CO2休克法诱导产生肿瘤细胞凋亡小体及其抗肿瘤应用的制作方法

本发明属于抗肿瘤
技术领域：
，涉及肿瘤细胞凋亡小体，尤其是一种co2休克法诱导产生肿瘤细胞凋亡小体及其抗肿瘤应用。
背景技术：
：目前，肿瘤细胞凋亡小体的获得主要是通过紫外线照射法、热应力法等方法诱导细胞凋亡产生的。但是，这些方法需要控制的变量例如温度、co2浓度、时间等比较多，会造成结果的不准确。与此同时，通过物理方法制得的全细胞肿瘤疫苗并不能有效地解决肿瘤细胞抗原性弱的问题，因而其免疫活性相对比较低，抗肿瘤效率低。技术实现要素：本发明的目的在于克服现有技术的不足之处，提供一种co2休克法诱导产生肿瘤细胞凋亡小体，同时提供了凋亡小体的保存方法、用途及其在抗肿瘤方面的作用。本发明解决技术问题所采用的技术方案是：本发明提供了一种肿瘤细胞凋亡小体的制备方法，具体操作为：(1)将肿瘤细胞孵育至对数生长期，放入不含co2的培养箱中以诱导肿瘤细胞凋亡，同时对其进行体外指标检测；(2)细胞凋亡后，收集细胞的培养基上清液，吸入锥形离心管中，在室温下700g～800g离心8min～10min，离心后，为去除上清中残留的混杂细胞，再一次取上清重复离心一次；(3)慢慢的将上清移至10ml的无菌注射器中，安装滤膜过滤装置，给予轻微压力，缓慢使上清通过5μm的滤膜；(4)离心管收集滤液，放入高速离心机中在4℃下，16000g～180000g离心18min～23min；(5)管底灰色沉淀即为纯化的肿瘤细胞凋亡小体。为了消除培养基中的试剂或血清影响，将沉淀重新悬浮并用pbs洗涤，且在16000g～18000g下再离心30min～35min。通过流式细胞分选术或差速离心技术可对所制备的肿瘤细胞凋亡小体进一步纯化。可以使用含有有效成分(如：多酚)的保存剂加入到通常用作细胞培养基的各种培养液中保存凋亡小体。同时也可以寻找一些合适的载体(如：基质、纤维等)，其可适合于凋亡小体的宿主，从而保存肿瘤细胞凋亡小体。可制备含有凋亡小体的组合物，用于临床实验。例如该组合物可施用至有需要的哺乳动物，从而抑制炎症、抑制免疫应答或自身免疫应答等。也可直接利用收集、纯化的肿瘤细胞凋亡小体进行各种临床实验。将所制备的凋亡小体作为抗肿瘤疫苗进行体内抗肿瘤试验，确定其抗肿瘤作用。具体过程如下：建立小鼠肿瘤模型，将制备的凋亡小体进行皮下注射，注射量为25mg/kg左右，一周三次，之后接种肿瘤细胞，进行体内抗肿瘤指标检测。本发明的优点和积极效果是：本发明针对现有的通过物理方法制备的全细胞肿瘤疫苗活性低的相关缺陷加以改善，进一步验证其抗肿瘤作用。通过控制单个变量、利用分离、纯化技术来收集肿瘤细胞凋亡小体，同时进行体内抗肿瘤试验和体外指标检测。结果表明对所收集的凋亡小体在状态和数量上都有了一个精准的掌握，也具有很强的抗肿瘤作用。附图说明图1为“co2休克法”作用于hepg2细胞的显微镜观察结果；a、b、c、d分别代表0h、24h、48h、72h图2为hepg2细胞的hoechst33258染色检测结果；a、b、c、d分别代表0h、24h、48h、72h图3为“co2休克法”对hepg2细胞周期的影响；a、b、c、d分别代表0h、24h、48h、72h具体实施方式下面结合附图并通过具体实施例对本发明作进一步详述，以下实施例只是描述性的，不是限定性的，不能以此限定本发明的保护范围。