用于合成谷胱甘肽的重组菌及谷胱甘肽的合成方法与流程

本发明属于生物工程技术领域，具体涉及一种用于合成谷胱甘肽的重组菌及谷胱甘肽的合成方法。

背景技术

谷胱甘肽(γ-l-glutamyl-cysteinyl-glycine，gsh)是一类广泛存在于动植物和微生物体内的一类重要的非蛋白巯基化合物，具有还原型和氧化性两种状态。gsh由谷氨酸、半胱氨酸、和甘氨酸三种氨基酸通过肽键形成。gsh相对分子量为307.33，晶体呈现无色透明状，等电点为5.93，易溶于水、液氨、低浓度乙醇，但不溶于醇、醚等有机溶剂中。

gsh分子具有γ-谷氨酰基和活性巯基两种基团，是gsh发挥多种重要的生理功能的基础。gsh主要以还原型状态存在于细胞当中，发挥着与多种化学物质及其代谢产物结合，清除体内氧自由基以保护细胞免受活性氧复合物损伤的功能。gsh还能保护肝细胞膜、抗氧化，解毒、维持动物体内抗坏血酸平衡的功能。除了在生理上发挥着重要的功能，gsh也被广泛应用于食品领域，其可以提高食品的保质期，抑制肉食类和鱼类的核酸分解，促进铁、无机形式硒和钙等的吸收。此外，由于gsh能延缓衰老，保护皮肤等功能，所以其化妆品领域也发挥着及其重要的作用。

gsh有多种来源，但主要有下面几种方法：化学合成法、固定酶酶法生产、从谷物中分离gsh和微生物发酵法等。化学合成法由于活性产物不易分离，需要化学拆分等技术，以此该方法逐渐被别的方法所取代，从谷物中分离gsh的经济效益并不高，只是为得到gsh提供了多一种来源，酶法生产的特点是在体外利用固定化酶将三种基础氨基酸合成所需的gsh，但是由于该技术难度高，酶的活性易收到外界环境的影响，因此也逐渐被取代。与前面几种方法不同的是，生物发酵法可以有多种宿主菌生产gsh，包括大肠杆菌、酵母等。由于近年来随着生物技术的发展，多种生物体内合成gsh的酶被发现，因此可以给予gsh合成提供多种途径，故此由微生物发酵法逐渐成为了合成gsh的主要方法。

微生物发酵法的特点是，将外源的gsh合成酶通过质粒导入到大肠杆菌或者酵母细胞中，使gsh合成酶过表达，大量合成的酶能够促进三种氨基酸向gsh的转化，但是由于细胞体内的氨基酸数量有限，因此需要在合成gsh的过程中加入额外的氨基酸以提高产量。另一方面，由于大量的外源氨基酸会抑制细胞对氨基酸的吸收，因此需要通过进一步对细胞进行改造，通过加入一些促进细胞对外源氨基酸吸收的基因以提高胞内的氨基酸含量。

技术实现要素：

本发明所要解决的技术问题是提供一种能够高效合成谷胱甘肽的重组菌及谷胱甘肽的合成方法。

为解决以上技术问题，本发明采取如下技术方案：

本发明的一个目的是提供一种用于合成谷胱甘肽的重组菌，所述的重组菌包括第一重组质粒和第二重组质粒，所述的第一重组质粒包括gs片段和pet-22b载体片段，所述的第二重组质粒包括fliy片段和pet-28a载体片段。

本发明中的gs基因为谷胱甘肽双功能合成酶基因；本发明中的fliy基因为l-胱氨酸细胞周质底物结合蛋白基因。

优选地，所述的gs片段位于所述的pet-22b载体片段的t7启动子之下；所述的fliy片段位于所述的pet-28a载体片段的t7启动子之下。

优选地，所述的gs片段的dna序列与seqidno.1所示序列至少具有80％的同源性；进一步优选为具有85％以上的同源性，更优选为具有90％以上的同源性，再优选为具有95％以上的同源性，最优选为seqidno.1所示序列。

优选地，所述的fliy片段的dna序列与seqidno.2所示序列至少具有80％的同源性，进一步优选为具有85％以上的同源性，更优选为具有90％以上的同源性，再优选为具有95％以上的同源性，最优选为seqidno.2所示序列。

