一种新型章鱼胺二聚体类化合物、制备方法及应用与流程

本发明涉及药物提取技术领域，具体涉及到一种新型章鱼胺二聚体类化合物、制备方法及应用。

背景技术：

多花黄精，来源于百合科黄精属多花黄精植物的干燥根茎，又名姜形黄精。主产于我国南方地区，湖南省栽培多花黄精历史悠久，是其道地产地之一。《本草纲目》言其“得坤土之精，为补养中宫之胜品”，具有补肾益精，滋阴润燥的功效，长期用于治疗肾虚亏损，脾胃虚弱，肺虚燥咳，体倦乏力之症，同时也是数十种复方滋补药剂的重要组分，黄精根状茎形状有如山芋，山区老百姓常把它当作蔬菜食用药用植物，具有补脾，润肺生津的作用。此外，由于黄精还含有多种功效成分，如呋甾烯醇型皂甙、螺甾烯醇型皂甙和多糖等，通常还用于抗氧化、抗疲劳方面。

目前已经从黄精中提取了多种活性物质，如专利申请号cn104069348a公开了一种黄精提取物及其制备方法与应用，该发明将黄精通过乙醇热提后，再用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇萃取，得到的化合物中主要含5-羟甲基糠醛、甾体皂苷和酚酸类(木脂素等)成分，主要用于抗糖尿病及其并发症上；专利申请号cn201510395570.x公开了一种黄精中多种活性成分的提取分离方法，通过闪式提取技术提取分离黄精多糖、黄精皂苷和黄精黄酮等活性成分。针对黄精化学成分的研究，目前从黄精中提取得到的有效成分还比较少，主要是黄精多糖、黄精皂苷和黄精黄酮等几种，然而黄精有效成分十分复杂，仅仅这几种成分是不够的，仍需要对黄精提取工艺进行深入研究，以提取更多有效成分。从黄精中提取分离出章鱼胺二聚体类化合物至今尚未见报道，也没有人从其他物质中提取出章鱼胺二聚体类化合物。

技术实现要素：

本发明的目的是克服现有技术的不足，提供一种新型章鱼胺二聚体类化合物、制备方法及应用。

本发明提供了一种新型章鱼胺二聚体类化合物，所述章鱼胺二聚体类化合物的结构式如下：

本发明还提供了一种新型章鱼胺二聚体类化合物的制备方法，包括以下步骤：

(1)用乙醇提取黄精粉末，得到的提取液用正丁醇萃取，正丁醇层浓缩得到浸膏；

(2)浸膏经大孔吸附树脂柱用水-乙醇进行梯度洗脱，得到7个不同的馏分a-g；

(3)馏分e经柱色谱用氯仿-甲醇-水恒度洗脱，将所得洗脱组分用乙酸乙酯-氯仿-甲醇-水进一步恒度洗脱，洗脱出的液体干燥得到新型章鱼胺二聚体类化合物。

优选的，所述步骤(1)中的黄精粉末的制备方法为：将多花黄精根部经过干燥和粉碎处理，过筛后得到黄精粉末。

优选的，所述步骤(1)中乙醇的体积浓度为95％。

优选的，所述步骤(1)中黄精粉末与乙醇的质量比为1:5-8。

优选的，所述步骤(2)中水-乙醇的体积比为1:20-19:20。

优选的，所述步骤(3)中氯仿-甲醇-水的体积比为8:2:1。

优选的，所述步骤(3)中乙酸乙酯-氯仿-甲醇-水的体积比为15:8:4:1。

优选的，所述步骤(3)中柱色谱为硅胶柱色谱。

本发明还提供了一种新型章鱼胺二聚体类化合物在制备抗菌药物中的应用。

本发明所述步骤(1)中所述用乙醇提取黄精粉末分为多次提取，以最大限度提取出原料中的活性成分，提取次数不少于2次。

本发明步骤(2)所述梯度洗脱中洗脱剂水-乙醇的极性是由小到大洗脱的，依次洗脱出7个不同的馏分a-g，a馏分是最先洗脱出来的，g馏分是最后洗脱出来的。

目前，研究人员从黄精中提取了多种活性成分，如黄精多糖、皂苷和黄酮等，主要运用的方法是醇提或者是水提，再将提取液用有机溶剂或水进行多次萃取，有机层再经过洗脱，纯化得到活性成分。但是常用的洗脱剂是水、乙醇或石油醚-乙酸乙酯，如专利申请号cn201710317110.4中从黄精中提取得到一种新的二氢高异黄酮，所用的洗脱剂为石油醚-乙酸乙酯；其他中药物质进行提取时用到的较多的洗脱剂也是水、乙醇或氯仿-甲醇，如专利申请号cn201510058772.5中从宽筋藤中提取得到一种宽筋藤乙酰胆碱酯酶抑制活性提取物，其中的洗脱剂为氯仿-甲醇。目前并未出现以乙酸乙酯-氯仿-甲醇-水混合进行洗脱，

