一种细胞色素氧化酶CYP2J2的OFF-ON型近红外荧光探针及其应用的制作方法

本发明属于生物医药技术领域，具体涉及一种细胞色素氧化酶cyp2j2的off-on型近红外荧光探针反应及其应用。

背景技术

细胞色素p450为一类亚铁血红素—硫醇盐蛋白的超家族，是表达于内质网膜上的混合功能氧化酶系统末端氧化酶，在多种内源化合物如脂肪酸、维生素、胆固醇及甾体类的代谢激活以及外源物包括药物、致癌物、环境污染物等物质的体内代谢过程中均发挥中重要作用。cyp2j2主要表达于肝外组织，其在心肌细胞和主动脉周围的上皮细胞中表达量较高。人的cyp2j2首次发现于1996年，是目前人体中发现的cyp2j亚家族中的唯一成员。cyp2j2作为重要的心血管系统平衡状态调节酶，可代谢内源化合物花生四烯酸并催化其生成多种表氧化二十碳三烯酸异构体，从而影响心血管系统的生理及病理状态。cyp2j2还高度表达于人类肿瘤组织，参与癌细胞的增殖和转移，并在多种药物的代谢中发挥重要作用。因此，开发高选择性的cyp2j2的近红外荧光探针反应及其配套的高通量检测方法具有重要的实用价值。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供一种细胞色素氧化酶cyp2j2的off-on型近红外荧光探针底物及其应用，该off-on型近红外荧光探针底物没有荧光，脱烷氧基产物具有近红外荧光发射，能够减少背景荧光干扰。利用该探针反应可对多种生物体系中cyp2j2的分布和功能进行定量评价。

本发明提供了一种细胞色素氧化酶cyp2j2的off-on型近红外荧光探针反应，该探针可被cyp2j2特异性催化生成相应的o-脱烷氧基产物，其结构通式如式(1)所示，半菁羟基烷基化结构类结构，其结构通式如下：

其中，r1为甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、异丁基、苄基等烷基链。

r2为甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、异丁基、苄基等。

r3为h，f，cl，br。

进一步的，r1为甲基、乙基；r2为甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、异丁基、苄基；r3为h。

本发明中(e)-2-(2-6-((4-甲氧基苄基)氧基)-2，3-二氢-1h-氧杂蒽-4-yl)乙烯基)-3,3-二甲基-1-丙基-3h-吲哚-碘盐(半菁羟基烷基化)类化合物具有代谢产物单一(仅生成一个o-去烷氧基产物)、代谢酶高选择性(主要由cyp2j2代谢)、代谢产物易于检测，且灵敏度高等特点。

本发明还提供了所述细胞色素氧化酶cyp2j2的off-on型近红外荧光探针反应的应用，采用上述式(1)化合物作为cyp2j2亚酶的特异性底物，进行o-脱烷氧基结合反应，通过定量检测单位时间内的底物消除率或其o-脱烷氧基产物的生成率，来定量测定不同生物体系(包括重组表达cyp2j2单酶、人或动物组织制备液、各类组织细胞等生物体系)中cyp2j2活性；具体测定方法为：

——体系中以半菁羟基烷基化类化合物作为off-on型探针底物；底物浓度选择1/10～10km；单点测定时底物浓度优选km。

——在pbs缓冲液中，反应温度为20℃至60℃之间，优选37℃为最优反应时间；孵育体系ph介于5.5～10.5之间，优选ph7.4为最优反应ph值；

——反应时间为5～120分钟，确保以上底物相应的o-脱烷氧基产物达到定量限，且底物转化率不超过20％时终止反应；

——测定单位时间内底物减少量或o-脱烷氧基产物生成量作为cyp2j2活性的评价指标。

本发明提供的细胞色素氧化酶cyp2j2的off-on型近红外荧光探针反应的应用，该探针底物没有荧光，其o-脱烷氧基产物具有近红外荧光属性，可采用荧光检测器同时实现底物及产物的快速、灵敏检测；o-脱烷氧基产物荧光检测条件分别为：激发波长656nm，最大发射波长为718nm。

该特异性探针底物为off-on型近红外荧光探针，其在cyp2j2活性检测过程不易受生物体系基质及杂质的干扰，可用于各种重组cyp2j2、人及动物组织制备液及各类组织细胞中cyp2j2酶活力的定量测定；同时也可作为在体及动物整体cyp2j2的探针底物，评估代谢酶cyp2j2的个体及种属差异。该探针底物及o-脱烷氧基代谢产物的荧光检测方法，还可用于cyp2j2抑制剂的快速筛选及抑制能力的定量评价。