实施例将肝癌细胞hepg2细胞孵育至对数生长期，放入不含co2培养箱中以诱导肿瘤细胞凋亡；细胞凋亡后，收集细胞的培养基上清液，在室温下800g离心10min,10min后，为去除上清中残留的混杂细胞和细胞碎片，再一次取上清重复离心一次；接着慢慢的将上清移至10ml的无菌注射器中，安装滤膜过滤装置，给予轻微压力，缓慢使上清通过5μm的滤膜；离心管收集滤液，放入高速离心机中在4℃下，16000g离心20min；随后所得的灰色沉淀即为肿瘤细胞凋亡小体。将肿瘤细胞凋亡小体用差速离心技术进行纯化，然后加入保存剂保存，待用。一、体外指标检测(1)倒置显微镜观察细胞形态方法：将hepg2细胞培养至对数期，放入不含co2的培养箱中分别孵育24h、48h、72h于倒置荧光显微镜中拍照观察。结果见图1，如图1(a)对照组细胞成均匀的菱形状，表面光滑，大小均一，生长状态良好。当培养至24h时，如图1(b)，细胞明显变小而且形状发生改变，已不再是均匀的菱形，细胞膜表面不平整、不圆滑且伴随细胞膜皱缩，可以观察到胞质边集成团；而当培养到48h的时候，如图1(c)，细胞膜皱缩更为严重，出现凋亡小体。当培养时间延长到72h时，图1(d)，视野多为细胞碎片残骸，形态与对照组的细胞形态差距明显，再次说明“co2休克法”可以使细胞形态发生变化，细胞膜褶皱且出现凋亡小泡。(2)hoechst单染观察hepg2细胞的凋亡情况原理：hoechst染色法主要是从形态学水平对细胞凋亡进行检测。hoechst33258是一种蓝色荧光染料，能够穿透细胞膜与dna进行特异性结合，其对于死细胞或者固定的细胞能够立刻将其染色，但是，对于活细胞则是循序渐进着染的。当细胞发生凋亡时，细胞内染色质便会发生固缩，经该染料染色后细胞的荧光强度会较正常细胞明显增强。方法：将培养至对数期的hepg2细胞放入不含co2的培养箱中孵育24h、48h、72h。用胰蛋白酶将其消化，同时与原培养液一起离心(1000r/min，5min)收集细胞，收集的细胞用pbs清洗两次，同时用pbs重悬调整细胞数为5×106个/ml。加入50μlhoechst33258染色液(2.5mg/ml)，37℃避光孵育20min。取出离心，用pbs清洗两次，同时用500μl重悬。将细胞悬液滴于洁净的载玻片上，加上盖玻片后用激光共聚焦显微镜进行观察并拍照。由图2可以明显看出，a中正常细胞核形态规整，呈现出均匀的淡蓝色荧光，用“co2休克法”处理hepg2细胞之后，随着作用时间的延长，亮蓝色斑点逐渐增多。72h时绝大部分的细胞内都可以看到浓染致密的颗粒状或者块状的蓝色荧光，说明在没有co2的条件下，hepg2细胞染色质发生固缩，使得hoechst33258染料和dna之间的结合增多。实验结果表明，“co2休克法”可以诱导hepg2细胞形态发生改变，细胞核固缩，且后期产生了凋亡小体。(3)流式细胞仪检测“co2休克法”对hepg2细胞周期的影响原理：细胞周期可分为g1/g0期，s期和g2/m期。肿瘤细胞在凋亡过程中，核酸内切酶水解dna分子链内部的磷酸二酯键生成寡聚核苷酸从而降解dna分子，使dna链成为小片段，从而从核内漏出，核dna含量下降，用流式细胞仪检测并分析经pi荧光染色后的细胞，可根据dna荧光值分析细胞所处的周期阶段，继而统计各个周期阶段细胞数量。利用分析软件对各时期的细胞百分率进行分析，从dna直方图中可以直观的看出，在二倍体细胞g0/g1峰的前面会有亚二倍体峰(sub-g1峰)出现。