复合纤维素酶系及其在淀粉燃料乙醇生产中的应用的制作方法

本发明涉及乙醇发酵生产技术领域，特别涉及一种复合纤维素酶系及其在淀粉燃料乙醇生产中的应用。

背景技术：

乙醇是重要的大宗化工产品，用途广泛，常用作燃料、溶剂和消毒剂，也用于制取其他化合物。乙醇也是目前全球最大的发酵产品，我国新兴产业发展规划指出，到2020年，生物液体燃料年利用量达到1200万吨。虽然淀粉乙醇发酵的生产工艺已经较为成熟，但其生产过程中还存在问题。玉米燃料乙醇生产工艺中玉米纤维素未被有效利用，玉米淀粉未能充分降解，后期出现糖液粘度大，固形物多等问题，所以酵母的生长和发酵受到严重影响。

技术实现要素：

本发明的一个目的是解决至少上述问题，并提供至少后面将说明的优点。

本发明还有一个目的是提供一种复合纤维素酶系，以完善里氏木霉酶系，进而有效提高里氏木霉酶系降解结晶纤维素的速度。

本发明还有一个目的是提供一种复合纤维素酶系的应用，在酵母同步糖化发酵生产淀粉燃料乙醇过程中，添加所述复合纤维素酶，一方面降低玉米醪液的粘度，另一方面将残余的纤维素和淀粉进一步水解，实现由玉米到燃料乙醇的高效转化，从而为乙醇发酵工业带来显著的经济效益。

为了实现根据本发明的这些目的和其它优点，提供了一种采用如下方法制备的复合纤维素酶系，所述方法包括以下步骤：

将转化有桧状青霉来源的阿魏酸酯酶基因和桧状青霉来源的脱氢酶基因的黑曲霉按接种量3-5％接种于发酵培养基ⅱ中发酵培养获得发酵培养液ⅰ，所述发酵培养液ⅰ为含有桧状青霉来源的阿魏酸酯酶和桧状青霉来源的脱氢酶的黑曲霉转化子酶系，以及黑曲霉来源的β-葡萄糖苷酶；

将里氏木霉按接种量3-5％接种于发酵培养基ⅰ中发酵培养获得发酵培养液ⅱ，所述发酵培养液ⅱ为含有里氏木霉来源的纤维素酶；以及

将所述发酵培养液ⅰ与所述发酵培养液ⅱ按照体积比1:7-10复配获得复合纤维素酶系。

优选的是，所述黑曲霉转化子酶系与里氏木霉酶系按照体积比1:8.5复配获得复合纤维素酶系。

优选的是，所述发酵培养基ⅰ包括以下组分：

硫酸铵2.8g/l，玉米芯50g/l，麸皮30g/l，硫酸镁0.9g/l，氯化钙0.9g/l，磷酸二氢钾4g/l，蒸馏水1l；

所述发酵培养基ⅱ包括以下组分：微晶纤维素33g/l，玉米浆干粉17g/l，占发酵培养基ⅱ的质量百分含量为0.5％的(nh4)2so4，占发酵培养基ⅱ的质量百分含量为0.1％的mgso4，占发酵培养基ⅱ的质量百分含量为0.25％的甘油，占发酵培养基ⅱ的质量百分含量为0.25％的caco3，并调节ph为5.0。

优选的是，所述里氏木霉发酵培养的条件为：发酵温度为28℃，摇床转速为18rpm，发酵时间为120小时；

所述黑曲霉发酵培养的条件为：发酵温度为30℃，培养时间为7天。

一种所述的复合纤维素酶系在燃料乙醇生产中的应用。

一种淀粉燃料乙醇的发酵生产方法，在酵母同步糖化发酵生产淀粉燃料乙醇过程中，向发酵醪液中添加所述的复合纤维素酶系，添加量为使得所述发酵醪液中所述的复合纤维素酶系的酶活力为20fpu/l-200fpu/l。

