一种基于4-苯乙烯吡啶盐长波发射识别H2S荧光探针及其合成方法和应用与流程

本发明涉及一种基于4-苯乙烯吡啶盐长波发射识别h2s荧光探针及其合成方法和应用。

背景技术

氢化硫化氢(h2s)是一种新发现的气态信号分子，由于其在生理和病理过程中具有多种功能，已成为生物学领域的研究热点。h2s主要来自火山喷发和哺乳动物细胞自身通过胱硫醚-β-合成酶(cbs)，胱硫醚-γ-裂解酶(cse)，3-巯基丙酮酸硫基转移酶(3-mst)等酶的作用产生的。以往的研究表明，h2s在调节血压，心血管保护，调节细胞生长和刺激血管生成等方面起重要作用。此外，生命体系中高水平的h2s会引起人类疾病，如阿尔茨海默病，唐氏综合症，高血压和肝硬化等。鉴于h2s的生物学重要性，科学家们需要精确的方法来检测h2s，目前最常见的经典方法包括电化学法、比色法、亚甲蓝法和气相色谱法。与传统方法相比，荧光分析技术以其成本低、操作简单、灵敏度高、实时无损生物成像等优点受到人们的广泛关注。

近年来，设计识别h2s的荧光探针已有很多报道，如anal.chem.,(2017),89,4578-4594；anal.chem.,(2018),90,7510-7516；anal.chem.,(2015),87,1188-1195；j.org.chem.,(2017),82,10234-10246；anal.chem.,(2016),88,592-595；rscadv.,(2016),6,56384-56391；chem.soc.rev,(2013),42,3489-3613；analyst,(2014),139,3373-3377；rscadv.,(2013),3,14543-14548,但这些文献都是对多种阴离子的检测，没有实现对h2s的专一性识别。anal.chem.,(2018),90,7510-7516；anal.chem.,(2015),87,1188-1195；j.org.chem.,(2017),82,10234-10246；chem.commun.,(2012),48,10871-10837；anal.chem.,(2013),85,7875-7881，这些文献虽然能专一性识别h2s，但是发射波长较短，不能在长波长区域检测，而且合成路线复杂，响应时间长。众所周知，在可见光谱区，生物样品有较强的背景荧光和自吸收，会给检测与成像带来干扰，影响测量的准确性。同时，可见光的波长较短,在荧光成像时辐射能量较大，易造成细胞和生物组织的光损伤。因此,开发合成简单，发射波长在长波长区域(600nm-900nm)可克服以上不足，这对设计合成更为简便优越的h2s荧光探针具有重要意义。

技术实现要素：

本发明要解决的技术问题是提供一种长波发射识别h2s荧光探针及其合成方法和应用，该荧光探针具有较长的发射波长，响应时间较短，可在水介质中实现对h2s的识别，具有特异选择性、较高的灵敏度和较好的抗干扰能力。

本发明的技术方案是：

一种基于4-苯乙烯吡啶盐长波发射识别h2s荧光探针，该探针l结构式如下：

一种基于4-苯乙烯吡啶盐长波发射识别h2s荧光探针的合成方法，其具体步骤如下：

(1)以乙醇为溶剂，将4-(二乙氨基)水杨醛、4-甲基吡啶盐哌啶按照摩尔比1:(1～5)：(0.1～2)进行投料，加热回流反应8h～16h，旋出溶剂，粗产物用硅胶柱色谱法进行纯化，用甲醇和二氯甲烷作为洗脱剂进行分离，得到化合物1

(2)以dmf为溶剂，将化合物1、2,4-二硝基氟苯、碳酸钾按照摩尔比1:(1.2～2)：(1.5～3)进行投料，室温下搅拌4h～10h，反应结束后过滤得到粗产物，用硅胶柱色谱法进行纯化，用甲醇和二氯甲烷作为洗脱剂进行分离，得到荧光探针l

进一步的，步骤(1)和步骤(2)中所述洗脱剂甲醇和二氯甲烷的体积比为1:50～1:100。

一种基于4-苯乙烯吡啶盐长波发射识别h2s荧光探针的应用，在ph＝5～10、体积比为6:4的hepes与dmf缓冲溶液中对h2s进行检测，根据在607nm处的发射峰荧光增强，检测hs^-。

一种基于4-苯乙烯吡啶盐长波发射识别h2s荧光探针的应用，在体积比为6:4的实际水样与dmf混合溶液中对h2s进行检测，根据在607nm处的发射峰荧光增强，检测hs^-。

本发明所提供的基于4-苯乙烯吡啶盐类衍生物的合成路线如下：

本发明的有益效果：

合成荧光探针步骤简单，分离提纯容易；该荧光探针具有较长的发射波长，响应时间较短，可以在水介质中长波长(607nm)荧光增强识别h2s，具有特异选择性、较高的灵敏度和较好的抗干扰能力。荧光探针使用方法没有特殊限制，通常可以将探针分子溶解含40％dmf的水中，室温下进行测试，实现了实际水样中检测h2s的应用。