采用重组细胞色素氧化酶cyp2j2单酶，肝微粒体孵育体系进行考察，通过相关性分析，重组单酶代谢反应，特异性抑制实验，以及酶反应动力学几方面的证据，证明半菁羟基烷基化类化合物可特异性的经细胞色素氧化酶cyp2j2代谢，生成o-脱烷氧基产物。进一步采用各种哺乳动物的新鲜提取的肝细胞﹑原代培养肝细胞、肝切片﹑肝灌流等代谢评价体系进行考察，发现该代谢反应具有非常良好的特异性。

作为高特异性的细胞色素氧化酶cyp2j2单酶的近红外荧光探针底物，该化合物可以用来检测cyp2j2的活性，尤其适合用于对细菌、昆虫细胞、哺乳动物细胞以及酵母菌克隆表达体系生产的cyp2j2酶活测定，以及多种哺乳动物组织器官来源的微粒体、s-9等制备物中cyp2j2的活性标定。该探针能够检测肿瘤中cyp2j2活性，并且能用于评估肿瘤迁徙过程中cyp2j2活性及其功能。此外，该探针还能用于血液中cyp2j2活性评估，以及评估血管新生过程中cyp2j2活性及其功能。

选用本发明所述细胞色素氧化酶cyp2j2单酶的off-on型近红外荧光探针反应检细胞色素氧化酶cyp2j2单酶体外活性具有以下突出优势：

(1)高特异性：半菁羟基烷基化类化合物可被细胞色素氧化酶cyp2j2单酶高特异性地代谢成一个代谢产物，即o-脱烷氧基产物。

(2)廉价易得：半菁羟基烷基化类化合物可经化学合成获得，合成工艺简单易行，荧光方法检测成本低。

(3)高灵敏度：具有半菁羟基烷基化类化合物均具有良好的近红外荧光发射光谱特性，能更好的减少背景荧光干扰，同时可通过off-on型标准曲线的建立进行定量测定cyp2j2单酶的检测下限为0.024mg/ml。

附图说明

图1.半菁羟基烷基化类化合物的结构通式。

图2.(e)-2-(2-6-((4-甲氧基苄基)氧基)-2，3-二氢-1h-氧杂蒽-4-yl)乙烯基)-3,3-二甲基-1-丙基-3h-吲哚-碘盐的¹h-nmr谱图。

图3.(e)-2-(2-6-((4-甲氧基苄基)氧基)-2，3-二氢-1h-氧杂蒽-4-yl)乙烯基)-3,3-二甲基-1-丙基-3h-吲哚-碘盐的¹³c-nmr谱图。

图4.(e)-2-(2-6-((4-甲氧基苄基)氧基)-2，3-二氢-1h-氧杂蒽-4-yl)乙烯基)-3,3-二甲基-1-丙基-3h-吲哚-碘盐及其o-脱烷氧基代谢产物的高分辨质谱图。

图5.(e)-2-(2-6-((4-乙氧基苄基)氧基)-2，3-二氢-1h-氧杂蒽-4-yl)乙烯基)-3,3-二甲基-1-丙基-3h-吲哚-碘盐的¹h-nmr谱图。

图6.(e)-2-(2-6-((4-乙氧基苄基)氧基)-2，3-二氢-1h-氧杂蒽-4-yl)乙烯基)-3,3-二甲基-1-丙基-3h-吲哚-碘盐的¹³c-nmr谱图。

图7.(e)-2-(2-6-((4-乙氧基苄基)氧基)-2，3-二氢-1h-氧杂蒽-4-yl)乙烯基)-3,3-二甲基-1-丙基-3h-吲哚-碘盐及其o-脱烷氧基代谢产物的高分辨质谱图。

图8.13例hlm对(e)-2-(2-6-((4-甲氧基苄基)氧基)-2，3-二氢-1h-氧杂蒽-4-yl)乙烯基)-3,3-二甲基-1-丙基-3h-吲哚-碘盐的代谢图。

