鸡细小病毒和鸡新城疫病毒二重PCR检测方法的建立与流程

本发明属于生物技术领域，涉及一种鸡细小病毒和鸡新城疫病毒二重pcr检测方法的建立。

背景技术

鸡细小病毒(chinckenparvovirus，chpv)是引起鸡肠道疾病重要的病原体之一，可以引起鸡群出现以腹泻、精神抑郁、体温调节障碍、生长迟缓、增加饲料消耗等为特征的急性或慢性肠道性疾病、矮小综合症、营养不良综合症。在鸡群中普遍存在，主要侵害雏鸡，其中以商品肉鸡感染率较高，蛋鸡或种鸡次之。自2010年以来，北美、波兰、巴西、匈牙利、克罗地亚和南韩等国家相继暴发了该病，给养鸡业造成较大的经济损失。新城疫(newcastledisease,nd)是由新城疫病毒(newcastlediseasevirus,ndv)引起的一种多病型的急性、高度接触性传染病。当禽类感染ndv时，发病急，病情重，常出现高热、黏膜出血、呼吸困难及下痢等症状，且引起较高的死亡率。ndv由一条不分节段的单股负链rna组成，包含np、p、m、f、hn和l，共6种结构蛋白。目前，nd是影响养禽业发展的主要疾病，我国已将其列为一类动物疫病，也是我国规模化鸡场的常发病和多发病。而chpv是养禽业中的一种新发传染病病毒，在世界范围内流行，chpv和ndv引起的疾病给我国养禽业带来极大的经济损失，因此，建立一种快速检测chpv与ndv的诊断方法十分必要。zsak等根据chpvns1基因的保守序列，建立了chpv的快速特异pcr检测方法；carratalà等建立了检测chpv的taqman探针荧光定量pcr；finkler等根据chpvns1基因的保守序列建立了sybrgreen-based荧光定量pcr方法；奉彬等建立了检测chpv半巢式pcr方法。明文龙等建立了鉴别ndv强弱毒一步rt-pcr；周小桐等建立了检测ndv的real-timert-pcr。

技术实现要素：

本发明的一个目的是提供鉴定鸡细小病毒和鸡新城疫病毒的成套引物。

本发明提供了鉴定鸡细小病毒和鸡新城疫病毒的成套引物，其由如下引物1至引物4组成：

所述引物1为如下(a1)或(a2)：

(a1)序列表的序列1所示的单链dna分子；

(a2)将序列1经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列1具有相同功能的dna分子；

所述引物2为如下(a3)或(a4)：

(a3)序列表的序列2所示的单链dna分子；

(a4)将序列2经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列2具有相同功能的dna分子；

所述引物3为如下(a5)或(a6)：

(a5)序列表的序列3所示的单链dna分子；

(a6)将序列3经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列3具有相同功能的dna分子；

所述引物4为如下(a7)或(a8)：

(a7)序列表的序列4所示的单链dna分子；

(a8)将序列4经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列4具有相同功能的dna分子。

上述成套引物中，所述引物1、所述引物2、所述引物3、所述引物4的摩尔比为1:1:1:1。

上述成套引物中各引物均为独立包装。

本发明另一个目的是提供鉴定鸡细小病毒和鸡新城疫病毒的pcr试剂。

本发明提供的pcr试剂，包括上述的成套引物，

所述引物1、所述引物2、所述引物3、所述引物4在所述pcr试剂中的浓度均为0.4pmol/μl。

含有上述的成套引物或上述的pcr试剂的试剂盒也是本发明保护的范围。

上述的成套引物或上述pcr试剂或上述试剂盒在如下(c1)至(c6)中的任一种中的应用也是本发明保护的范围：

(c1)鉴别鸡细小病毒和/或鸡新城疫病毒；

(c2)制备用于鉴别鸡细小病毒和/或鸡新城疫病毒的产品；

(c3)检测待测病原微生物是否为鸡细小病毒和/或鸡新城疫病毒；

(c4)制备用于检测待测病原微生物是否为鸡细小病毒和/或鸡新城疫病毒的产品；

(c5)检测待测样本中是否含有鸡细小病毒和/或鸡新城疫病毒；

(c6)制备用于检测待测样本中是否含有鸡细小病毒和/或鸡新城疫病毒的产品。

本发明第3个目的是提供上述试剂盒的制备方法。

本发明提供的上述试剂盒的制备方法，包括将各条引物单独包装的步骤。

本发明第4个目的是提供一种鉴别待测样本是否含有鸡细小病毒和/或鸡新城疫病毒的方法。

本发明提供的方法，包括如下步骤：提取待测样本的核酸作为模板，用上述的成套引物进行二重pcr扩增，检测pcr扩增产物，进行如下判断：

若所述pcr扩增产物符合如下条件a和条件b：所述条件a为所述pcr扩增产物含有650-700bp大小的片段、所述条件b为所述pcr扩增产物含有450-500bp大小的片段，则所述待测样本含有或候选含有鸡细小病毒和鸡新城疫病毒，若不符合所述条件a和所述条件b，则所述待测样本不含有或候选不含有鸡细小病毒和鸡新城疫病毒；

