一种猪用疫苗载体的制作方法

本发明属于生物医药领域，具体涉及一种猪用疫苗载体。

背景技术：

杆状病毒(baculovirus)是一种以昆虫为唯一宿主的病毒，可用做生物杀虫剂或作为表达载体在昆虫细胞中大量表达外源蛋白，制备疫苗。研究发现，在哺乳动物细胞中携带哺乳动物启动子的重组杆状病毒能启动下游外源基因的表达但病毒不能在哺乳动物细胞中增值，对细胞毒性小，转导成功的细胞可以稳定传代并有效表达外源基因，哺乳动物细胞比昆虫细胞对蛋白质具有更好的翻译后修饰，表达出的蛋白结构更接近天然蛋白。因此，杆状病毒可作为一种新型的哺乳动物细胞基因转移载体，用于表达外源基因及作为一种基因治疗载体，具有巨大潜力，日益受到人们的关注。

杆状病毒能够进入哺乳动物体内的某些细胞，但是在这些细胞内不能进行复制。研究人员利用这个特点将其改造为一个携带基因的工具，并进行一定的修饰加工，将其改造成定向携带的载体，携带基因、药物到达指定的部位。但是，杆状病毒对机体来说毕竟是一个异类，机体对它有免疫作用，这不利于病毒进入指定部位，为了解决这个问题，就在杆状病毒基因内部引入了补体抑制分子，补体抑制分子的引入能够抑制机体对重组病毒的免疫应答，使杆状病毒重组体在传输过程中经过血清时被消灭的危险。

杆状病毒表面展示系统是近年发展起来的一种新型真核生物表面展示系统，因其具有外源片段长度选择范围大，增值速度快，可以很好地保持外源蛋白的原始活性等优点，目前已被广泛的应用于新型疫苗研制、基因转导与基因治疗、展示复杂的真核蛋白、构建多肽文库和抗体库以及单克隆抗体的制备等领域。gp64是目前杆状病毒表面展示系统的基础，是出芽型病毒特有的结构蛋白，也叫膜粒蛋白(peplomerprotein)，成熟后嵌合在病毒囊膜上，有二聚体、三聚体、四聚体3种存在方式。现在使用最广泛的杆状病毒展示系统是acmnpv和bmnpv，构建的方式是在其gp64的信号肽与成熟蛋白之间插入外源基因，外源基因与gp64蛋白融合表达，加工后因信号肽的切除形成n端融合蛋白，这种蛋白成熟后就嵌合在细胞膜或病毒囊膜上，这样外源基因就被表现在细胞或病毒表面，经简单筛选过程即可得到表达有特异蛋白的杆状病毒粒子。

口炎疱疹病毒g蛋白(vesicularstomatatisvirusgprotein，vsvg)对于多种不同类型和组织来源的哺乳动物细胞具有较好的通用性，能显著增强一些对杆状病毒不敏感的哺乳动物细胞株如cho、nih3t3等的转导效率，然而经vsvg修饰杆状病毒后可增加细胞毒性并促使细胞融合。随后，研究人员将vsv-ged(水泡性口炎病毒外功能区，由21个氨基酸构成，包括跨膜区域和胞质尾区)融合表达于杆状病毒囊膜蛋白gp64，对细胞造成的影响则可忽略不计。

免疫球蛋白fc不仅是决定ig免疫功能的重要部位，而且是igg在体内保持较长半衰期的主要原因。由于igfc具有稳定蛋白的作用，它被用来与多种蛋白融合，希望以此增强蛋白稳定性，延长其体内半衰期。igfc可形成多聚合分子，使重组蛋白具有更强的抗原结合力，同时igfc具有抗原提呈细胞受体而易被抗原提呈细胞所摄取，从而可用于提高小分子抗原的免疫应答能力。杆状病毒表面展示igfc可以增加其与抗原呈递细胞的结合。

