一种促进木薯渣基质发酵进程的放线菌的分离方法与流程

本发明属于基质微生物发酵技术领域，涉及一种促进木薯渣基质发酵进程的放线菌分离方法。

背景技术：

木薯是我国南方重要的经济作物，木薯渣作为木薯加工工业酒精后剩下的有机固体废弃物，主要以纤维素、半纤维素和木质素为主，富含多种对动植物有益的微量元素。目前，新鲜木薯渣因其湿度大，利用起来还存在较多困难，除很少一部分用于动物饲料外，大多数都是未经处理就直接排放到环境中，不仅造成资源浪费，而且对生态环境威胁较大。因此，木薯渣的资源化再利用已成为我国南方地区固体废弃物管理急需解决的难题。

木薯渣基质化利用是解决这一难题的最好途径之一。目前，有关利用发酵后的木薯渣作为蔬菜栽培基质或作为辣椒、黄瓜等作物育苗基质的研究取得了一定的进展，并且木薯渣可部分替代草炭，一定程度上弥补了草炭资源紧张的问题。但木薯渣基质发酵进程研究较少，尤其影响木薯渣发酵进程的微生物研究较少。因此，急需开发出对木薯渣基质发酵有益的微生物菌剂，对降低木薯渣污染环境，提高固体废弃物资源化利用具有重要的现实意义。

技术实现要素：

本发明目的正是基于上述现状而提供的一种促进木薯渣基质发酵进程的放线菌分离方法。该方法可为木薯渣基质化利用提供有力的技术基础。

本发明的目的可通过以下技术方案实现：

一种从自然发酵木薯渣堆体中分离促进木薯渣基质发酵进程的放线菌方法，包括以自然发酵的木薯渣为原材料，根据自然发酵进程的关键阶段于初始期、升温期、高温期以及腐熟期四个时期分期取样；对取样菌种进行分离、纯化，纯化培养的菌株接种到纤维素刚果红培养基进行培养，并根据刚果红培养基透明圈的有无初筛出具有纤维素分解能力的菌株；对初筛菌株进行鉴定，将鉴定出的放线菌菌株接种到木薯渣固体培养基中发酵复筛，并依据固体发酵木薯渣的失重率和纤维素含量筛选出促进木薯渣基质发酵的放线菌。

本发明所述的方法，优选堆体的长度要大于2m，宽度要大于1m，高度要大于1m，并且每两天翻堆体一次。

作为本发明所述方法的优选，根据木薯渣发酵进程，分为四个关键阶段不同温度分批取样，这个四个时期覆盖了木薯渣整个的发酵过程，并且可以全面的掌握放线菌在木薯渣整个发酵过程的变化，以及可以分离出整个发酵过程的放线菌，增加放线菌的种类。初始期在堆体温度是25-27℃时取样，升温期在堆体温度达到35-45℃时取样，高温期在堆体温度达到55-60℃取样，腐熟期在堆体温度达到25-27℃时取样；优选初始期在堆体温度达到27℃时取样，升温期在堆体温度达到35℃和45℃时取样，高温期在堆体温度达到55℃和60℃取样，腐熟期在堆体温度达到27℃时取样。

所述的对取样菌种进行分离纯化优选包括：分别将样品制备成一定浓度梯度的悬浮液，然后采用改良高氏一号固体培养基进行初步分离；再将改良高氏一号固体培养基中生长的菌株接种到高氏一号固体培养基进行纯化传代培养；其中，改良的高氏一号固体培养基的组成：kno31g/l，可溶性淀粉20g/l，k2hpo40.5g/l，mgso4.7h2o0.5g/l，nacl0.5g/l，feso40.01g/l，琼脂18g/l，水1000ml、每1000ml培养基中加入3％重铬酸钾3.3ml；高氏一号固体培养基的组成：kno31g/l，可溶性淀粉20g/l，k2hpo40.5g/l，mgso4.7h2o0.5g/l，nacl0.5g/l，feso40.01g/l，琼脂18g/l，水1000ml、ph7.4-7.6。

所述的悬浮菌液的制备方法优选为：称取新鲜的样品10g，放入盛90ml无菌水的锥形瓶中、200转震荡40min、过滤、滤液梯度稀释制成10^-1-10^-4浓度梯度的菌悬液。

所述初步分离优选采用在改良高氏一号固体培养基上涂布的方法，培养的时间为5-7d，培养温度与每个样品的取样温度一致；所述纯化传代培养采用挑菌划线的方法，并且要连续纯化培养2-3次。