图9.(e)-2-(2-6-((4-甲氧基苄基)氧基)-2，3-二氢-1h-氧杂蒽-4-yl)乙烯基)-3,3-二甲基-1-丙基-3h-吲哚-碘盐及其o-脱烷氧基代谢速率与非那西汀的o-脱乙基代谢速率的相关性分析实验。

图10.(e)-2-(2-6-((4-甲氧基苄基)氧基)-2，3-二氢-1h-氧杂蒽-4-yl)乙烯基)-3,3-二甲基-1-丙基-3h-吲哚-碘盐的人cyp重组单酶筛选试验结果。

图11.(e)-2-(2-6-((4-甲氧基苄基)氧基)-2，3-二氢-1h-氧杂蒽-4-yl)乙烯基)-3,3-二甲基-1-丙基-3h-吲哚-碘盐指示人肺癌细胞a549迁徙过程中细胞色素p4502j2活性图。

图12.(e)-2-(2-6-((4-甲氧基苄基)氧基)-2，3-二氢-1h-氧杂蒽-4-yl)乙烯基)-3,3-二甲基-1-丙基-3h-吲哚-碘盐指示人脐静脉内皮细胞血管新生过程中细胞色素p4502j2活性图。

图13.(e)-2-(2-6-((4-甲氧基苄基)氧基)-2，3-二氢-1h-氧杂蒽-4-yl)乙烯基)-3,3-二甲基-1-丙基-3h-吲哚-碘盐指示白细胞中细胞色素p4502j2活性图。

图14.cyp2j22介导(e)-2-(2-6-((4-甲氧基苄基)氧基)-2，3-二氢-1h-氧杂蒽-4-yl)乙烯基)-3,3-二甲基-1-丙基-3h-吲哚-碘盐的代谢通路。

图15.(e)-2-(2-6-((4-甲氧基苄基)氧基)-2，3-二氢-1h-氧杂蒽-4-yl)乙烯基)-3,3-二甲基-1-丙基-3h-吲哚-碘盐的合成路线。

具体实施方式

下面的实施例将对本发明予以进一步的说明，但并不因此而限制本发明。

实施例1.(e)-2-(2-6-((4-甲氧基苄基)氧基)-2，3-二氢-1h-氧杂蒽-4-yl)乙烯基)-3,3-二甲基-1-丙基-3h-吲哚-碘盐的合成

54mg(e)-2-(2-6-羟基-2，3-二氢-1h-氧杂蒽-4-yl)乙烯基)-3,3-二甲基-1-丙基-3h-吲哚-碘盐、40mg4-甲氧基苄溴和55.3mg碳酸钾加入到10ml乙腈中，氮气保护下50℃反应三小时，降至室温，将溶剂旋干，残余固体用二氯甲烷：甲醇(体积比25:1)进行柱层析分离，得到36mg蓝绿色固体，即为(e)-2-(2-6-((4-甲氧基苄基)氧基)-2，3-二氢-1h-氧杂蒽-4-yl)乙烯基)-3,3-二甲基-1-丙基-3h-吲哚-碘盐。

¹hnmr(500mhz,cdcl3)δ8.63(d,j＝14.9hz,1h),7.49(dd,j＝13.1,7.4hz,2h),7.44–7.35(m,5h),7.25(s,1h),6.99–6.89(m,4h),6.63(d,j＝14.9hz,1h),5.13(s,2h),4.53(t,j＝7.1hz,2h),3.82(s,3h),2.77(dt,j＝22.9,5.8hz,4h),2.00(d,j＝7.3hz,4h),1.76(s,6h),1.09(t,j＝7.4hz,3h).¹³cnmr(125mhz,cdcl3)δ177.31,162.24,161.75,159.82,154.37,145.62,141.65,134.07,129.51,129.22,129.00,127.71,127.40,127.22,122.52,115.99,115.01,114.21,113.66,112.73–112.78,104.05,101.98,70.80,55.39,50.58,47.30,29.17,28.34,24.42,21.36,20.35,11.58.hrms(esi+):m/zcalcdfor(c36h38no3)⁺[m]⁺532.2846,found532.2840.