而是以单一的乙酸乙酯、甲醇或者氯仿洗脱，本领域技术人员知道以多种溶剂混合洗脱相比于单一的有机溶剂洗脱，其效果是不可预测的，因此现有技术中有以单一的乙酸乙酯、甲醇或者氯仿做洗脱剂，并不能想到将三者混合做洗脱剂；并且在其他中药物质的提取中，大都是一次洗脱，而且就算是多次洗脱其洗脱剂也相差不大。本发明将经过正丁醇萃取得到的浸膏先用水-乙醇梯度洗脱，然后将馏分e再分别用氯仿-甲醇-水和的乙酸乙酯-氯仿-甲醇-水恒度洗脱，最终洗脱得到的液体纯化得到新型章鱼胺二聚体类化合物。本发明所用的洗脱剂与现有用于中药物质活性成分提取的洗脱剂有较大的差别，而洗脱剂的种类不同，极性不同，最终黄精中提取得到的活性成分也不一样，因此，在现有技术的基础上，并不存在任何的启示将现有技术中的洗脱剂替换为本申请中的洗脱剂，也就难以得到本申请的技术方案。

本申请用乙醇提取黄精粉末，得到的提取液用正丁醇萃取，浓缩得到浸膏；浸膏用体积比为1:20-19:20的水-乙醇梯度洗脱，得到7个不同的馏分a-g，然后将馏分e分别用体积比为8:2:1的氯仿-甲醇-水和体积比为15:8:4:1的乙酸乙酯-氯仿-甲醇-水恒度洗脱，洗脱得到的液体纯化得到新型章鱼胺二聚体类化合物，这种化合物是首次在黄精中被提取出来，并且是自然界中全新的化合物，制备方法简单，操作方便。

采用本发明的制备方法从黄精中提取出一种全新的化合物，即新型章鱼胺二聚体类化合物，本申请的发明人通过研究发现，该化合物具有很好的抗菌效果，可用于制备抗菌药物，有利于对黄精药材及其制剂的开发和质量控制。

本发明的有益效果是：

1、本发明将经过正丁醇萃取得到的浸膏先用水-乙醇梯度洗脱，然后将馏分e再分别用氯仿-甲醇-水和的乙酸乙酯-氯仿-甲醇-水恒度洗脱，最终洗脱得到的液体纯化得到新型章鱼胺二聚体类化合物，这种化合物是首次在黄精中被提取出来，并且是自然界中全新的化合物，充分利用了黄精资源，提高了原材料的使用价值，对推进黄精活性成分的研究、应用有重要意义。

2、采用本发明的制备方法从黄精中提取出一种全新的化合物，即新型章鱼胺二聚体类化合物，该化合物具有很好的抗菌效果，可用于制备抗菌药物，具有重要的临床应用价值，有利于对黄精药材及其制剂的开发和质量控制。

3、本发明方法所使用的有机溶剂毒性较小，易于回收；且本方法具有工序少、设备简单、操作方便、可行性好、生产成本低廉等特点，最终得到的新型章鱼胺二聚体类化合物纯度高，达到95％以上。

附图说明

图1为本发明新型章鱼胺二聚体类化合物的¹³c-nmr谱图。

图2为本发明新型章鱼胺二聚体类化合物的¹h-nmr谱图。

图3为本发明新型章鱼胺二聚体类化合物的异核单量子关系(hsqc)谱图。

图4为本发明新型章鱼胺二聚体类化合物的多键碳氢关系(hmbc)谱图。

图5为本发明新型章鱼胺二聚体类化合物的同核位移相关(¹h-¹hcosy)谱图。

具体实施方式

为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚明白，以下结合具体实施例，对本发明进一步详细说明。

实施例1

(1)取500g多花黄精根部原料，干燥后经粉碎处理，过筛得到黄精粉末，用2500ml体积浓度为95％的乙醇提取，提取使用仪器为dtq-200型多功能提取罐，重复提取2次后，得到提取液；将提取液用2500ml的正丁醇进行萃取，正丁醇层浓缩得到浸膏；

(2)将浸膏上样于ab-8大孔吸附树脂柱，用5000ml体积比1:20-19:20的水-乙醇进行梯度洗脱，得到7个不同的馏分a-g；

(3)馏分e上样于硅胶柱色谱，用3500ml体积比为8:2:1的氯仿-甲醇-水恒度洗脱，将所得洗脱组分用2000ml体积比为15:8:4:1的乙酸乙酯-氯仿-甲醇-水进一步恒度洗脱，洗脱出的液体干燥得到新型章鱼胺二聚体类化合物，其纯度大于95％。

实施例2

(1)取500g多花黄精根部原料，干燥后经粉碎处理，过筛得到黄精粉末，用4000ml体积浓度为95％的乙醇提取，提取使用仪器为dtq-200型多功能提取罐，重复提取3次后，得到提取液；将提取液用2000ml的正丁醇进行萃取，正丁醇层浓缩得到浸膏；

