一种NK细胞诱导试剂盒的制作方法

本发明涉及生物、医学领域，具体是涉及一种nk细胞的无血清培养诱导试剂盒。

背景技术：

肿瘤过继免疫治疗（adoptiveimmunotherapy，aci）是指通过向肿瘤患者输注具有抗肿瘤活性的免疫细胞，直接杀伤或激发机体免疫反应杀伤肿瘤细胞，达到治疗肿瘤的目的。它包括非特异性激活和特异性激活的效应细胞，前者是采用非特异性刺激因子（il-2、干扰素）刺激前体效应细胞，使其活化为具有抗肿瘤活性的效应细胞，如nk、lak细胞、肿瘤浸润性淋巴细胞（til）、细胞因子诱导的杀伤细胞（cytokineinducedkillercells，cik）等；特异性激活的效应细胞是指采用肿瘤抗原作刺激物所诱导的抗肿瘤效应细胞，如树突状细胞（dc），细胞毒t淋巴细胞（cd8⁺细胞）等。aci可通过体外扩增筛选出高活性的免疫效应细胞，将其转入宿主体内并建立长期的特异性抗肿瘤免疫效应，克服了疫苗免疫治疗的诸多缺陷，具有良好的应用前景。

nk是单个核细胞在cd3单抗和多种细胞因子(包括il-7il-2il-12,tnf-a等)的作用下培养获得的一群以cd3^-cd56⁺细胞，其既具有强大的抗肿瘤活性，又具有非mhc(主要组织相容性抗原)限制性肿瘤杀伤能力。nk细胞具有杀瘤活性高、杀瘤谱广，对正常组织毒性低，体外可高度扩增等特点。

传统对nk体外扩增的方法为从人外周血内提取单个核细胞，体外添加干扰素、cd3、介素2、il-7进行诱导培养连续14天。传统方法细胞增殖慢、倍增时间长、细胞cd3^-cd56⁺阳性率比例不稳定。并且由于采用含肿瘤滋养层细胞激活有伦理问题，同时临床不确定的危害都无法评估。并且由于滋养层细胞不稳定无法进行后期质量控制，无法在工业上大规模生产。因此亟需开发能克服上述缺陷的nk细胞诱导扩增试剂盒。

技术实现要素：

针对上述现有的技术，本发明提供一种培养nk细胞的试剂，其特征在于使用此试剂盒培养。用本发明的试剂盒最终诱导的nk细胞总数在14天内可达到6×10⁹，cd3^-cd56⁺阳性率最低65%，最高可达到93%，细胞存活率大于95%。本发明的因子试剂盒还有稳定性好可质控的特点。

本发明是通过以下技术方案实现的：

一种nk细胞诱导的试剂盒，是由以下浓度的组分组成的，各浓度单位若无特别说明，均为ng/ml：

cd3因子:1～500ng/ml；

胸腺肽：1～150ng/ml；

il-7：1～300ng/ml；

il-15：1～300ng/ml；

il-21：1～300ng/ml；

il-2：200u～2000u/m；l

余量为pbs。

以上所述因子均为临床应用，安全性更可靠。

附图说明

图1：nk细胞倍增曲线。

图2：nk细胞表型图谱。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步的说明。

下述实施例中所涉及的仪器、试剂、材料等，若无特别说明，均为现有技术中已有的常规仪器、试剂、材料等，可通过正规商业途径获得。下述实施例中所涉及的实验方法，检测方法等，若无特别说明，均为现有技术中已有的常规实验方法，检测方法等,通过培养检测实例3可在细胞数及阳性率上得到最优结果。

实施例1制备nk因子诱导试剂盒

各原料的浓度如下，各浓度单位若无特别说明，均为ng/ml：

cd3因子:150ng/ml；

胸腺肽：10ng/ml；

il-7：200ng/ml；

il-15：200ng/ml；

il-21：200ng/ml；

il-2：500u/ml；

余量为pbs。

制备方法为：取上述除水外的组分，根据其各自溶解特性分类溶解，然后混合，加入水使各组分终浓度如上所述，调节ph值至7.1～7.4，即得，工业滤芯过滤，同时氮气保护进行分装（避免不稳定性成分被氧化）。

实施例2制备nk因子诱导试剂盒

各原料的浓度如下，各浓度单位若无特别说明，均为ng/ml：

cd3因子:300ng/ml；

胸腺肽：10ng/ml；

il-7：100ng/ml；

il-15：100ng/ml；

il-21：100ng/ml；

il-2：1000u/ml；

余量为pbs。

制备方法为：取上述除水外的组分，根据其各自溶解特性分类溶解，然后混合，加入水使各组分终浓度如上所述，调节ph值至7.1～7.4，即得，工业滤芯过滤，同时氮气保护进行分装（避免不稳定性成分被氧化）。

实施例3制备nk因子诱导试剂盒

各原料浓度如下，各浓度单位若无特别说明，均为ng/ml：

cd3因子:300ng/ml；

胸腺肽：10ng/ml；

il-7：300ng/ml；

il-15：300ng/ml；

il-21：300ng/ml；

il-2：2000u/ml；

余量为pbs。

制备方法为：取上述除水外的组分，根据其各自溶解特性分类溶解，然后混合，加入水使各组分终浓度如上所述，调节ph值至7.1～7.4，即得，工业滤芯过滤，同时氮气保护进行分装（避免不稳定性成分被氧化）。

实验本发明的nk细胞诱导试剂盒性能的考察

利用本发明的nk细胞诱导试剂盒（实施例3）：

单个核细胞分离：患者外周血50ml，转入2支50ml离心管，1600rpm（400g）离心5min，吸取上层淡黄色血浆，转移至新的50ml离心管中，置于56℃灭活30min，2000rpm（900g）离心10min，取上清分装后置于4℃保存备用。

细胞的诱导和扩增：在上述分离的单个核细胞悬液中添加重组介素2终浓度为1000u/ml，然后移入t175培养瓶中，置于37℃，5%co2饱和湿度培养箱中，同时添加cd3因子，胸腺肽，培养72小时，之后，添加介素7，介素15，介素21，终浓度分别为100ng/ml，100u/ml和500u/ml。继续培养48小时后显微镜下细胞计数，然后用细胞培养液调节细胞密度为0.6-1×10⁶/ml，分装到t175培养瓶中，进行扩大培养，此后，每隔48小时按上述相同条件扩大培养一次，培养至第14天时收集nk细胞待用。

结论：

连续培养14天，细胞数量达到45.2亿，cd3^-cd56⁺阳性率为90.4%。

上述虽然结合实施例对本发明的具体实施方式进行了描述，但并非对本发明保护范围的限制，所属领域技术人员应该明白，在本发明的技术方案的基础上，本领域技术人员不需要付出创造性劳动即可做出的各种修改或变形仍在本发明的保护范围以内。