优选地，所述的第一重组质粒包括卡那霉素抗性基因片段和氨苄青霉素抗性基因片段中的一种；所述的第二重组质粒包括卡那霉素抗性基因片段和氨苄青霉素抗性基因片段中的另一种。

进一步优选地，所述的第一重组质粒包括氨苄青霉素(amp)抗性基因片段；所述的第二重组质粒包括卡那霉素(kana)抗性基因片段；该两个抗性基因片段可用以筛选基因重组菌。

优选地，所述的重组菌还包括无卡那霉素抗性和无氨苄青霉素抗性的大肠杆菌。

进一步优选地，所述大肠杆菌为e.colibl21(de3)。

本发明的另一个目的是提供一种所述的重组菌的制备方法，将所述的第一重组质粒和所述的第二重组质粒转化入无卡那霉素抗性和无氨苄青霉素抗性的大肠杆菌中，获得所述的重组菌。

优选地，所述的第一重组质粒的制备方法为：

a)pcr扩增获得gs片段；

b)将所述的gs片段克隆入pet-22b中，得到所述的第一重组质粒。

优选地，所述的第二重组质粒的制备方法为：

a)pcr扩增获得fliy片段；

b)将所述的fliy片段克隆入pet-28a载体片段中，得到所述的第二重组质粒。

本发明的第三个目的是提供一种谷胱甘肽的合成方法，通过对所述的重组菌进行培养，得到所述的谷胱甘肽。

优选地，所述的培养的温度为25～37℃，诱导剂的浓度为0.1～1mmol/l；诱导剂的添加时间为3～5小时，培养基中的碳源为浓度为1～50g/l的葡萄糖、蔗糖或果糖；氮源为浓度为1～50g/l的(nh4)2so4、nh4cl或牛肉膏；微量元素为浓度为5～500mg/l的mgso4、znso4或mnso4；培养时间为6～24小时。

进一步优选地，所述的培养的温度为25～26℃，诱导剂的浓度为0.8～1mmol/l；诱导剂的添加时间为4.5～5小时，培养基中的碳源为浓度为20～30g/l的果糖；氮源为浓度为1～25g/l的(nh4)2so4或牛肉膏；微量元素为浓度为5～500mg/l的mgso4、znso4或mnso4；培养时间为20～24小时。

由于以上技术方案的实施，本发明与现有技术相比具有如下优点：

本发明的重组菌可以明显地提高谷胱甘肽生产量，从而提高了原料利用率，降低了生产成本和能耗，为进一步研究谷胱甘肽产量建立一种方法，为其产业化生产奠定一种基础。

附图说明

图1是pet-22b-gs质粒图谱的示意图。

图2是pet-28a-fliy质粒图谱示意图，fliy位于t7强启动子下。

图3是pcr扩增获gs的检测结果，其中泳道1为gspcr扩增产物，m是蛋白标准分子量。

图4是pcr扩增获fliy的检测结果，其中泳道1为fliypcr扩增产物，m是蛋白标准分子量。

图5是gs基因和fliy基因蛋白表达的sds-page结果，其中2泳道为gs和fliy蛋白，1泳道为未加诱导剂，m是蛋白标准分子量。

图6是三种谷胱甘肽工程菌不同诱导条件下谷胱甘肽产量结果。

图7是gsh-gs-fliy工程菌不同碳源下谷胱甘肽产量结果。

图8是gsh-gs-fliy工程菌不同氮源下谷胱甘肽产量结果。

图9是gsh-gs-fliy工程菌不同微量元素浓度下谷胱甘肽产量结果。

具体实施方式

以下结合具体实施例，对本发明作进一步说明。应理解，以下实施例仅用于说明本发明而非用于限定本发明的范围。

以下实施例中为注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，如《分子克隆：实验室手册》(newyork:coldspringharborlaboratorypress，1989)中所述的条件或厂商提供的方案进行。

在本发明的下述实施例中，使用的胶回收试剂盒、质粒提取试剂盒、基因组提取试剂盒均购自生工生物公司。

在本发明的下述实施例中，使用的clonexpressⅱ，turbo保真酶来自南京诺唯赞生物科技有限公司。ncoi，xhoi，ndei，bamhi，dnamarker，均购自takara公司。