方法：消化收集孵育24h、48h、72h的在不含co2的情况下培养的hepg2细胞，离心(1000r/min，5min)弃去上清后用pbs清洗两次，同时用pbs重悬调整细胞浓度为1×106个/ml。将细胞悬液逐滴滴入预冷的2ml的无水乙醇(70％)中,边滴边震荡，防止结团，4℃过夜。取出离心(1500r/min，5min)，弃去上清，然后再用pbs洗2次并重悬至500μl。加入50μlrnase(100μg/ml)混匀，37℃避光30min。取出后加入50μlpi(0.5mg/ml)，混匀后放入4℃，10min。流式细胞仪上机检测。表1se-β-lg对k562细胞周期的影响g1(％)s(％)g2m(％)凋亡率(％)对照组61.16±2.1723.77±1.0215.07±1.132.81±0.1124h49.55±3.21a17.32±1.1118.13±1.043.58±0.0948h29.04±1.05a54.38±2.19a16.58±1.0310.52±0.3172h37.22±2.31a46.67±1.14a16.10±1.1219.84±0.41注：a为与对照组相比差异极显著，p＜0.01由表1可知，随着时间的延长，凋亡率从3.58％上升到19.84％，与对照组相比有显著差异。g1期细胞比例下降，从61.16％下降到29.04％，与对照组相比差异显著，而s期的细胞比例上升，由23.77％上升到54.38％，差异极显著，p＜0.01。同时出现亚二倍体峰。但g2期与对照组相比无显著差异，由此推测细胞在由s期进入g2时受到阻滞作用，而由于g1期细胞比例下降显著，推测细胞于g2/m期也受到阻滞。g2与m期之间周期调控点，又称g2/m期过渡点，控制着dna的修复，如果受到阻滞会使损伤的dna得不到修复从而退出细胞增殖周期进入凋亡途径。根据以上结果与分析，推断出了细胞周期被阻滞的位点。二、体内抗肿瘤试验凋亡小体疫苗的制备：将肿瘤细胞孵育至对数生长期，放入不含co2的培养箱中以诱导肿瘤细胞凋亡。随后收集细胞的培养基上清液，吸入锥形离心管中，在室温下800g离心10min，为去除上清中残留的混杂细胞，再一次取上清重复离心一次；将上清移至10ml的无菌注射器中，安装滤膜过滤装置，给予轻微压力，缓慢使上清通过5μm的滤膜；离心管收集滤液，放入高速离心机中在4℃下，16000g离心20min；管底灰色沉淀即为纯化的肿瘤细胞凋亡小体。为了消除培养基中的试剂或血清影响，将沉淀重新悬浮并用pbs洗涤，且在16000g下再离心30min。通过流式细胞分选术或差速离心技术可对所制备的肿瘤细胞凋亡小体进一步纯化。纯化过后冷冻干燥并保存在-80℃，备用。将60只雌性昆明小鼠随机分为6组，每组10只，分别为空白组、模型组、凋亡小体低剂量组(6.25mg/kg)、凋亡小体中剂量组(12.5mg/kg)、凋亡小体高剂量组(25mg/kg)、全细胞肿瘤疫苗组(采用超声细胞破碎法，25mg/kg)。凋亡小体免疫组按照剂量每周免疫一次，共免疫3次，最后一次免疫的7天后，在除空白组以外的各组小鼠的右腋下接种s180肿瘤细胞(2×106cells/ml)，21天后实验期结束。(1)小鼠体重、脏器指数及抑瘤率方法：实验期结束后，禁食不禁水12h，称取小鼠体重并记录，眼眶取血，然后脱颈椎处死，在小鼠腹正中剪开腹腔，取出脾脏和胸腺，右腋下取肿瘤，去除脂肪及筋膜称其湿重，按以下公式计算生理指标：结果如表2所示：表2为用不同剂量的凋亡小体处理的s180荷瘤小鼠的脏器指数及抑瘤率注:a与模型组比较p<0.05；b与空白组比较p<0.05。