优选的是，所述的复合纤维素酶系的添加量为使得所述发酵醪液中所述的复合纤维素酶系的酶活力为30-50fpu/l。

优选的是，所述的复合纤维素酶系的添加量为使得所述发酵醪液中所述的复合纤维素酶系的酶活力为50fpu/l。

优选的是，酵母同步糖化发酵生产乙醇过程，具体包括以下步骤：

将0.3g酵母接种于100ml的灭菌的蒸馏水中进行活化处理，获得种子液；

将种子液按照体积百分比为1％添加入玉米醪液中，并添加所述复合纤维素酶系后混合均匀进行酵母同步糖化发酵，获得乙醇发酵液；

其中，酵母同步糖化发酵条件为：发酵温度为32℃，摇床转速为200rpm，发酵时间为36小时。

本发明至少包括以下有益效果：

本发明提供的复合纤维素酶系可有效完善里氏木霉酶系，进而有效提高里氏木霉酶系降解结晶纤维素的速度；

本发明通过在酵母同步糖化发酵生产淀粉燃料乙醇过程中，添加复合纤维素酶，一方面降低玉米醪液的粘度，另一方面将残余的纤维素和淀粉进一步水解，实现由玉米到燃料乙醇的高效转化，从而为乙醇发酵工业带来显著的经济效益。在实际应用中，在复合纤维素酶系最佳用量为50fpu/l条件下，与对照例(未加复合纤维素酶系)相比，乙醇产量提高了13.44％。同时，可以看到乙醇产量提高的同时，醪液中剩余的总糖和粘度也都大幅度下降，比对照例降低64.57％和46.27％。

本发明的其它优点、目标和特征将部分通过下面的说明体现，部分还将通过对本发明的研究和实践而为本领域的技术人员所理解。

附图说明

图1为以psimple-19为原始质粒，将桧状青霉来源的阿魏酸酯酶和脱氢酶通过重组酶一步法连入psimple-19质粒中，构建成功阿魏酸酯酶和脱氢酶的异源表达盒psimple-19-fae-sdr的过程示意图；

图2阿魏酸酯酶和脱氢酶的异源表达盒psimple-19-fae-sdr在黑曲霉中成功表达转化子的凝胶电泳照片；

图3阿魏酸酯酶和脱氢酶的异源表达盒psimple-19-fae-sdr在黑曲霉中成功异源表达的凝胶电泳照片；

图4为根据本发明中对同步糖化发酵后的玉米醪液残渣ddgs进行分析中，在平板中经65℃烘干的玉米醪液残渣ddgs的照片，其中，a为未添加所述复合纤维素酶系的玉米醪液残渣，b为添加所述复合纤维素酶系的玉米醪液残渣。

具体实施方式

下面结合附图对本发明做进一步的详细说明，以令本领域技术人员参照说明书文字能够据以实施。

应当理解，本文所使用的诸如“具有”、“包含”以及“包括”术语并不排除一个或多个其它元件或其组合的存在或添加。

1、转化有桧状青霉来源的阿魏酸酯酶基因和桧状青霉来源的脱氢酶基因的黑曲霉的制备方法为：

本申请人以psimple-19为原始质粒，将桧状青霉来源的阿魏酸酯酶和脱氢酶通过重组酶一步法连入psimple-19质粒中(如图1所示)，构建成功阿魏酸酯酶和脱氢酶的异源表达盒psimple-19-fae-sdr并进行琼脂糖凝胶电泳检测(如图2所示)，泳道1-8是脱氢酶和阿魏酸酯酶在黑曲霉中成功表达转化子分子验证，泳道9是psimple-19质粒的空白对照。

其中，阿魏酸酯酶基因序列(多核苷酸序列)如seqidno:1所示：

脱氢酶基因序列(多核苷酸序列)如seqidno:2所示。

2、将构建成功的阿魏酸酯酶和脱氢酶的异源表达盒psimple-19-fae-sdr，在黑曲霉中完成异源表达，并进行琼脂糖凝胶电泳检测(如图3所示)，泳道1，脱氢酶的表达盒，泳道2，阿魏酸酯酶表达盒，泳道3，脱氢酶-阿魏酸酯酶表达盒。