注：化合物(e)-2-(2-6-((4-甲氧基苄基)氧基)-2，3-二氢-1h-氧杂蒽-4-yl)乙烯基)-3,3-二甲基-1-丙基-3h-吲哚-碘盐的¹h-nmr谱图、¹³c-nmr谱图以及高分辨质谱谱图如图2、3、4所示。

实施例2.(e)-2-(2-6-((4-乙氧基苄基)氧基)-2，3-二氢-1h-氧杂蒽-4-yl)乙烯基)-3,3-二甲基-1-丙基-3h-吲哚-碘盐的合成

54mg(e)-2-(2-6-羟基-2，3-二氢-1h-氧杂蒽-4-yl)乙烯基)-3,3-二甲基-1-丙基-3h-吲哚-碘盐、43mg4-乙氧基苄溴和55.3mg碳酸钾加入到10ml乙腈中，氮气保护下50℃反应三小时，降至室温，将溶剂旋干，残余固体用二氯甲烷：甲醇(体积比25:1)进行柱层析分离，得到34mg蓝绿色固体，即为(e)-2-(2-6-((4-乙氧基苄基)氧基)-2，3-二氢-1h-氧杂蒽-4-yl)乙烯基)-3,3-二甲基-1-丙基-3h-吲哚-碘盐。

¹hnmr(500mhz,cdcl3)δ8.63(d,j＝14.9hz,1h),7.55–7.44(m,2h),7.44–7.35(m,5h),7.24(s,1h),6.99–6.88(m,4h),6.63(d,j＝14.8hz,1h),5.13(s,2h),4.54(t,j＝7.1hz,2h),4.05(q,j＝6.9hz,2h),2.78(dt,j＝26.7,5.7hz,4h),2.05–1.90(m,4h),1.80(s,6h),1.42(t,j＝7.0hz,4h),1.09(t,j＝7.4hz,3h).¹³cnmr(125mhz,cdcl3)δ177.25,162.27,161.82,159.19,154.36,145.59,141.66,141.58,134.16,129.49,129.22,129.02,127.51,127.36,127.22,122.53,115.97,114.98,114.75,113.70,112.78,103.96,101.99,70.84,63.55,50.58,47.35,29.15,28.37,24.48,21.34,20.33,14.80,11.58.hrms(esi+):m/zcalcdfor(c37h40no3)⁺[m]⁺546.3003,found546.2997.

注：化合物(e)-2-(2-6-((4-乙氧基苄基)氧基)-2，3-二氢-1h-氧杂蒽-4-yl)乙烯基)-3,3-二甲基-1-丙基-3h-吲哚-碘盐的¹h-nmr谱图、¹³c-nmr谱图以及高分辨质谱谱图如图5、6、7所示。

实施例3.体外测定人重组cyp单酶的选择性

(1)预先准备90μlcyp代谢反应体系，包括ph7.4的pbs缓冲液(100mm)、重组人cyp各单酶，(e)-2-(2-6-((4-甲氧基苄基)氧基)-2，3-二氢-1h-氧杂蒽-4-yl)乙烯基)-3,3-二甲基-1-丙基-3h-吲哚-碘盐终浓度为10μm，于37℃条件下震荡预孵3分钟；

(2)向反应体系中加入10μl浓度为10mm的nadp⁺起始反应；

(3)40分钟后，加入50μl冰乙腈，剧烈震荡后，终止反应；

(4)用高速冷冻离心机在4℃，20,000×g的条件下，高速离心20分钟后，取上清，进行荧光检测(ex＝656nm，em＝718nm)；重组人cyp2j2酶的选择性最高约是其它单酶的46倍左右(图8)。

实施例4.不同个体来源肝微粒体中cyp2j22的活性定量评估

(1)选取13例人肝微粒体(hlm)，准备cyp2j2代谢反应体系，包括ph7.4的pbs缓冲液(100mm)、人肝微粒体(0.25mg/ml)、nadp⁺10mm，6-磷酸葡萄糖100mm，葡萄糖-6-磷酸脱氢酶1unit/ml，mgcl240mm，(e)-2-(2-6-((4-甲氧基苄基)氧基)-2，3-二氢-1h-氧杂蒽-4-yl)乙烯基)-3,3-二甲基-1-丙基-3h-吲哚-碘盐终浓度为10μm，于37℃条件下震荡预孵3分钟；

(2)向反应体系中加入10μl浓度为10mm的nadp⁺起始反应；

(3)30分钟后，加入10μl冰乙腈，剧烈震荡后，终止反应；

(4)用高速冷冻离心机在4℃，20,000×g的条件下，高速离心20分钟后，取上清，进行荧光检测(ex＝656nm，em＝718nm)，将所获荧光强度代入标准曲线后得到14例人肝微粒体(hlm)对(e)-2-(2-6-((4-甲氧基苄基)氧基)-2，3-二氢-1h-氧杂蒽-4-yl)乙烯基)-3,3-二甲基-1-丙基-3h-吲哚-碘盐的代谢速率(图9)。