通过建立肿瘤动物模型，得出凋亡小体各剂量组的抑瘤率。表2为用不同剂量的凋亡小体处理的s180荷瘤小鼠的脏器指数及抑瘤率。模型组小鼠实体瘤体积最大，称取瘤重得瘤重亦最大，凋亡小体高剂量组抑瘤效果最好。各剂量组瘤重较模型组均具有显著性差异(p<0.05)。初步推断，可能是凋亡小体具有提高免疫力的作用，从而增强机体对肿瘤细胞的抑制作用。模型组胸腺指数较空白组显著降低(p<0.05)，而脾脏指数显著升高(p<0.05)，说明s180细胞在体内的增殖可以破坏免疫器官，降低宿主的抗肿瘤免疫能力。而凋亡小体能有效保护胸腺和脾脏免受宿主实体肿瘤的侵害，维护荷瘤小鼠机体的免疫功能。然而，全细胞肿瘤疫苗组的胸腺指数、脾脏指数及抑瘤率都比较接近凋亡小体中剂量组，表明其抗肿瘤活性不高。结果表明，凋亡小体能显著抑制肿瘤的增殖，保护荷瘤小鼠的免疫系统，且呈剂量相关。(2)血常规参数检验方法：小鼠眼球取血后，在血液样本中加入抗凝剂(edta-k2)，防止凝血形成，在xfa-6130全自动血液分析仪上对所有样本进行分析。结果如表3所示，表3各组小鼠血常规检验结果注:a与模型组比较p<0.05；b与空白组比较p<0.05。由表3可以看出不同剂量的凋亡小体以及全细胞肿瘤疫苗对s180肿瘤小鼠的血液影响。结果表明，s180细胞在体内的生长可显著增加血小板和白细胞的数量，特别是中性粒细胞的数量，减少淋巴细胞、红细胞和血红蛋白的数量(p<0.05)，说明肿瘤细胞的恶性增殖可使机体发生炎症感染和贫血的现象。凋亡小体免疫能有效地提升淋巴细胞的比例(p<0.05)，增强机体免疫抗肿瘤的能力，使肿瘤带给机体的副作用得到有效地缓解。全细胞肿瘤疫苗组较凋亡小体组抗肿瘤效果不明显。(3)外周血淋巴细胞亚群的分布方法：为了反映小鼠机体免疫水平和状况，利用流式细胞仪(fcm)测定小鼠外周血淋巴细胞亚群的比例。小鼠眼球后静脉丛取血100μl，用2μl肝素钠溶液(5mg/ml)抗凝。加pe-cd4+抗体和pe-cd8+抗体各2μl，暗处孵育30min。在管中加入250μl红细胞溶解液，暗处孵育10min，离心去上清(1000r/min,5min)，重复裂解2次。沉淀加pbs离心洗涤2次，然后以0.5mlpbs重悬。过300目尼龙网，上机检测得出各淋巴细胞亚群所占百分比。结果如表4所示：表4外周血中淋巴细胞亚群比例注：b模型组与空白组比较p<0.05；a剂量组与模型组比较p<0.05由表可知，模型组s180荷瘤小鼠体内cd4+t细胞明显减少(p<0.05)，而cd8+t细胞明显增加，说明模型组小鼠的细胞免疫功能处于免疫抑制状态，其识别突变细胞的能力下降，从而导致杀伤t细胞的活性也较低。而凋亡小体注射组较模型组有了明显的改善。同时cd4+t淋巴细胞含量也极显著提高(p<0.05)，cd8+t淋巴细胞的比例也有所提高。说明凋亡小体能够增加小鼠cd4+t淋巴细胞的比例，从而提高机体对肿瘤细胞的识别和杀伤能力，因而凋亡小体具有提高抗肿瘤免疫功能的效果。全细胞肿瘤疫苗组在一定程度上也可增加小鼠t淋巴细胞的比例，但是效果不明显，可能是在处理过程中细胞受到损伤。综上所述，本发明所提出的“co2休克”法诱导产生“肿瘤细胞凋亡小体”，组成成分单一，在体内表现出了很强的增强机体抗肿瘤免疫的活性，应用前景广泛。以上所述的仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。当前第1页12