在本发明的下述实施例中，使用的表达载体pet-22b、pet-28a，菌种e.colibl21(de3)、e.colidh5α，为中国药科大学生命中心实验室保存，其中菌种e.colibl21(de3)的atcc编号为baa-1025^tm。

在本发明的下述实施例中，使用的e.colibl21(de3)感受态细胞、e.colidh5α感受态细胞，按照invitrogen公司pichiaexpressionkit手册中提供的方法进行。

在本发明的下述实施例中，使用的lb液体培养基的配方为：1％胰蛋白栋，0.5％酵母浸粉，1％nacl；使用的摇瓶发酵培养基的配方为：1％胰蛋白栋，0.5％酵母浸粉，1％nacl。配置固体lb平板培养基时，按照上述配方添加2％琼脂粉。

在本发明的下述实施例中，感受态细胞的制备和转化，按照《分子克隆：实验室手册》提供的方法进行。

实施例1两个表达质粒的构建

1.1引物设计

根据ncbi报道的gs和fliy序列，设计以下2对引物用以扩增gs和fliy基因：

gs-f：5’-cagccggcgatggccatggatatgatcatcgatcgtctgc-3’

(seqidno.3)

gs-r：5’-tggtggtggtggtgctcgagcggaaacagttttgccagaa-3’(seqidno.4)

fliy-f：5’-ctggtgccgcgcggcagccatatgaaattagcacatctggg-3’(seqidno.5)

fliy-r：5’-cgacggagctcgaattcggatcctttggtcacatcagcacc-3’(seqidno.6)

其中gs-f和gs-r用于扩增gs编码区；fliy-f和fliy-r用于扩增fliy编码区；gs-f，gs-r，fliy-f和fliy-r引物的下划线表示分别在引物上引入ncoi，xhoi，ndei和bamhi酶切位点。gs-f和gs-r与pet-22b同源的部分用于将gs基因克隆到pet-22b载体上。fliy-f和fliy-r与pet-28a同源的部分用于将fliy基因克隆到pet-28a载体上。

1.2pcr扩增gs序列

利用生工质粒提取试剂盒对大肠杆菌dh5α抽提得到pmd19-t-gs载体。

以pmd19-t-gs载体为模板，以步骤1.1中设计的gs-f和gs-r为引物对，进行pcr扩增，具体如下：

扩增gs的反应体系为：turbo保真酶50μl，上下游引物(10μm)各4μl，加入去离子水40μl，1μl的pmd19-t-gs至体系总体积为100μl。

扩增反应条件为：95℃4min；95℃30s，55℃30s，72℃1min，34个循环；72℃10min；4°∞，30个循环。

pcr扩增产物进行凝胶电泳检测，检测结果如图3所示。获得的产物的大小约为2247bp，与gs预期产物大小相似。

1.3pcr扩增fliy序列

用基因组提取试剂盒对大肠杆菌k12基因组抽提，得到大肠杆菌k12基因组。

以大肠杆菌k12基因组为模板，分别以步骤1.1中设计的fliy-f和fliy-r为引物对，进行pcr扩增，具体如下：

扩增fliy的反应体系均为：turbo保真酶50μl，上下游引物(10μm)各4μl，加入去离子水40μl，2μl的e.colik12基因组，至体系总体积为100μl。

扩增反应条件均为：95℃4min；95℃30s，55℃30s，72℃1min，34个循环；72℃10min；4°∞，30个循环。

pcr扩增产物分别进行凝胶电泳检测，检测结果如图4所示。获得的产物的大小约为800bp，符合fliy产物的预期大小。

1.4表达载体的构建

1.4.1对步骤1.2pcr扩增后的产物酶切

选择ncoi和xhoi两个限制酶，对步骤1.2pcr扩增后的产物进行酶切，反应体系如下：ncoi2μl；xhoi2μll；步骤1.2pcr扩增后的产物1μg；10×kbuffer10μl；加水至100μl。37℃水浴酶切1小时。对酶切产物进行胶回收得到gs片段，用以随后的克隆。该gs片段的dna序列如seqidno.1所示。