附图说明

图1是本发明荧光探针l的¹hnmr谱图；

图2是本发明荧光探针l的¹³cnmr谱图；

图3是本发明荧光探针l与br^-，i^-，no2^-，co3^2-，hco3^-，ch3coo^-，hpo4^2-，h2po4^-，po4^3-，cn^-，scn^-，hs^-，so4^2-，so3^2-，hso3^-，hso4^-，n3^-，s2o3^2-作用前后的荧光发

射光谱图；

图4是本发明荧光探针l对h2s识别时抗其它金属离子干扰的荧光检测图；

图5是本发明荧光探针l与不同倍数h2s作用前后的荧光发射光谱变化图；

图6是本发明荧光探针l的检测限图；

图7是本发明荧光探针l识别h2s时间响应图；

图8是本发明荧光探针l在水样中检测hs^-的荧光变化图；

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明的技术方案作进一步详细地说明。

实施例1

(1)化合物1的具体合成步骤如下：

4-二乙氨基水杨醛(1.54g，8.0mmol)，4-甲基吡啶盐(1.88g，8.0mmol)和哌啶(0.8mmol)溶于乙醇，加热回流12h，旋出溶剂。粗产物经薄层柱色谱纯化，利用ch3oh：ch2cl2＝1:50(v/v)做洗脱剂，分离得到2.05g化合物1，产率为62.5％；

¹hnmr(400mhz,dmso-d6)δ10.13(s,1h),8.59(d,j＝6.5hz,2h),8.03-7.93(m,3h),7.49(d,j＝9.0hz,1h),7.15(d,j＝16.0hz,1h),6.33(dd,j＝9.0,2.4hz,1h),6.21(d,j＝2.4hz,1h),4.15(s,3h),3.39(q,j＝7.0hz,4h),1.15(t,j＝7.0hz,6h).

(2)荧光探针l的具体合成步骤如下：

化合物1(410mg，1mmol)，2,4-二硝基氟苯(223mg，1.2mmol)，碳酸钾(207mg，1.5mmol)，溶解在10mldmf中，在室温条件下反应6h。反应结束后加水洗涤，用乙酸乙酯萃取，无水硫酸钠干燥，旋出溶剂，粗产物经薄层柱色谱纯化，利用ch3oh：ch2cl2＝1：100(v/v)做洗脱剂，得到316.8mg探针l，产率55.0％。荧光探针l的¹hnmr谱图如图1所示，¹³cnmr谱图如图2所示。

¹hnmr(400mhz,dmso-d6)δ8.93(d,j＝2.8hz,1h),8.66(d,j＝6.4hz,2h),8.45(dd,j＝9.3,2.8hz,1h),7.95(d,j＝6.4hz,2h),7.85(d,j＝9.0hz,1h),7.76(d,j＝16.2hz,1h),7.24(d,j＝16.2hz,1h),7.12(d,j＝9.3hz,1h),6.81(dd,j＝9.0,2.5hz,1h),6.55(d,j＝2.5hz,1h),4.16(s,3h),3.41(q,j＝7.1hz,4h),1.09(t,j＝7.1hz,6h).

¹³cnmr(101mhz,dmso-d6)δ155.86,154.22,153.22,151.36,144.96,141.52,139.20,134.24,130.89,130.29,122.84,122.43,119.65,118.89,113.74,110.81,109.98,103.49,46.94,44.47,40.33,12.86.

实施例2

(1)化合物1合成

4-二乙氨基水杨醛(1.54g，8.0mmol)，4-甲基吡啶盐(3.76g，16.0mmol)和哌啶16mmol溶于乙醇，加热回流8h，旋出溶剂。粗产物经薄层柱色谱纯化，利用ch3oh：ch2cl2＝1：100(v/v)做洗脱剂，分离得到化合物1；

(2)荧光探针l的合成

化合物1(410mg，1.0mmol)，2,4-二硝基氟苯(278.5mg，1.5mmol)，碳酸钾(276mg，2.0mmol)，用15mldmf溶解，在室温条件下反应8h。反应结束后加水洗涤，用乙酸乙酯萃取，无水硫酸钠干燥，旋出溶剂，粗产物经薄层柱色谱纯化，利用ch3oh：ch2cl2＝1：80(v/v)做洗脱剂，得到420mg探针l，产率72.9％。荧光探针l的¹hnmr谱图如图1所示，¹³cnmr谱图如图2所示。

实施例3

(1)化合物1合成

4-二乙氨基水杨醛(1.54g，8.0mmol)，4-甲基吡啶盐(9.4g，40.0mmol)和哌啶8mmol溶于乙醇，加热回流16h，旋出溶剂。粗产物经薄层柱色谱纯化，利用ch3oh：ch2cl2＝1：100(v/v)做洗脱剂，分离得到化合物1；