3、本申请中所应用的醪液的来源及相关参数。

醪液来源，中石油吉林燃料乙醇研究院，是来自淀粉燃料乙醇大生产的原材料。葡萄糖浓度达到200g/l，粘度达到34.8pa.s。

实施例1

本发明提供一种采用如下方法制备的复合纤维素酶系，所述方法包括以下步骤：

将转化有桧状青霉来源的阿魏酸酯酶基因和桧状青霉来源的脱氢酶基因的黑曲霉按接种量3％接种于发酵培养基ⅱ中发酵培养获得发酵培养液ⅰ，所述发酵培养液ⅰ为含有桧状青霉来源的阿魏酸酯酶和桧状青霉来源的脱氢酶的黑曲霉转化子酶系，以及黑曲霉来源的β-葡萄糖苷酶；

将里氏木霉按接种量3％接种于发酵培养基ⅰ中发酵培养获得发酵培养液ⅱ，所述发酵培养液ⅱ为含有里氏木霉来源的纤维素酶；以及

将所述发酵培养液ⅰ与所述发酵培养液ⅱ按照体积比1:10复配(充分混合)获得复合纤维素酶系。

其中，所述发酵培养基ⅰ包括以下组分：

硫酸铵2.8g/l，玉米芯50g/l，麸皮30g/l，硫酸镁0.9g/l，氯化钙0.9g/l，磷酸二氢钾4g/l，蒸馏水1l；

所述发酵培养基ⅱ包括以下组分：微晶纤维素33g/l，玉米浆干粉17g/l，占发酵培养基ⅱ的质量百分含量为0.5％的(nh4)2so4，占发酵培养基ⅱ的质量百分含量为0.1％的mgso4，占发酵培养基ⅱ的质量百分含量为0.25％的甘油，占发酵培养基ⅱ的质量百分含量为0.25％的caco3，并调节ph为5.0；

所述里氏木霉发酵培养的条件为：发酵温度为28℃，摇床转速为18rpm，发酵时间为120小时；

所述黑曲霉发酵培养的条件为：发酵温度为30℃，培养时间为7天。

实施例2

本发明提供一种采用如下方法制备的复合纤维素酶系，所述方法包括以下步骤：

将转化有桧状青霉来源的阿魏酸酯酶基因和桧状青霉来源的脱氢酶基因的黑曲霉按接种量4％接种于发酵培养基ⅱ中发酵培养获得发酵培养液ⅰ，所述发酵培养液ⅰ为含有桧状青霉来源的阿魏酸酯酶和桧状青霉来源的脱氢酶的黑曲霉转化子酶系，以及黑曲霉来源的β-葡萄糖苷酶；

将里氏木霉按接种量4％接种于发酵培养基ⅰ中发酵培养获得发酵培养液ⅱ，所述发酵培养液ⅱ为含有里氏木霉来源的纤维素酶；以及

将所述发酵培养液ⅰ与所述发酵培养液ⅱ按照体积比1:8.5复配(充分混合)获得复合纤维素酶系。

其中，所述发酵培养基ⅰ包括以下组分：

硫酸铵2.8g/l，玉米芯50g/l，麸皮30g/l，硫酸镁0.9g/l，氯化钙0.9g/l，磷酸二氢钾4g/l，蒸馏水1l；

所述发酵培养基ⅱ包括以下组分：微晶纤维素33g/l，玉米浆干粉17g/l，占发酵培养基ⅱ的质量百分含量为0.5％的(nh4)2so4，占发酵培养基ⅱ的质量百分含量为0.1％的mgso4，占发酵培养基ⅱ的质量百分含量为0.25％的甘油，占发酵培养基ⅱ的质量百分含量为0.25％的caco3，并调节ph为5.0；