1.4.2对步骤1.3pcr扩增后的产物酶切

选择ndei和bamhi两个限制酶，对步骤1.3pcr扩增后的产物进行酶切，反应体系如下：ndei2μl；bamhi2μl；步骤1.3pcr扩增后的产物1μg；10×kbuffer10μl；加水至100μl。37℃水浴酶切1小时。对酶切产物进行胶回收得到fliy片段，用以随后的克隆。该fliy片段的dna序列如seqidno.2所示。

1.4.3pet-22b和pet-28a表达载体的构建

将实验室保存的含有pet-28a及pet-22b的大肠杆菌e.colidh5α接种于lb液体培养基中进行过夜培养，用以扩增质粒。利用质粒抽提试剂盒对过夜的大肠杆菌进行提质粒，获得的质粒用于酶切。利用ncoi/xhoi双酶切得到表达载体pet-22b，利用ndei/bamhi双酶切得到表达载体pet-28a，对双酶切产物进行胶回收。

1.4.4.1gs基因构建在pet-22b上

于低温冰水浴中配置如下所示反应体系5×ceⅱbuffer4μl；ⅱ2μl；pet-22b线性载体50ng；gs片段200ng；加水至20μl。配置中如果有液体粘黏管壁的情况，可通过短暂离心的方法处理。

体系配置完成后，用移液枪反复上下轻轻吹打，重复步骤直至混匀各部分，操作的时候避免产生气泡。置于37℃环境下反应30min。反应完成时，立即将反应管置于冷水浴中低温冷却，所得产物片段置于-20℃环境中保存，用于后续试验。

将连接产物转化入无卡那霉素和氨苄青霉素抗性的宿主菌e.colide3，并涂布含100mg/ml氨苄青霉素的固体lb平板，37℃培养至转化子长出。挑取阳性的转化子鉴定，根据鉴定结果，最终获得含有pet-22b-gs重组质粒的大肠杆菌，其质粒图谱如图1所示，检测结果如图5所示；该含有pet-22b-gs重组质粒的大肠杆菌按1:1的体积比加入40％的甘油，-80℃保存。

1.4.4.2fliy基因构建在pet-28a上

于低温冰水浴中配置如下所示反应体系5×ceⅱbuffer4μl；ⅱ2μl；pet-28a载体50ng；fliy片段200ng；加水至20μl。配置中如果有液体粘黏管壁的情况，可通过短暂离心的方法处理。

体系配置完成后，用移液枪反复上下轻轻吹打，重复步骤直至混匀各部分，操作的时候避免产生气泡。置于37℃环境下反应30min。反应完成时，立即将反应管置于冷水浴中低温冷却，所得产物片段置于-20℃环境中保存，用于后续试验。

将连接产物转化入无卡那霉素和氨苄青霉素抗性的宿主菌e.colide3，并涂布含50mg/ml卡那霉素的固体lb平板，37℃培养至转化子长出。挑取阳性的转化子鉴定，根据鉴定结果，最终获得含有pet-28a-fliy重组质粒的大肠杆菌，其质粒图谱如图2所示，检测结果如图5所示；该含有pet-28a-fliy重组质粒的大肠杆菌按1:1的体积比加入40％的甘油，-80℃保存。

实施例2表达质粒转化合成谷胱甘肽菌株

将实施例1制得的含有pet-22b-gs重组质粒的大肠杆菌和含有pet-28a-fliy重组质粒的大肠杆菌分别接种于lb液体培养基当中过夜培养，利用质粒抽提试剂盒对过夜的含有pet-22b-gs重组质粒的大肠杆菌菌液提质粒。利用大肠杆菌感受态制备标准流程将含pet-28a-fliy重组质粒的大肠杆菌制备成感受态。将pet-22b-gs质粒转化到pet-28a-fliy大肠杆菌感受态当中，并涂布同时含有100mg/ml氨苄青霉素和50mg/ml卡那霉素的固体lb平板，37℃培养至转化子长出。其中大肠杆菌是无卡那霉素和氨苄青霉素抗性菌株，不能在含有卡那霉素和氨苄青霉素的固体lb平板上生长，因此，平板上长出的转化子均为转化了pet-22b-gs和pet-28a-fliy质粒的大肠杆菌，将含有pet-22b-gs和pet-28a-fliy质粒的大肠杆菌按1:1的体积比加入40％的甘油，-80℃保存。