(2)将浸膏上样于ab-8大孔吸附树脂柱，用5000ml体积比1:20-19:20的水-乙醇进行梯度洗脱，得到7个不同的馏分a-g；

(3)馏分e上样于硅胶柱色谱，用3500ml体积比为8:2:1的氯仿-甲醇-水恒度洗脱，将所得洗脱组分用2000ml体积比为15:8:4:1的乙酸乙酯-氯仿-甲醇-水进一步恒度洗脱，洗脱出的液体干燥得到新型章鱼胺二聚体类化合物，其纯度大于95％。

1、化合物结构鉴定：

实施例1得到的新型章鱼胺二聚体类化合物为白色粉末，对其结构进行鉴定，该新型章鱼胺二聚体类化合物的核磁共振谱图的数据如表1所示，核磁共振碳谱和核磁共振氢谱如图1和2所示，hsqc谱图如图3所示，hmbc谱图如图4所示，1h-1hcosy谱图如图5所示。

表1新型章鱼胺二聚体类化合物的核磁谱图

如图1-5所示，在¹hnmr谱图中，7.43(1h,d,j＝15.7hz,h-7')及6.47(1h,d,j＝15.7hz,h-8')信号构成了一个反式取代的双键，7.16(2h,d,j＝8.4hz,h-2andh-6),6.78(2h,d,j＝8.4hz,h-3andh-5),129.2(d,c-2andc-6)以及116.3(d,c-3andc-5),结合¹³cnmr谱图，可证实存在一个对位取代的芳环，此外，7.12(1h,d,j＝1.3hz,h-2'),6.79(1h,d,j＝8.3hz,h-5'),7.02(1h,dd,j＝8.3,1.3hz,h-6')及111.5(d,c-2'),116.5(d,c-5'),123.3(d,c-6')证实了其为1,3,4-三取代的芳环。δh3.88及δc56.4证实了存在一个甲氧基，δh4.24,3.39,3.50和δc83.2(d),47.1(t),169.2(s)证实了n-乙基甲酰胺基团的存在。¹h-¹hcosy谱图显示了c7-c8和c7'-c8'存在连接。此外，hmbc谱图中，3.39(1h,dd,j＝13.8,8.5hz,h-8a),3.50(1h,dd,j＝13.8,4.6hz,h-8b),7.43(1h,d,j＝15.7hz,h-7')与c-9'(δc169.2)信号相关,4.24(1h,dd,j＝8.5,4.6hz,h-7)与c-2,c-6(δc129.2)信号相关,7.43(1h,d,j＝15.7hz,h-7')与c-2'(δc111.5)和c-6'(δc123.3)信号相关，3.88(3h,s)与c-3'(δc149.3)信号相关，以上信息说明该化合物有可能为反式-n-阿魏酸胺，进一步比较其化学位移的变化规律可知，发现该化合物是由反式-n-阿魏酸胺成醚键(c-o-c)进一步形成的二聚体化合物，经鉴

定，该新型章鱼胺二聚体类化合物为反式-双(n-阿魏酰基)章鱼胺。

2、抗菌活性研究

将新型章鱼胺二聚体类化合物进行最小抑制浓度(minimuminhibitionconcentration，mic)测试实验，具体实验步骤如下：

(1)从平板上接种少许菌于装有lb培养基(luria-bertani培养基)的锥形瓶中，37℃摇床培养12～14h；其中，测试菌株包括:革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌；lb培养基的配方如下：胰蛋白陈(tryptone)10g/l，酵母提取物(yeastextract)5g/l，氧化钠(nacl)10g/l。

(2)第2天上午从锥形瓶中吸取菌液以1％的体积比转接于装有20ml的lb培养基的锥形瓶中，继续于37℃摇床中培养6h～7h，至od600(od600表示该菌液在600nm波长处的吸光值)为0.6～0.8，并记录菌液的具体od值(opticaldensity，光密度)。

(3)用lb培养基将培养后的菌液稀释1000倍，使菌液浓度为105cfu/ml，吸取稀释后的菌液，并加至96孔板中，每孔150μl。

(4)分别配制浓度为128μg/ml的新型章鱼胺二聚体类化合物溶液，吸取150μl该新型章鱼胺二聚体类化合物溶液加至96孔板中的第1孔中，然后吸出150μl至第2孔中，以此类推。

(5)滴加完毕后，将96孔板放入摇床中经37℃培养12h～14h。

(6)滴加完毕后，放入摇床中经37℃培养的最佳时间为12h～14h。

肉眼观察，没有变浑浊的孔所对应的最小的浓度即为该菌的最小抑制浓度，具体参见表2，表2为新型章鱼胺二聚体类化合物对两种细菌的最小抑制浓度(mic)。

表2新型章鱼胺二聚体类化合物的最小抑制浓度(mic)

如表3所示，本发明实施例1得到的新型章鱼胺二聚体类化合物能够显著抑制革兰氏阳性菌的生长，对金黄色葡萄球菌和芽孢杆菌等的最小抑制浓度为1～2μg/ml，可见该新型章鱼胺二聚体类化合物的抗菌效果良好，能用于制备抗菌药物。