(2)荧光探针l的合成

化合物1(410mg，1.0mmol)，2,4-二硝基氟苯(371mg，2mmol)，碳酸钾(414mg，3.0mmol)，用15mldmf溶解，在室温条件下反应10h。反应结束后加水洗涤，用乙酸乙酯萃取，无水硫酸钠干燥，旋出溶剂，粗产物经薄层柱色谱纯化，利用ch3oh：ch2cl2＝1:100(v/v)做洗脱剂，得到荧光探针l。荧光探针l的¹hnmr谱图如图1所示，¹³cnmr谱图如图2所示。

荧光探针l对h2s选择性的检测：

10μmol/l荧光探针l的hepes:dmf＝6:4(v/v,ph＝7.4)缓冲溶液，向其中分别加入20μl(50mmol/l)阴离子(br^-，i^-，no2^-，co3^2-，hco3^-，ch3coo^-，hpo4^2-，h2po4^-，po4^3-，cn^-，scn^-，hs^-，so4^2-，so3^2-，hso3^-，hso4^-，n3^-，s2o3^2-)，检测溶液的荧光发射光谱变化。如图3所示，当加入阴离子时，只有hs^-可以引起607nm处的荧光强度原位增强，而其他阴离子对探针l荧光强度影响不大，由此可知，荧光探针l对h2s识别有高度的选择性。

荧光探针l识别h2s的抗干扰检测：

10μmol/l荧光探针l的hepes:dmf＝6:4(v/v,ph＝7.4)溶液，向其中分别加入20μl(50mmol/l)阴离子(br^-，i^-，no2^-，co3^2-，hco3^-，ch3coo^-，hpo4^2-，h2po4^-，po4^3-，cn^-，scn^-，hs^-，so4^2-，so3^2-，hso3^-，hso4^-，n3^-，s2o3^2-，)，检测溶液的荧光发射光谱,然后向以上含有阴离子的溶液中再分别加入20μl(50mmol/l)的hs^-，检测溶液的荧光发射光谱，取最大发射波长所对应的强度值作图，如图4所示。即使有其它阴离子存在时，hs^-也能使探针l荧光增强，说明荧光探针l只对h2s有识别，不受其它阴离子的干扰。

荧光探针l对h2s的滴定测试：

10μmol/l的荧光探针l的hepes:dmf＝6:4(v/v,ph＝7.4)缓冲溶液，分别加入0～50倍(50mmol/l)的hs^-，检测溶液的荧光发射光谱变化，如图5所示。从图5中可以看出，随着hs^-不断加入，在607nm处的发射峰逐渐升高，当加入50倍的hs^-时，在607nm处的发射峰不再升高，说明此时达到了饱和。

荧光探针l对h2s的检测限测试：

在探针l的hepes:dmf＝6:4(v/v,ph＝7.4)缓冲溶液中，测试了不少于11个平行样的荧光强度，根据公式∑(xi-x)²＝(x1-x)²+(x2-x)²+……+(xn-x)²求出平方差的总和(xi为每次测量受体本身荧光强度值，x为荧光强度平均值，n为测试次数，n大于等于11)，然后根据公式s＝[∑(xi-x)²/(n-1)]^0.5求出s，再根据检测限公式3s/k，k为所选直线部分的斜率(注：直线是根据滴定做点图，横坐标为离子浓度，纵坐标为荧光强度)，求出检测线为3.39×10^-6mol/l(见图6)，达到了微摩尔级，这说明该探针有较低的检测限，可检测较低浓度的h2s，具有较高的灵敏度，有一定的实际应用价值。

荧光探针l对h2s的响应时间测试：

在探针l的hepes:dmf＝6:4(v/v,ph＝7.4)缓冲溶液中，加入50倍hs^-后测试不同时间的荧光强度变化，从图7中可以看出，随着时间延长探针荧光强度逐渐增强，在20分钟左右达到最高并呈稳定趋势，说明探针l对h2s的识别在20分钟内即可完成，具有快速响应的能力。

荧光探针l在实际水样中检测h2s：

为了检验探针l识别h2s的实际应用性，我们探讨了实际水样中探针l的应用。取湖水、河水水样，先过滤除去其中的不溶性杂质，然后再用有机溶剂萃取除去其中的有机物，萃取后的水样及自来水都加热煮沸15分钟，冷却，过滤杂质，清液用作后续水样测试。

用处理后的实际水样与dmf按体积比6:4制备成10μmol/l的荧光探针l水溶液，分别加入0～500μmol/l的hs^-，3小时后检测溶液的荧光发射光谱变化(见图8)，由图8可以看出在加入50～500μmol/l的hs^-，荧光强度与加入hs^-的浓度呈线性关系，说明当实际水样中的hs^-浓度在50～500μmol/l的范围内，可实现对hs^-的定量检测。因此，探针l具有在环境系统中定量检测h2s的潜在应用。

以上仅为本发明的具体实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。