将含有pet-22b-gs和pet-28a-fliy质粒的大肠杆菌命名gsh-gs-fliy(即实施例2制得的重组菌)，将含有pet-22b-gs的大肠杆菌命名为22b-gs(即实施例1步骤1.4.4.1制得含有pet-22b-gs重组质粒的大肠杆菌)，将含有pet-28a-fliy质粒的大肠杆菌命名28a-fliy(即实施例1步骤1.4.4.2制得含有pet-28a-fliy重组质粒的大肠杆菌)，分别测定三种菌株在不同条件下的gsh合成效果。

实施例322b-gs，28a-fliy，gsh-gs-fliy摇瓶发酵谷胱甘肽

将22b-gs，28a-fliy，gsh-gs-fliy三种甘油菌按照1％的接种量接种于lb液体培养基中，加入占lb液体培养基千分之一体积的抗生素。摇瓶培养过夜。

分别取1％体积的菌液转接入lb培养基中，采用正交试验l9(3⁴)对温度(℃)、iptg添加量(mm)、iptg起始添加时间(h)和反应时间(h)进行优化，试验设计如下表1。利用四氧嘧啶法检测gsh的含量，检测结果如图6，结果表明三种菌株中，gsh-gs-fliy的谷胱甘肽平均产量最高，最高可达1043.57mg/l。其中，iptg起始添加时间是指iptg在培养反应进行至该时间进行iptg的添加

表1诱导表达条件优化正交试验因素水平

实施例4gsh-gs-fliy培养条件优化

在反应温度为25℃、iptg添加量为1mm、iptg添加时间为5h，反应时间为24h的条件下，以谷胱甘肽产量最高的菌株gsh-gs-fliy为对象，研究其在加入不同种类的碳源，氮源及微量元素，并按一定比例配制成不同浓度lb液体培养基中，研究其谷胱甘肽产量变化。具体优化方法见表2。

表2lb培养基添加组分的种类与浓度

实施例4-1

lb液体培养基中加入10g/l的蔗糖，10g/l的nh4cl以及不同浓度和种类的微量元素，进行平行实验，并分别取样检测发酵产物中的谷胱甘肽累积量，其结果如图9所示，优化微量元素后，谷胱甘肽的最高产量可达976.4mg/l。

实施例4-2

lb液体培养基中10mg/l的mgso4，10g/l的牛肉膏以及不同浓度和种类的碳源，进行平行实验，并分别取样检测发酵产物中的谷胱甘肽累积量，其结果如图7所示，优化碳源后，谷胱甘肽最高产量可达1069.92mg/l。

实施例4-3

lb液体培养基中25g/l的果糖，10mg/l的mgso4，不同浓度和种类的氮源，进行平行实验，并分别取样检测发酵产物中的谷胱甘肽累积量，其结果如图8所示，优化氮源后，谷胱甘肽最高产量可达1078.85mg/l。

以上对本发明做了详尽的描述，其目的在于让熟悉此领域技术的人士能够了解本发明的内容并加以实施，并不能以此限制本发明的保护范围，凡根据本发明的精神实质所作的等效变化或修饰，都应涵盖在本发明的保护范围内。

序列表

<110>张家港市华天药业有限公司

<120>用于合成谷胱甘肽的重组菌及谷胱甘肽的合成方法

<160>6

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>2247

<212>dna

<213>人工序列(rengongxulie)

<400>1

atgatcatcgatcgtctgctgcagcgcagtcatagtcatctgccgattctgcaggcaacc60

tttggtctggaacgtgaaagtctgcgtattcatcagccgacccagcgtgttgcacagacc120

ccgcatccgaaaaccctgggcagtcgtaattatcatccgtatattcagaccgattatagc180

gaaccgcagctggaactgattaccccgattgcaaaagatagccaggaagcaattcgtttt240

ctgaaagccattagcgatgtggccggtcgcagcattaatcatgatgaatatctgtggccg300

ctgagtatgccgccgaaagtgcgtgaagaagatattcagattgcacagctggaagatgcc360

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agtggtattcattataacctgggcctgggccaggaactgctgaccagcctgtttgaactg480

agccaggcagataatgcaattgattttcagaatcagctgtatatgaagctgagtcagaat540

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