所述里氏木霉发酵培养的条件为：发酵温度为28℃，摇床转速为18rpm，发酵时间为120小时；

所述黑曲霉发酵培养的条件为：发酵温度为30℃，培养时间为7天。

实施例3

本发明提供一种采用如下方法制备的复合纤维素酶系，所述方法包括以下步骤：

将转化有桧状青霉来源的阿魏酸酯酶基因和桧状青霉来源的脱氢酶基因的黑曲霉按接种量5％接种于发酵培养基ⅱ中发酵培养获得发酵培养液ⅰ，所述发酵培养液ⅰ为含有桧状青霉来源的阿魏酸酯酶和桧状青霉来源的脱氢酶的黑曲霉转化子酶系，以及黑曲霉来源的β-葡萄糖苷酶；

将里氏木霉按接种量5％接种于发酵培养基ⅰ中发酵培养获得发酵培养液ⅱ，所述发酵培养液ⅱ为含有里氏木霉来源的纤维素酶；以及

将所述发酵培养液ⅰ与所述发酵培养液ⅱ按照体积比1:7复配(充分混合)获得复合纤维素酶系。

其中，所述发酵培养基ⅰ包括以下组分：

硫酸铵2.8g/l，玉米芯50g/l，麸皮30g/l，硫酸镁0.9g/l，氯化钙0.9g/l，磷酸二氢钾4g/l，蒸馏水1l；

所述发酵培养基ⅱ包括以下组分：微晶纤维素33g/l，玉米浆干粉17g/l，占发酵培养基ⅱ的质量百分含量为0.5％的(nh4)2so4，占发酵培养基ⅱ的质量百分含量为0.1％的mgso4，占发酵培养基ⅱ的质量百分含量为0.25％的甘油，占发酵培养基ⅱ的质量百分含量为0.25％的caco3，并调节ph为5.0；

所述里氏木霉发酵培养的条件为：发酵温度为28℃，摇床转速为18rpm，发酵时间为120小时；

所述黑曲霉发酵培养的条件为：发酵温度为30℃，培养时间为7天。

实施例4

一种淀粉燃料乙醇的发酵生产方法，在酵母同步糖化发酵生产淀粉燃料乙醇过程中，向发酵醪液中添加所述的复合纤维素酶系，添加量为使得所述发酵醪液中所述的复合纤维素酶系的酶活力为20fpu/l。

其中，采用的是实施例1中获得的所述复合纤维素酶系；

酵母同步糖化发酵生产乙醇过程，具体包括以下步骤：

将0.3g酵母接种于100ml的灭菌的蒸馏水中进行活化处理，获得种子液；

将种子液按照体积百分比为1％添加入玉米醪液中，并添加所述复合纤维素酶系后混合均匀进行酵母同步糖化发酵，获得乙醇发酵液；

其中，酵母同步糖化发酵条件为：发酵温度为32℃，摇床转速为200rpm，发酵时间为36小时。

实施例5

一种淀粉燃料乙醇的发酵生产方法，在酵母同步糖化发酵生产淀粉燃料乙醇过程中，向发酵醪液中添加所述的复合纤维素酶系，添加量为使得所述发酵醪液中所述的复合纤维素酶系的酶活力为30fpu/l。

其中，采用的是实施例1中获得的所述复合纤维素酶系；

酵母同步糖化发酵生产乙醇过程，具体包括以下步骤：

将酵母接种于玉米醪液中进行活化处理，获得种子液；

将0.3g酵母接种于100ml的灭菌的蒸馏水中进行活化处理，获得种子液；

将种子液按照体积百分比为1％添加入玉米醪液中，并添加所述复合纤维素酶系后混合均匀进行酵母同步糖化发酵，获得乙醇发酵液；

其中，酵母同步糖化发酵条件为：发酵温度为32℃，摇床转速为200rpm，发酵时间为36小时。

实施例6

一种淀粉燃料乙醇的发酵生产方法，在酵母同步糖化发酵生产淀粉燃料乙醇过程中，向发酵醪液中添加所述的复合纤维素酶系，添加量为使得所述发酵醪液中所述的复合纤维素酶系的酶活力为40fpu/l。

