-c),153.73(arc),144.91(arc),142.86(arc),140.19(arc),137.97(arc),133.55(arc),133.04(arc),128.10(arc),125.52(arc),124.53(arc),119.74(arc),119.07(arc),118.76(n≡c-c,2c),116.20(arc),115.88(arc),111.30(arc),103.11(arc),99.88(arc).。
操作同上。白色粉状固体；收率71％；熔点：230–233℃；1hnmr(400mhz,dmso-d6)δ:10.15(s,1h),8.47(d,j＝5.6hz,1h),7.95(d,j＝8.0hz,2h),7.77(d,j＝8.5hz,2h),7.63(d,j＝8.0hz,2h),7.55(d,j＝8.5hz,2h),7.38(d,j＝8.3hz,1h),7.28(s,1h),7.21(d,j＝8.3hz,1h),6.62(d,j＝5.6hz,1h),2.28(s,3h).13cnmr(101mhz,dmso-d6)δ:169.81(o-c＝n),160.58(n2＝c-nh),159.60(arc),152.48(arc),145.74(arc),144.98(arc),137.51(arc),133.15(arc),132.78(arc),131.26(arc),130.65(arc),124.14(arc),120.20(arc),119.94(arc),119.34(arc),118.91(n≡c-c,2c),110.57(arc),109.93(arc),102.94(arc),100.33(arc),20.20(ch3).。
操作同上。白色粉状固体；收率79％；熔点：254–257℃；1hnmr(400mhz,dmso-d6)δ:10.17(s,1h),8.57–8.47(m,1h),8.09(d,j＝11.9hz,1h),8.03–7.95(m,4h),7.89(d,j＝8.4hz,1h),7.62(dd,j＝17.6,8.3hz,3h),7.46(d,j＝8.4hz,2h),6.76(d,j＝5.5hz,1h).13cnmr(101mhz,dmso-d6)δ:169.13(o-c＝n),160.87(n2＝c-nh),159.36(arc),149.17(arc),144.87(arc),142.81(arc),138.12(arc),133.59(arc),133.02(arc),129.43(arc),128.35(arc),127.90(arc),127.64(arc),125.73(arc),119.77(arc),119.22(arc),118.68(n≡c-c,2c),111.09(arc),103.09(arc),100.06(arc).。
操作同上。白色粉状固体；收率78％；熔点：296–299℃；1hnmr(400mhz,dmso-d6)δ:10.25(s,1h),8.57(d,j＝5.5hz,1h),8.07–7.99(m,4h),7.88(d,j＝9.2hz,2h),7.64(d,j＝8.3hz,2h),7.49(d,j＝8.4hz,2h),6.88(d,j＝5.5hz,1h).13cnmr(101mhz,dmso-d6)δ:168.19(o-c＝n),161.42(n2＝c-nh),159.48(arc),157.08(d,j＝230.5hz,f-c),156.04(arc),155.29(arc),154.50(arc),144.59(arc),143.70(arc),141.90(arc),140.97(arc),137.98(arc),133.61(arc),132.97(arc),128.34(arc),119.61(arc),119.01(n≡c-c,2c),112.22(arc),111.82(arc),111.65(arc),103.22(arc),99.46(arc).。
操作同上。白色粉状固体；收率85％；熔点：256–259℃；1hnmr(400mhz,dmso-d6)δ:10.13(s,1h),8.48(d,j＝5.2hz,1h),7.96(s,4h),7.82(s,1h),7.70(dd,j＝20.3,8.3hz,3h),7.45(d,j＝8.3hz,2h),7.33(d,j＝8.3hz,1h),6.65(d,j＝5.4hz,1h),2.20(s,3h).13cnmr(101mhz,dmso-d6)δ:169.61(o-c＝n),160.81(n2＝c-nh),159.64(arc),151.99(arc),145.08(arc),144.32(arc),136.39(arc),133.44(arc),133.05(arc),131.79(arc),130.62(arc),127.83(arc),126.67(arc),123.62(arc),119.91(arc),119.41(arc),118.90(n≡c-c,2c),110.58(arc),102.91(arc),99.96(arc),16.46(ch3).。
操作同上。白色粉状固体；收率80％；熔点：252–255℃；1hnmr(400mhz,dmso-d6)δ:10.17(s,1h),8.50(d,j＝5.1hz,1h),7.99(d,j＝7.5hz,2h),7.78–7.66(m,5h),7.59(dd,j＝16.9,8.1hz,3h),7.41(d,j＝8.4hz,1h),6.69(d,j＝5.1hz,1h).13cnmr(101mhz,dmso-d6)δ:169.53(o-c＝n),160.81(n2＝c-nh),159.47(arc),153.17(arc),145.04(arc),143.17(arc),136.02(arc),133.11(arc),132.79(arc),132.29(arc),130.91(arc),124.14(arc),121.94(arc),119.87(arc),119.00(n≡c-c,2c),111.20(arc),103.23(arc),100.67(arc).。