实施例5.体外测定cyp2j2的检测下限测定

实验在酶标仪上使用96孔板进行测定，(e)-2-(2-6-((4-甲氧基苄基)氧基)-2，3-二氢-1h-氧杂蒽-4-yl)乙烯基)-3,3-二甲基-1-丙基-3h-吲哚-碘盐10μm，nadp⁺10mm，6-磷酸葡萄糖100mm，葡萄糖-6-磷酸脱氢酶1unit/ml，mgcl240mm，cyp2j22单酶0.0075mg/ml～0.1mg/ml，ph7.4的pbs缓冲液50mm，总体积为100μl，37℃下孵育1h后通过酶标仪分析，每组的平均值与不加cyp2j2的对照组比较，结果表明0.024mg/ml的cyp2j2具有统计学意义(p＜0.05)，因此确定cyp2j2的检测下限为0.024mg/ml。

实施例6.cyp2j2蛋白浓度标准曲线测定

实验在酶标仪上使用96孔板进行测定，(e)-2-(2-6-((4-甲氧基苄基)氧基)-2，3-二氢-1h-氧杂蒽-4-yl)乙烯基)-3,3-二甲基-1-丙基-3h-吲哚-碘盐10μm，nadp⁺10mm，6-磷酸葡萄糖100mm，葡萄糖-6-磷酸脱氢酶1unit/ml，mgcl240mm，cyp2j2单酶0mg/ml～0.45mg/ml，ph7.4的pbs缓冲液50mm，总体积为100μl，37℃下孵育60min，产物的荧光强度比底物的荧光强度的比值与蛋白浓度做标准曲线，每条标准曲线的r²＞0.99，表明标准曲线线性范围宽广，可准确定量cyp2j2的含量。(图10)

实施例7.肿瘤迁徙过程中cyp2j2活性评估

实验在共聚焦上进行测定，借助划线法实验开展cyp2j2活性对细胞迁移的影响(图11)。简要来讲，a549细胞分别转染cyp2j2的sirna或空白对照sirna，处理24小时。随后两组细胞被分别种于六孔板，于细胞张满后用枪头划线。48小时后，不同组细胞用(e)-2-(2-6-((4-甲氧基苄基)氧基)-2,3-二氢-1h-氧杂蒽-4-yl)乙烯基)-3,3-二甲基-1-丙基-3h-吲哚-碘盐2.5μm处理、染色。_随后使用磷酸缓冲溶液清洗残余探针，并拍照(ex＝633nm，em＝690-750nm)。

实施例8.血管新生过程中cyp2j2活性评估

人脐静脉内皮细胞(huvec，2×10⁴)种于已包埋基质胶的ibitreat血管新生小室，并于24小时后借助共聚焦拍摄图片。成球试验操作同上。基质胶成分为纤维蛋白原(3毫克)，凝血酶(0.1活力单位)溶解于1毫升的无血清dmem细胞培养基。不同组别利用(e)-2-(2-6-((4-甲氧基苄基)氧基)-2,3-二氢-1h-氧杂蒽-4-yl)乙烯基)-3,3-二甲基-1-丙基-3h-吲哚-碘盐2.5μm处理、染色。血管新生情况基于新生血管的血管累积长度计算，且至少5条随机选择的血管被用来分析(ex＝633nm，em＝690-750nm)同时选择fitc-lectin作为新生血管的指示剂(ex＝488nm，em＝500-560nm)(图12)。

实施例9.人白细胞中cyp2j2活性评估

取恶性血液病患者(包括急性白血病、慢性白血病及淋巴瘤等)外周血3毫升，同时收集健康志愿者外周血3毫升。提取外周血白细胞并加入(e)-2-(2-6-((4-甲氧基苄基)氧基)-2,3-二氢-1h-氧杂蒽-4-yl)乙烯基)-3,3-二甲基-1-丙基-3h-吲哚-碘盐2.5μm处理，于37℃下孵育。利用磷酸缓冲溶液清洗后，分别进行流式细胞仪分析和共聚焦成像(ex＝633nm，em＝690-750nm)，(图13)。