其中，采用的是实施例2中获得的所述复合纤维素酶系；

酵母同步糖化发酵生产乙醇过程，具体包括以下步骤：

将0.3g酵母接种于100ml的灭菌的蒸馏水中进行活化处理，获得种子液；

将种子液按照体积百分比为1％添加入玉米醪液中，并添加所述复合纤维素酶系后混合均匀进行酵母同步糖化发酵，获得乙醇发酵液；

其中，酵母同步糖化发酵条件为：发酵温度为32℃，摇床转速为200rpm，发酵时间为36小时。

实施例7

一种淀粉燃料乙醇的发酵生产方法，在酵母同步糖化发酵生产淀粉燃料乙醇过程中，向发酵醪液中添加所述的复合纤维素酶系，添加量为使得所述发酵醪液中所述的复合纤维素酶系的酶活力为50fpu/l。

其中，采用的是实施例2中获得的所述复合纤维素酶系；

酵母同步糖化发酵生产乙醇过程，具体包括以下步骤：

将0.3g酵母接种于100ml的灭菌的蒸馏水中进行活化处理，获得种子液；

将种子液按照体积百分比为1％添加入玉米醪液中，并添加所述复合纤维素酶系后混合均匀进行酵母同步糖化发酵，获得乙醇发酵液；

其中，酵母同步糖化发酵条件为：发酵温度为32℃，摇床转速为200rpm，发酵时间为36小时。

实施例8

一种淀粉燃料乙醇的发酵生产方法，在酵母同步糖化发酵生产淀粉燃料乙醇过程中，向发酵醪液中添加所述的复合纤维素酶系，添加量为使得所述发酵醪液中所述的复合纤维素酶系的酶活力为100fpu/l。

其中，采用的是实施例3中获得的所述复合纤维素酶系；

酵母同步糖化发酵生产乙醇过程，具体包括以下步骤：

将0.3g酵母接种于100ml的灭菌的蒸馏水中进行活化处理，获得种子液；

将种子液按照体积百分比为1％添加入玉米醪液中，并添加所述复合纤维素酶系后混合均匀进行酵母同步糖化发酵，获得乙醇发酵液；

其中，酵母同步糖化发酵条件为：发酵温度为32℃，摇床转速为200rpm，发酵时间为36小时。

实施例9

一种淀粉燃料乙醇的发酵生产方法，在酵母同步糖化发酵生产淀粉燃料乙醇过程中，向发酵醪液中添加所述的复合纤维素酶系，添加量为使得所述发酵醪液中所述的复合纤维素酶系的酶活力为150fpu/l。

其中，采用的是实施例2中获得的所述复合纤维素酶系；

酵母同步糖化发酵生产乙醇过程，具体包括以下步骤：

将0.3g酵母接种于100ml的灭菌的蒸馏水中进行活化处理，获得种子液；

将种子液按照体积百分比为1％添加入玉米醪液中，并添加所述复合纤维素酶系后混合均匀进行酵母同步糖化发酵，获得乙醇发酵液；

其中，酵母同步糖化发酵条件为：发酵温度为32℃，摇床转速为200rpm，发酵时间为36小时。

实施例10

一种淀粉燃料乙醇的发酵生产方法，在酵母同步糖化发酵生产淀粉燃料乙醇过程中，向发酵醪液中添加所述的复合纤维素酶系，添加量为使得所述发酵醪液中所述的复合纤维素酶系的酶活力为200fpu/l。