操作同上。白色粉状固体；收率73％；熔点：269–2710℃；1hnmr(400mhz,dmso-d6)δ:10.18(s,1h),8.53(d,j＝5.6hz,1h),8.23(d,j＝8.6hz,1h),8.18(s,1h),8.07(d,j＝7.9hz,2h),8.00(d,j＝8.2hz,2h),7.70(dd,j＝18.8,8.4hz,3h),7.50(d,j＝8.3hz,2h),6.77(d,j＝5.6hz,1h).13cnmr(101mhz,dmso-d6)δ:169.38(o-c＝n),161.10(n2＝c-nh),159.33(arc),150.54(arc),144.90(arc),142.97(arc),136.97(arc),133.44(arc),133.06(arc),128.47(arc),126.45(arc),124.75(q,j＝281.2hz,cf3),119.16(arc),119.03(arc),118.82(n≡c-c,2c),111.22(arc),103.50(arc),100.32(arc).。
操作同上。白色粉状固体；收率77％；熔点：283–286℃；1hnmr(400mhz,dmso-d6)δ:10.17(s,1h),8.52(d,j＝5.6hz,1h),8.04–7.95(m,4h),7.92(s,1h),7.82(s,1h),7.61(d,j＝7.5hz,2h),7.43(d,j＝7.9hz,2h),6.77(d,j＝5.6hz,1h),2.23(s,3h).13cnmr(101mhz,dmso-d6)δ:168.47(o-c＝n),161.14(n2＝c-nh),159.60(arc),147.64(arc),144.81(arc),142.97(arc),137.55(arc),134.41(arc),133.49(arc),133.03(arc),129.28(arc),128.18(arc),128.04(arc),126.63(arc),119.80(arc),119.03(arc),118.88(n≡c-c,2c),111.08(arc),103.16(arc),99.59(arc),16.48(ch3).。
实施例2：抗hiv生物活性测试
体外细胞水平的抗hiv病毒活性由比利时katholleke大学的rega药物研究所测定，主要包括：对hiv感染的mt-4细胞的抑制活性及细胞毒性两方面。方法如下：使化合物在hiv感染的mt-4细胞中，于感染hiv不同时间，用mtt法测定药物对hiv诱变的细胞病变的保护作用，计算使50％的细胞免于hiv诱导的细胞病变所需的浓度半数有效浓度ec50，毒性测定与抗hiv活性实验平行进行，也是在mt-4细胞培养中，用mtt法测定使50％的未感染细胞发生细胞病变的浓度(cc50)，并计算选择性指数si＝cc50/ec50。
材料与方法：
各化合物的抗hiv活性由药物对hiv在细胞中引起的细胞病变的抑制作用效率来监控。采用mt-4细胞进行细胞培养。采用的病毒株有：hiv-1病毒株ⅲb及hiv-2病毒株rod。
具体操作如下：将化合物用dmso或水溶解后在磷酸盐缓冲食盐水溶液稀释，将3×105mt-4细胞用100μl各化合物不同浓度此溶液在37℃预培养1h，然后向该化合物中加入100μl适当的病毒稀释液，将细胞于37℃培养1h。洗涤三次后，将细胞再次分别悬浮于含有或不含有化合物的培养介质中。接着将细胞在5％co2氛围中，于37℃下再培养7天，并于感染后第三天用含有或不含有化合物的培养介质替换补充培养液。每种培养液条件重复操作两次。对病毒的细胞病变作用每天都用反向光学显微镜监控。典型来讲，本实验中所用的病毒稀释液常常会在病毒感染后第五天导致细胞病变。药物抑制浓度以药物对病毒细胞病变作用产生50％抑制作用而同时对细胞无直接毒性的浓度(cc50)表示。需要强调的是，当化合物水溶性较差，需要dmso才能溶解时，dmso比浓度相对于水来讲，一般低于10％(dmso在mt-4细胞培养介质中最终浓度小于2％)。因为dmso能影响测试化合物的抗病毒活性，对含有相同浓度dmso溶液抗病毒活性对比空白实验也应该平行进行。另外，dmso最终浓度(1/1000)远远低于hiv-1在t细胞中复制所需的浓度。
本发明用已上市药物奈维拉平(nevirapine,nvp)、依非韦伦(efavirenz,efv)和依曲韦林(etravirine,etv)作对照品，部分目标化合物对hiv的抑制活性结果见表1(anti-hivactivityandcytotoxicityofcompounds1-19inmt-4cells)。
表1[a]
[a]alldatarepresentmeanvaluesofatleastthreeseparateexperiments.[b]ec50:effectiveconcentrationrequiredtoprotect50％ofcellsagainstviralcytopathicityinmt-4cells.[c]cc50:cytotoxicconcentrationofthecompoundthatreducesthenormaluninfectedmt-4cellviabilityby50％.[d]si:selectivityindex,ratiocc50/ec50(wt)。
实验结果表明，化学通式中所包含的化合物普遍具有较强的抗hiv-1病毒活性，较小的细胞毒性和较高的选择性指数。
本发明不限于上述实例。