技术实现要素：

本发明的目的在于针对现有技术中的不足，提供一种猪igg1fc重组杆状病毒作为猪用疫苗载体的制备方法。

本发明具体通过以下技术方案实现：一种猪igg1fc重组杆状病毒作为猪用疫苗载体的制备方法，通过以下步骤完成：

1)克隆猪iggfc基因和猪瘟病毒e2基因，与杆状病毒表面展示载体连接，获得重组转移载体；

2)重组转移载体通过tn7转座获得重组杆状病毒bacmid载体；

3)重组bacmid用脂质体方法转染昆虫细胞，收集培养物上清，获得重组杆状病毒，观察细胞病变并提取病毒dna做pcr鉴定；

4)重组杆状病毒感染昆虫细胞，收集细胞做westernblot分析和共聚焦显微镜分析；

5)重组杆状病毒做补体拮抗活性检测；

6)重组杆状病毒猪瘟载体在猪体做疫苗效力检验。

所述的步骤1)中猪iggfc基因的序列为序列表中的seqidno:1；其对应的猪iggfc的氨基酸序列为seqidno:3；

所述的步骤1)中猪瘟病毒e2基因的序列为序列表中的seqidno:2；其对应的猪瘟病毒e2的氨基酸序列为seqidno:4。

所述的步骤1)中猪瘟病毒e2基因的表达受cmv启动子的控制；

所述的步骤1)中杆状病毒表面展示载体为vsvg假型化杆状病毒。

所述的步骤2)中bacmid载体含苜蓿银文夜蛾核型多角体病毒基因组。

所述的步骤3)中昆虫细胞为草地夜蛾卵巢细胞sf9。

所述的步骤4)中westernblot分析的步骤为：收集病毒感染的昆虫细胞，用细胞裂解液处理后与蛋白上样缓冲液混合，煮沸10min后吸取上清做sds-page电泳；将pvdf膜浸泡在100％甲醇中，10s后，移至蒸馏水洗涤5min，最后置转印缓冲液中，混匀10min；蛋白质电泳结束后，利用电转仪将蛋白质转印在pvdf膜上；将转印好的pvdf膜以含50g/l脱脂牛乳室温封闭1h，以洗涤缓冲液清洗3次；用稀释的his标签鼠单克隆抗体4℃下摇床孵育过夜，隔日以适量洗涤液清洗3次；加入稀释的hrp标记的羊抗鼠igg抗体，室温下摇床作用1h后，以适量洗涤液清洗3次；用蒸馏水清洗，取出pvdf膜，稍晾干，暗房进行化学发光反应(ecl)，等量ecl试剂i:ii＝1:1，覆盖在pvdf膜上反应1min后，进行x光显影分析。

所述的步骤4)中共聚焦显微镜分析的步骤为：在6孔培养板中放入无菌载玻片，细胞先接种于无菌之载玻片上，细胞接入量为每孔加入1×10⁶；细胞吸附1h后，吸弃培养基，加入重组病毒在moi＝10下感染；48h后吸弃培养基，再添加1ml的甲醇：丙酮＝1:1的混合液于―20℃冰箱下固定5min，之后再加入1mlpbs缓冲液摇床转速50r/min清洗2次，每次5min；以1ml的20ml/l牛血清白蛋白在37℃下反应30min；加入1mlpbs缓冲液摇床转速50r/min清洗3次,每次5min；接下来加入his抗体(1:100)在37℃下反应1h，以标定表面展示的iggfc；加入1mlpbs缓冲液摇床转速50r/min清洗3次后，再加入fitc标记的兔抗鼠igg(1:100)37℃下反应1h；加入1mlpbs缓冲液摇床转速50r/min清洗3次后，在共聚焦显微镜下观察，展示蛋白的细胞膜会被fitc染色而呈现绿色荧光。

所述的步骤5)中补体拮抗活性检测的方法为：采健康猪前腔静脉血分离血清，血清分为两份：一份经过56℃灭活30min，另一份不灭活；将两份血清分别与重组杆状病毒37℃孵育60min，然后利用终点稀释法测定其病毒滴度；病毒存活率为未灭活处理组/灭活处理组。

所述的步骤6)中疫苗效力检验的步骤为：将抗原抗体双阴性健康猪分为4组：未展示iggfc的重组杆状病毒猪瘟疫苗组：10⁸pfu/ml重组杆状病毒2ml；展示iggfc的重组杆状病毒猪瘟疫苗组：10⁸pfu/ml重组杆状病毒2ml；猪瘟兔化弱毒疫苗组：1头份/2ml；pbs组：pbs2ml；免疫程序为猪群观察一周后进行免疫，免疫前和免疫后7d，14d采血进行体液免疫和细胞免疫实验分析；观察免疫后猪群是否会出现厌食、精神沉郁、发热、颤抖、出血、腹泻、便秘等不良反应；体液免疫分析：利用elisa试剂盒检测抗体水平；参照oie手册检测中和抗体水平；细胞免疫分析：利用elisa试剂盒检测ifn-γ水平。

本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：

本发明的一个优点在于，使用的杆状病毒表面展示载体利用vsvg的tm和ctd(vsvg-ed)替换了gp64的tm和ctd，提高了对哺乳动物细胞的转导效率和对血清补体的拮抗能力；