其中，采用的是实施例2获得的所述复合纤维素酶系；

酵母同步糖化发酵生产乙醇过程，具体包括以下步骤：

将0.3g酵母接种于100ml的灭菌的蒸馏水中进行活化处理，获得种子液；

将种子液按照体积百分比为1％添加入玉米醪液中，并添加所述复合纤维素酶系后混合均匀进行酵母同步糖化发酵，获得乙醇发酵液；

其中，酵母同步糖化发酵条件为：发酵温度为32℃，摇床转速为200rpm，发酵时间为36小时。

对照例

酵母同步糖化发酵生产乙醇的条件同实施例4-10。

实施例4-10及对照例中乙醇产量，醪液中剩余的总糖和粘度具体参见下表1。

表1：

与对照例(未加纤维素酶)相比，乙醇产量提高了13.44％。同时，可以看到乙醇产量提高的同时，剩余的总糖和粘度也都大幅度下降，比对照降低64.57％和46.27％。

根据本发明的上述实施例，对实际生产中不同发酵规模时，复合纤维素酶系促进乙醇产量的应用进行比较：

本申请人在不同发酵规模上(0.3l摇瓶，1l摇瓶，5l发酵罐，70l)应用复合纤维素酶系(添加量为使得发酵醪液中所述的复合纤维素酶系的酶活力为50fpu/l)，评价乙醇产量情况。可以从下表2结果看到，0.3l摇瓶，1l摇瓶，5l发酵罐，70l发酵罐不同发酵规模上，乙醇产量是相对稳定的。5l的发酵规模上，乙醇产量可以达到120.83g/l；70l发酵规模上，乙醇产量可以达到117.04g/l，与发酵罐对照相比，乙醇产量分别提高了16.58％和12.93％。

注明：发酵罐对照比摇瓶对照乙醇产量高的原因，发酵罐一方面减少了乙醇挥发，另一方面发酵罐混合更加均匀，酵母利用更好，所以乙醇产量更高。

表2：不同发酵规模上复合纤维素酶系在淀粉乙醇生产中的应用

连续发酵中纤维素酶促进乙醇产量的应用

以上实验是根据吉林乙醇研究院的方法用水活化安琪酵母1小时，然后加入玉米醪液中同步糖化发酵。

此外，本申请人还对同步糖化发酵后的玉米醪液残渣ddgs进行分析。我们将剩余的ddgs残渣倒至平板，与65℃烘干，通过颜色观察，添加复合纤维素酶系(图4b)与未添加复合纤维素酶系(图4a)处理的ddgs颜色区别不明显，颜色无变化(如图4所示)。

经济效益核算：

吉林燃料乙醇年产60万吨，糖化醪每年用量大约600万吨。乙醇的价格是6000元/吨。我们按照一吨玉米糖化醪加入5×10⁴fpu复合纤维素酶系，乙醇产量可以提高5％计算。

10吨糖化醪可以产1吨乙醇；1吨乙醇可以提高产量6％计算，大约增加收益360元；10吨糖化醪需要复合纤维素酶系5×10⁵fpu，大约需要0.0125吨复合纤维素酶系液(按照4×10⁷fpu/吨酶液计算)，复合纤维素酶系的生产成本约10000元/吨。1吨乙醇需要增加复合纤维素酶系成本12.5元。一吨乙醇可以同时产生0.8吨ddgs。加入复合纤维素酶系后同步糖化发酵剩余的ddgs量减少了10.47％，按照ddgs1400元/吨。一吨乙醇减少ddgs的收入117元(1400*0.8*10.47％)，1吨乙醇净收益可以增加230元左右，吉林燃料乙醇一年(按照60万吨计算)可以增加净收益1.38亿元。

尽管本发明的实施方案已公开如上，但其并不仅仅限于说明书和实施方式中所列运用，它完全可以被适用于各种适合本发明的领域，对于熟悉本领域的人员而言，可容易地实现另外的修改，因此在不背离说明书及等同范围所限定的一般概念下，本发明并不限于特定的细节和这里示出与描述的图例。

<110>中国科学院天津工业生物技术研究所

<120>复合纤维素酶系及其在淀粉燃料乙醇生产中的应用

<160>2

<210>1

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<212>dna

<213>桧状青霉（penicilliumpiceum）

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<212>桧状青霉（penicilliumpiceum）

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