或，若所述pcr扩增产物符合所述条件a，则待测样本中含有或候选含有鸡细小病毒；若不符合所述条件a，则所述待测样本不含有或候选不含有鸡细小病毒；

或，若所述pcr扩增产物符合所述条件b，则待测样本中含有或候选含有新城疫病毒；若不符合所述条件b，则所述待测样本不含有或候选不含有新城疫病毒。

本发明第5个目的是提供一种检测病原微生物是否为鸡细小病毒和/或鸡新城疫病毒的方法。

本发明提供的方法，包括如下步骤：提取待测病原微生物的核酸作为模板，用上述的成套引物进行二重pcr扩增，检测pcr扩增产物，进行如下判断：

若所述pcr扩增产物符合如下条件a：含有650-700bp大小的片段，则待测病原微生物为或候选为鸡细小病毒；若不符合所述条件a，则所述待测病原微生物不为或候选不为鸡细小病毒；

或，若所述pcr扩增产物符合如下条件b：含有450-500bp大小的片段，则待测样本为或候选为新城疫病毒；若不符合所述条件b，则所述待测病原微生物不为或候选不为新城疫病毒。

上述方法中，

所述650-700bp大小的片段为687bp大小的片段，具体核苷酸序列为序列5或与其同源性大于90％的序列；

或，所述450-500bp大小的片段为453bp大小的片段，具体核苷酸序列为序列6或与其同源性大于90％的序列；

或，所述二重pcr扩增的模板为dna或由rna反转录得到cdna；

和/或，所述二重pcr扩增的退火温度为58.5℃。

上述方法中，所述样本为鸡喉头拭子或泄殖腔拭子；

或所述病原微生物为病毒。

本试验建立的二重pcr技术能够对chpv和ndv两种家禽常见传染病病原进行快速的鉴别诊断，与常规的检测技术相比，多重pcr在普通pcr的基础上进行了改进，利用多对引物同时扩增多个模板，弥补了普通pcr的不足，极大地缩短了检测时间，提高了检测效率，节省了大量的人力物力等资源，有利于此类疫病的预防、控制和扑灭，但是，多重pcr的同一体系中存在不同的引物对和模板，可能使得扩增反应中不同模板之间、引物对之间和引物对与模板之间存在竞争性抑制。引物的数量虽然可以不加限制，但是引物之间确实存在相互作用，引物越多，引物之间的相互作用越复杂，影响引物的扩增效果。因此，试验中应该对各种条件分别进行优化，尽量避免因引物对和模板之间的非特异性结合而产生的非特性扩增。此外，扩增的目的片段需要有合适的退火梯度，使得各引物对退火条件尽可能保持一致，以保证其扩增产物量的相对平衡。

本试验针对chpvns1基因和ndvf基因的保守序列设计引物，能够同时扩增出chpv和ndv的2段特异性片段，长度分别为687和453bp，目的片段之间具有明显的长度差异(＞100bp)，在同一体系中便于鉴别，且每一对引物的扩增效率高、特异性强。本试验建立的方法能够检测到样本中chpv和ndv核酸，因此，可用于监控鸡群感染chpv和ndv后的排毒情况及临床上chpv和ndv流行病学的监测。核酸质量的好坏是直接影响pcr灵敏度的另一重要因素。在鉴定二重pcr的敏感性时，将二重pcr与单重pcr的核酸最低检测量进行对比，相应减少了1×10¹～1×10²个数量级，仍具有很高的敏感性(可以检测到chpv以及ndv核酸的最低含量分别为6.4和2.5pg)，完全可以满足疫病检测的要求。在临床检测中往往以粪便(棉拭子)为样品，但是由于粪便中含有多种抑制pcr反应因子，因此建议使用商品化的核酸提取试剂盒以获得较好质量的核酸。此外，为了减少样品的假阴性，采样后应对样品尽快进行处理，且将样品置于低温条件下运输、保存。