本发明的另一个优点在于，利用展示的pfc提高对血清补体的拮抗能力，而且有利于与抗原呈递细胞的结合提高免疫效力；

尤其重要的，重组杆状病毒免疫动物后无不良反应，而且可以有效的刺激产生体液免疫和细胞免疫。

附图说明

从下面结合附图的详细描述中，本发明的上述特征和优点将更明显，其中：

图1.重组杆状病毒转移载体结构示意图。

图2.westernblot分析pfc蛋白表达结果图。

图3.共聚焦显微镜分析pfc在细胞中的位置结果图，其中，a代表自然光图片，b代表fitc荧光图片，c代表叠加图片。

图4.重组病毒对血清补体灭活的拮抗作用结果图。

具体实施方式

以下通过实施例及附图来进一步阐明本发明的表面展示猪iggfc重组杆状病毒作为猪用疫苗载体的制备。以下实施例只是举例说明来帮助本领域的技术人员进一步理解，但不限制本发明。本领域的技术人员在不脱离本发明构思的前提下可进行修改和改进。

实施例1

1.杆状病毒表面展示载体的构建及验证

以ammultibac质粒为模板，分别扩增gp64sp和gp64tm-ctd，并在gp64sp和gp64tm-ctd之间加入6×his标签和nhei，sali，saci，ecori四个酶切位点以便于检测和外源基因的插入；将gp64sp和gp64tm-ctd依次插入pfbdm转移载体p10启动子之后；以pdsred-monomer-c1质粒为模板，扩增cmv-dsred片段插入pfbdm转移载体ph启动子之后；为了验证psur-gp64载体是否构建成功，将增强型绿色荧光蛋白egfp插入多克隆位点中检验。

2.基因克隆

vsvg-ed基因以pmd2.g载体为模板，以vsvgtm-f和vsvgtm-r为引物pcr扩增获得；puc57-pfc质粒由金唯智公司合成；e2基因以csfv石门株病毒cdna为模板，以e2-f和e2-r为引物pcr扩增获得。

3.表面展示pfc的杆状病毒重组质粒的构建

将psur-gp64的gp64tm和ctd区用vsvg的tm和ctd区替换并将补体抑制剂pfc基因克隆入载体p10启动子下游的的多克隆位点中得到psur-vsvg-ed-pfc重组杆状病毒质粒。将猪瘟e2基因克隆入cmv启动子下的多克隆位点中获得最终的重组杆状病毒质粒psur-vsvg-ed-pfc-cmv-e2。

4.tn7转座获得重组杆状病毒质粒

cacl2法制备sw106(ammultibac)感受态细胞。当培养至od600＝0.25，加入终浓度为0.1％的l-阿拉伯糖诱导，继续培养至od600＝0.5，常规方法制备感受态细胞。加入psur-vsvg-ed-pfc-cmv-e2转化，32℃振荡培养8h，涂含kan/tet/gm/iptg/x-gal的lb平板，32℃恒温培养18～24h至蓝白斑出现，挑取白斑并再次划线确认，白斑再以各基因引物pcr验证。

本发明中所用引物序列信息如表1所示：

表1本发明中所使用的引物序列信息

5.重组杆状病毒质粒bacmiddna转染sf9细胞

(1)在6孔板中每个孔中加入sf9昆虫细胞9×10⁵cells，培养基用2mlgrace’s昆虫完全培养基，含有双抗浓度为0.5×终浓度(50μg/ml青霉素，50μg/ml链霉素)。细胞是培养3～4d的对数生长期细胞，活力大于97％。置28℃培养箱中1h。

(2)取2支1.5mleppendorf管标为a、b，分别加入100μl无抗生素的grace's昆虫完全培养基培养液，a管中加入5μl的重组bacmid，混匀；b管中加入6μl脂质体转染试剂(cellfectin)，混匀(注意脂质体是一个油脂的悬浮物，可能会沉淀，使用前颠倒管子6～8次，将其混均匀)。将a管液体倒入b管，充分混匀，置室温45min，使其形成cellfectin-dna混合物。

(3)取已经贴壁生长良好的sf9单层细胞，弃旧培养液，用无抗生素的grace’s昆虫完全培养基培养液洗涤1次。

(4)取上述cellfectin-dna混合物，加入0.8ml不含抗生素的grace's昆虫完全培养基，混合均匀。从细胞中吸出弃去清洗用的培养基，将混合均匀的脂质体和重组dna混合物覆盖细胞，置28℃培养6h。