本研究用建立的chpv和ndv二重pcr方法对来自广西区内的50份病料进行检测，采用一步法扩增与chpv和ndv二重pcr方法对临床病料分别进行了检测对比，结果两者的符合率为100％，检测结果表明，广西区内鸡群存在chpv与ndv的混合感染，提示在鸡群养殖中应注意防制chpv与ndv的混合感染。该方法可以在同一份样品中同时检测出两种病原体，符合临床上对多种疾病的同步诊断的要求，对于这两种病的鉴别诊断和混合感染检测具有重要的临床应用价值。本试验所建立的chpv和ndv二重pcr方法可以用于临床chpv和ndv的混合感染的快速检测，适于大批量检测，既可节约成本和节省时间，又能减少污染，具有很高的实用价值。

附图说明

图1为chpv和ndv二重pcr引物体积的优化。

图2为chpv和ndv二重温度梯度pcr。

图3为chpv和ndv二重pcr特异性试验结果。

图4为chpv和ndv二重pcr敏感性试验结果。

图5为部分临床样品的chpv和ndv二重pcr检测结果。

具体实施方式

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

下述实施例中所用的病毒与试剂如下：

鸡细小病毒(chickenparvovirus，缩写为chpv)：记载在如下参考文献：dayjm,zsakl.determinationandanalysisofthefull-lengthchickenparvovirusgenome.[j].virology,2010,399(1):59-64.；公众可以从广西壮族自治区兽医研究所获得。

新城疫病毒ndvlasota株、新城疫病毒ndvf48e9株、ndvⅰ株：记载在如下参考文献：谢志勤,谢芝勋,邓显文,等.鸡新城疫病毒、h9亚型禽流感病毒和禽肺炎病毒三重rt-pcr检测方法的建立[j].中国兽医杂志,2017(2):6-9.；公众可以从广西壮族自治区兽医研究所获得。

马立克病毒(mdv)：记载在如下参考文献：邓显文,谢芝勋,谢志勤,等.鸡传染性贫血病毒病lamp快速可视化检测方法的建立[j].家畜生态学报,2011,32(6):57-60.；公众可以从广西壮族自治区兽医研究所获得。

传染性支气管炎病毒(ibvmass41)：记载在如下参考文献：谢志勤,谢芝勋,邓显文,等.鸡新城疫病毒、h9亚型禽流感病毒和禽肺炎病毒三重rt-pcr检测方法的建立[j].中国兽医杂志,2017(2):6-9.；公众可以从广西壮族自治区兽医研究所获得。

传染性喉气管炎病毒(ailtvbeijing)：记载在如下参考文献：谢志勤,谢芝勋,邓显文,等.鸡新城疫病毒、h9亚型禽流感病毒和禽肺炎病毒三重rt-pcr检测方法的建立[j].中国兽医杂志,2017(2):6-9.；公众可以从广西壮族自治区兽医研究所获得。

禽肺炎病毒(apvmn-10)记载在如下参考文献：谢志勤,谢芝勋,邓显文,等.鸡新城疫病毒、h9亚型禽流感病毒和禽肺炎病毒三重rt-pcr检测方法的建立[j].中国兽医杂志,2017(2):6-9.；公众可以从广西壮族自治区兽医研究所获得。

禽大肠杆菌(e.colio2)记载在如下参考文献：谢志勤,谢芝勋,邓显文,等.鸡新城疫病毒、h9亚型禽流感病毒和禽肺炎病毒三重rt-pcr检测方法的建立[j].中国兽医杂志,2017(2):6-9.；公众可以从广西壮族自治区兽医研究所获得。

禽呼肠孤病毒s1133株记载在如下参考文献：谢志勤,谢芝勋,邓显文,等.鸡新城疫病毒、h9亚型禽流感病毒和禽肺炎病毒三重rt-pcr检测方法的建立[j].中国兽医杂志,2017(2):6-9.；公众可以从广西壮族自治区兽医研究所获得。

dna/rna共提试剂盒购自北京全式金生物技术有限公司；minibestbacteriagenomicdna抽提试剂盒购于大连takara公司；胶回收试剂盒购自axygen生物技术(杭州)有限公司；100bpladdermarker、反转录试剂盒、pmd18-t载体试剂盒、2×taqpcrmix购自宝生物工程(大连)有限公司。