(5)吸出弃去混合物，加入含抗生素的grace’s昆虫完全培养基培养液继续培养，每天观察细胞形态及其荧光表现。观察到细胞病变作以下判断：①转染早期病变，25％～50％细胞直径增大或胞核充满细胞；②转染中期病变，细胞停止生长、细胞中出现囊泡、出现病毒包涵体或细胞从培养皿脱落；③转染晚期病变，细胞出现裂解。收集细胞，分析表达蛋白的情况。同时收集培养上清作为原毒种，分装，置－20℃贮存，作为下次感染sf9细胞用。

6.重组杆状病毒的pcr鉴定

取病毒的细胞培养物2ml，反复冻融3次，12000r/min离心15min，取上清437.5μl，加入12.5μl蛋白酶k(20mg/ml)和50μlsds液(10％)，37℃水浴30min；等体积酚/氯仿抽提一次，取上清；等体积氯仿复提，取上清；加入1/10体积naac(2mol/l)和2倍体积无水乙醇，在－20℃放置2h；在4℃以15000r/min离心15min，取沉淀；70％乙醇洗涤一次，沉淀用30μlte溶液溶解，即为提取的dna，置－70℃保存备用。以重组杆状病毒dna为模板，用通用引物扩增目的基因。

7.重组杆状病毒增殖和终点稀释法测定病毒滴度

将重组杆状病毒置入悬浮培养于含有100ml/l胎牛血清的grace培养基的昆虫细胞sf9。病毒感染昆虫细胞后会自动繁衍出病毒子代并释放至培养基之中，感染3～4d后收集上清液便完成病毒量扩增的过程。悬浮培养昆虫细胞待细胞浓度达1×10⁶cells/ml，以moi＝1(multiplicityofinfection，moi)的重组杆状病毒量感染昆虫细胞，利用病毒会在宿主昆虫细胞中复制达到病毒量放大的目的。感染3～4d后离心除去细胞及细胞碎片，收集上清液。病毒浓度是利用终点稀释法(end-pointdilutionmethod)。

8.重组蛋白的westernblot分析

sds-page电泳：12％分离胶，5％浓缩胶将pvdf膜浸泡在100％甲醇中，10s后，移至蒸馏水洗涤5min，最后置转印缓冲液中，混匀10min。蛋白质电泳结束后，利用westernblot将蛋白质转印在以甲醇浸润过的pvdf膜上，在350ma转印2.5h。将转印好的pvdf膜以含50g/l脱脂牛乳1×pbs液封闭，以阻断非特异抗原抗体的反应。室温下作用1h，以洗涤缓冲液(1.0g/ltween20inpbsbuffer)10min/次清洗3次。下面加抗体孵育。每个反应分别加入经1×pbsbuffer(含1.0g/l脱脂牛乳)适当稀释的一抗4℃下摇床感作过夜，隔日以适量洗涤液10min/次清洗3次。洗去非特异的结合。接着加入经1×pbs液(含1.0g/l脱脂牛乳)适当稀释的二抗，如hrp标记兔抗猪抗体，于室温下摇床作用1h后，以适量洗涤液10min/次清洗3次。最后用蒸馏水清洗，取出pvdf膜，稍晾干，暗房进行化学发光反应(ecl)，等量ecl试剂i:ii＝1:1，覆盖在pvdf膜上反应1min后，进行x光显影分析。

9.共聚焦显微镜分析重组蛋白在sf9细胞膜上的表现

(1)在6孔培养板中放入无菌载玻片，细胞先接种于无菌之载玻片上，细胞接入量为每孔加入1×10⁶。

(2)细胞吸附1h后，吸弃培养基，加入重组病毒在moi＝10下感染。

(3)2d后吸弃培养基，再添加1ml之methanol/acetone(1:1)甲醇丙酮于―20℃冰箱下固定5min，之后再加入1mlpbs(phosphate-bufferedsaline)摇床转速50r/min清洗2次，每次5min。

(4)接着以1ml的20ml/lbsa(bovineserumalbumin)在37℃下反应30min。

(5)之后再加入1mlpbs(phosphate-bufferedsaline)摇床转速50r/min清洗2次，每次5min。

(6)接下来加入his抗体(1:100)在37℃下反应1h，以标定表达的圆环病毒囊膜蛋白。

(7)以1ml之pbs清洗3次后，再加入fitc标记的兔抗鼠igg(1:100sigma)37℃下反应1h。

(8)最后再以1ml之pbs清洗3次。在共聚焦显微镜下观察，展示蛋白的细胞膜会被fitc染色而呈现绿色荧光。

10.抑制补体活性检测

采取健康猪血清分为两份：一份经过56℃灭活30min，另一份不灭活。将两份血清分别与重组杆状病毒37℃孵育60min，然后利用终点稀释法测定其病毒滴度。病毒存活率为未灭活处理组/灭活处理组。