实施例1、鸡细小病毒和鸡新城疫病毒二重pcr检测专用引物和方法的建立

一、鸡细小病毒和鸡新城疫病毒二重pcr检测专用引物的设计合成

参照genbank中chpvns1基因、ndvf基因保守序列，应用引物设计软件dnastar和primer5.0，最后经过ncbiblast比对验证，设计出2对特异性引物。引物合成于北京六合华大基因科技股份有限公司(见表1)。

表1为chpv和ndv引物序列

二、鸡细小病毒和鸡新城疫病毒二重pcr检测方法的建立

1、dna/rna抽提及rna反转录

根据dna/rna共提试剂盒说明书提取鸡细小病毒(chickenparvovirus，缩写为chpv)dna；同时抽提新城疫病毒ndvlasota株的的rna，参照反转录说明书将rna反转录成cdna，直接用于试验，之后将dna于-30℃保存备用。

2、chpv和ndv二重pcr反应条件的优化

二重pcr反应体系总体积为25.0μl，包含chpv上下游引物和ndv上下游引物各0.2-1.6μl(各引物浓度稀释为10pmol/μl，各条引物在体系中的浓度：0.4pmol/μl)；2×pcrmix(takaraextaqmix,rr902a)12.5μl；chpv和ndv的dna各1.0μl共2.0μl的混合模板，最后用ddh2o补足至25.0μl。

反应程序为：95℃预变性5min；94℃变性1min，退火温度共设置8个温度梯度(50.0-64.0℃)，72℃作用1min，共进行35个循环；最后72℃延伸10min，结束反应。

优化内容为对二重pcr各引物浓度、体积；对退火温度进行优化。

将各个引物浓度、体积、退火温度条件下得到的pcr产物用1.2％琼脂糖凝胶电泳进行验证，拍照保存结果。

检测pcr扩增产物，判断标准如下：

若所述pcr扩增产物符合如下条件a和条件b：所述条件a为所述pcr扩增产物含有650-700bp大小的片段(具体687bp，序列5)、所述条件b为所述pcr扩增产物含有450-500bp大小的片段(具体为453bp，序列6)，则所述待测样本含有或候选含有鸡细小病毒和鸡新城疫病毒，若不符合所述条件a和所述条件b，则所述待测样本不含有或候选不含有鸡细小病毒和鸡新城疫病毒；

若所述pcr扩增产物符合所述条件a，则待测样本中含有或候选含有鸡细小病毒；若不符合所述条件a，则所述待测样本不含有或候选不含有鸡细小病毒；

若所述pcr扩增产物符合所述条件b，则待测样本中含有或候选含有新城疫病毒；若不符合所述条件b，则所述待测样本不含有或候选不含有新城疫病毒。

chpv和ndv二重pcr引物体积的优化结果如图1所示，m：100bpdnaladdermarker；1-8：0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4、1.6μlchpv引物；1-8：1.6、1.4、1.2、1.0、0.8、0.6、0.4、0.2μlndv引物；n：阴性对照；最佳引物浓度组合确定为：chpv上、下游引物，ndv上、下游引物各1.0μl。

chpv和ndv二重pcr退火温度优化结果如图2所示，m：100bpdnaladdermarker；1：50.0℃；2：51.0℃；3：52.7℃；4：55.3℃；5：58.5℃；6：61.2℃；7：62.9℃；8：64.0℃；n：阴性对照negativecontrol；可以看出，最佳的退火温度为58.5℃。

因此，最佳的二重pcr反应体系是：2×pcrmix12.5μl，chpv上、下游引物各1μl(每个引物在体系中的终浓度：0.4pmol/μl)，ndv上、下游引物各1.0μl(每个引物在体系中的终浓度：0.4pmol/μl)，混合模板chpv和ndv的dna各1.0μl，ddh2o补足至25.0μl。

最佳的反应程序为：95℃预变性5min；95℃变性1min，58.5℃退火1min，72℃作用1min，共进行35个循环；最后72℃延伸10min，结束反应。

三、chpv和ndv二重pcr试剂盒的制备

将chpv上、下游引物和ndv上、下游引物单独包装，得到chpv和ndv二重pcr试剂盒；

或将二重pcr反应体系单独包装，得到chpv和ndv二重pcr试剂盒。

实施例2、chpv和ndv二重pcr鉴定

一、chpv和ndv二重pcr特异性试验

提取chpv、ndv、arv、mdv、apv、ibv、ailtv和e.coli的dna或rna，以dna或者rna反转录得到的cdna作为模板进行二重pcr反应，其中二重pcr反应的反应体系为实施例1的最佳的二重pcr反应体系，反应程序为实施例1的最佳的反应程序，判断通上述实施例1的判断标准。