11.动物免疫试验

取8头四周龄csfv抗原抗体阴性猪随机分成4组，每组2头；第1组为bv-vsvged-cmv-e2疫苗免疫组，第2组为bv-vsvged-pfc-cmv-e2疫苗免疫组，第3组为猪瘟兔化弱毒疫苗免疫组，第4组为pbs对照组。其中第1组在第0dpi和14dpi注射1.0×10⁸pfu/ml重组杆状病毒bv-vsvged-cmv-e2，第2组在第0dpi和14dpi注射1.0×10⁸pfu/ml重组杆状病毒bv-vsvged-pfc-cmv-e2，第3组注射1头份猪瘟兔化弱毒疫苗，第4组注射等体积pbs作为对照。实验动物在免疫0，7，14d进行采血分离血清。其检测项目有：(1)每日测量体温和观察期临床症状，如厌食、精神沉郁、发热、颤抖、出血、腹泻、便秘等；(2)体液免疫指标检测：血清特异性抗体水平检测和血清中和抗体水平检测；(3)细胞免疫指标检测：血清细胞因子ifn-γ含量测定。

上述检测的结果如下：

1)重组杆状病毒载体的构建及观察

重组杆状病毒载体psur-vsvg-ed-pfc-cmv-e2(图1)是穿梭载体，在特定的大肠埃希菌sw106bac内能复制，也能进入sf9细胞中复制产生重组病毒，同时表达外源基因蛋白。用专用的脂质体cellfectin将0.8μg的bacmidpsur-gp64-pfc转染昆虫sf9细胞。转染即开始观察转染细胞的cpe变化：细胞直径明显增大，细胞内因出现囊泡及病毒包涵体而颗粒增多，部分细胞裂解、死亡。说明在转染过程中，重组bacmidpsur-gp64-pfc通过脂质体介导，已经与杆状病毒dna在昆虫细胞内发生同源重组，产生了具有感染活性的重组杆状病毒。

2)westernblot分析

为了证明pfc的表达，进行westernblot分析。一抗为his单克隆抗体，二抗为a549标记的兔抗猪igg。结果可见补体抑制剂蛋白展示在昆虫细胞表面(图2)。

3)共聚焦显微镜分析重组蛋白在sf9细胞膜上的表现

为了证明pfc基因展示在昆虫细胞的细胞膜上，进行共聚焦显微镜分析。一抗为his单克隆抗体，二抗为a549标记的兔抗猪igg。结果见图4，可以看到补体抑制剂蛋白展示在昆虫细胞表面(图3)。

4)重组病毒经动物血清补体灭活后的病毒滴度

为了检测不同重组病毒对血清补体的拮抗作用，采取健康猪血清各分为两份：一份经过56℃灭活30min，另一份不灭活。将两份血清分别与重组杆状病毒37℃孵育60min，然后利用终点稀释法测定其病毒滴度。病毒存活率为未灭活处理组/灭活处理组。结果表明，展示pfc的重组病毒在猪血清中存活能力最强(图4)。

5)体液免疫指标检测：血清特异性抗体水平检测和血清中和抗体水平检测如表1和表2所示；细胞免疫指标检测：血清细胞因子ifn-γ含量测定如表3所示。

表1血清抗体水平检测

表2血清中和抗体水平检测

表3血清中ifn-γ水平检测

以上显示和描述了本发明的基本原理和主要特征和本发明的优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下，本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内。本发明要求保护范围由所附的权利要求书及其等效物界定。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

序列表

<110>陕西诺威利华生物科技有限公司

武汉中拓康明生物科技有限公司

陕西溯源农业发展有限公司

黄光东

<120>一种猪用疫苗载体

<160>16

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>666

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>1

cccatatgcccaggctgtgaagtggccgggccctcggtcttcatcttccctccaaaaccc60

aaggacaccctcatgatctcccagacccccgaggtcacgtgcgtggtggtggacgtcagc120

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<213>人工序列(artificialsequence)

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<211>222

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<213>人工序列(artificialsequence)

<400>3

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151015

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<213>人工序列(artificialsequence)

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