结果如图3所示，m：100bpdnaladdermarker；n：阴性对照；1：ndv；2：chpv；3：chpv+ndvf48e9；4：chpv+ndvlasota；5：chpv+ndvⅰ；6：禽呼肠孤病毒；7：马立克病毒；8：禽肺炎病毒；9：鸡传染性支气管炎病毒；10：鸡传染性喉气管炎病毒；11：禽大肠杆菌；可以看出，3：chpv+ndvf48e9；4：chpv+ndvlasota；5：chpv+ndvⅰ能够扩增出chpv687bp239bp和ndv405bp的特异性条带；而apv、mdv、arv、ibv、ailtv和e.coli均不出现特异性条带。

二、chpv和ndv二重pcr敏感性试验

提取chpv和ndvf48e9的核酸，经beckmanuv-800紫外分光光度计对核酸浓度进行测定，chpv和ndvf48e9的核酸浓度分别为63.6ng/μl和25.3ng/μl。

分别以10倍梯度稀释后的chpv和ndvf48e9核酸作为模板进行二重pcr反应，其中二重pcr反应的反应体系为实施例1的最佳的二重pcr反应体系，反应程序为实施例1的最佳的反应程序，判断通上述实施例1的判断标准。同时设置阴性对照。

结果如图4所示，m：100bpdnaladdermarker；1：636pgchpv+253pgndv；2：64pgchpv+25pgndv；3：6.4pgchpv+2.5pgndv；4：636fgchpv+253fgndv；5：64fgchpv+25fgndv；6：6.4fgchpv+2.5fgndv；7：0.64fgchpv+0.25fgndv；8：0.064fgchpv+0.025fgndv；n：阴性对照negativecontrol；可以看出，本发明的方法最低能同时检测到64fgchpv和25fgndv，其灵敏度高。

三、chpv和ndv二重pcr临床样品检测

从2014年10月-2017年10月采集的样品(鸡喉头、泄殖腔双棉拭子)中随机抽取50份，dna/rna共提试剂盒提取核酸。

以提取的核酸作为模板，进行二重pcr反应，其中二重pcr反应的反应体系为实施例1的最佳的二重pcr反应体系，反应程序为实施例1的最佳的反应程序。样品重复检测两次，判断通上述实施例1的判断标准。

结果如图5所示，m：100bpdnaladdermarker；p：阳性对照；n：阴性对照；3-23：临床病料；可以看出，有9份chpv阳性样品，1份ndv阳性样品，其中包括1份chpv与ndv混合感染，未见chpv和ndv二重感染。

以50份样品提取的核酸作为模板，进行一步法pcr反应，一步法即相同的体系，退火温度，只分别加一对引物的扩增方法；采用一步法扩增与chpv和ndv二重pcr方法对临床病料分别进行了检测对比，结果两者的符合率为100％，表明本发明的方法检测准确。

序列表

<110>广西壮族自治区兽医研究所

<120>鸡细小病毒和鸡新城疫病毒二重pcr检测方法的建立

<160>6

<170>patentinversion3.5

<210>1

<211>20

<212>dna

<213>人工序列

<400>1

aaaaggatgagaagggaact20

<210>2

<211>19

<212>dna

<213>人工序列

<400>2

gcacagtctgatggctaag19

<210>3

<211>19

<212>dna

<213>人工序列

<400>3

tggaggcatacaacaggac19

<210>4

<211>19

<212>dna

<213>人工序列

<400>4

gagttaaggcaggggaagt19

<210>5

<211>687

<212>dna

<213>人工序列

<400>5

aaaaggatgagaagggaactttgcaacaaagctgcagaaatgttgcacatgttttgtcct60

gatttccccaaaagtcaaatctggggatcgctggtgaatatccaaaacgctatgctttcg120

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gatcacaacgcgtgggaaatagctaaatcgatacatggagatgttgacacatctgatctg660

gatgataacttagccatcagactgtgc687

<210>6

<211>453

<212>dna

<213>人工序列

<400>6

tggaggcatacaacaggacactgactactttgctcaccccccttggtgattctatccgca60

ggatacaagagtctgcgactacgtccggaggaaggaggcagagacgctttataggtgcca120

ttatcggcagtgtagctcttggggttgccacagatgcccagataacagcagcctcagctc180

tgatacaagccaaccagaatgctgccaacatcctccggcttaaagagagcattgctgcaa240

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aaattacacagcaggttggtgtagaactcaacctgtacctaactgaattgactacagtat420

tcgggccacaaatcacttcccctgccttaactc453