作为本发明所述方法的优选，所述纤维素刚果红培养基培养的温度与取样时的温度一致，培养时间为5-7d。

木薯渣固体培养基的发酵优选在锥形瓶中进行，28℃下发酵10d，并且每隔三天摇瓶一次。

木薯渣固体发酵培养基组成优选：木薯渣粉10g，营养发酵液15ml。营养发酵液：蛋白胨10g/l，mgso4·7h2o2.5g/l，kh2po45.0g/l，nacl2.5g/l，酵母提取物2.5g/l，cacl21g/l，水1000ml，ph7.0。

作为本发明方法进一步优选，包括以下步骤：

(1)建立新鲜木薯渣发酵堆体，自然发酵，堆体的长度要大于2m，宽度要大于1m，高度要大于1m，并且每两天翻堆体一次；

(2)根据自然发酵进程的关键阶段分期取样，分别为初始期、升温期、高温期以及腐熟期四个时期；取样时的温度分别为：初始期27℃；升温期35℃和45℃；高温期55℃和60℃；腐熟期27℃；

(3)对步骤(2)分阶段取的样品，分别将样品制备成一定浓度梯度的悬浮液，然后涂布到改良高氏一号固体培养基上培养，培养的时间为5-7d，培养温度与每个样品的取样温度一致；

(4)对步骤(3)中改良高氏一号固体培养基生长的菌株，采用挑菌划线的方法接种到高氏一号固体培养基进行纯化传代培养；

(5)对步骤(4)纯化培养的菌株，接种到纤维素刚果红培养基进行筛选培养，并根据刚果红培养基透明圈的有无筛选出具有纤维素分解能力的菌株；

(6)对步骤(5)筛选出的菌株进行16srdna序列测序比对；

(7)对步骤(6)鉴定出的放线菌菌株进行发酵效果验证比较，把步骤(6)的放线菌接种到木薯渣固体培养基中发酵，并依据固体发酵木薯渣的失重率和纤维素含量筛选出促进木薯渣基质发酵的放线菌。

有益效果：

本发明提供了一种促进木薯渣基质发酵进程的放线菌分离方法，实现了木薯渣基质发酵整个过程放线菌的分离、培养与鉴定，对放线菌在木薯渣基质发酵过程的作用提供依据，并为进一步制备促进木薯渣发酵的菌剂提供技术支持。本发明方法的提出，对木薯渣基质化利用具有重用的科学意义和应用价值。

本发明分离出的放线菌菌种，通过在木薯渣固体培养基中发酵10d后，发现热线链霉菌、灰略红链霉菌与湿链霉菌三者之间在失重率方面和对照相比没有显著的差异，但从纤维素的角度分析，发现灰略红链霉菌与热线链霉菌的发酵效果好于湿链霉菌。利用本发明方法，可以从不同的木薯渣发酵堆体中筛选出促进木薯渣基质发酵的放线菌。

附图说明

图1：促进木薯渣发酵放线菌分离过程的示意图

图2：木薯渣发酵关键阶段放线菌分离情况

图3：部分放线菌在刚果红培养基上生长的情况

图4：添加放线菌发酵木薯渣失重率分析

注：ⅰ-1：热线链霉菌(streptomycesthermolineatus)、ⅰ-2：灰略红链霉菌(streptomycesgriseorubens)、ⅰ-3：湿链霉菌(streptomyceshumidus)、ck：对照(添加无菌水)

图5：添加放线菌发酵木薯渣纤维素含量分析

注：ⅰ-1：热线链霉菌(streptomycesthermolineatus)、ⅰ-2：灰略红链霉菌(streptomycesgriseorubens)、ⅰ-3：湿链霉菌(streptomyceshumidus)、ck：对照(添加无菌水)

具体实施方式

实施例1

一、试验材料

新鲜的木薯渣取自江苏省兴化市新土源基质肥料有限公司，木薯渣含水量68％，ph＝5.93，ec＝4.96ms·cm^-1，总碳26.95g·kg^-1，总磷9.10g·kg^-1，总钾4.46g·kg^-1，纤维素35％，半纤维素22％，木质素14％。

木薯渣基质发酵的堆体长2.5m，宽1.5m，高1m，并覆盖塑料薄膜，每2～3d翻堆一次。

改良的高氏一号固体培养基：kno31g/l，可溶性淀粉20g/l，k2hpo40.5g/l，mgso4.7h2o0.5g/l，nacl0.5g/l，feso40.01g/l，琼脂18g/l，水1000ml、每1000ml培养基中加入3％重铬酸钾3.3ml。

高氏一号固体培养基：kno31g/l，可溶性淀粉20g/l，k2hpo40.5g/l，mgso4.7h2o0.5g/l，nacl0.5g/l，feso40.01g/l，琼脂18g/l，水1000ml、ph7.4-7.6。

刚果红培养基：羧甲基纤维素2.0g/l，硫酸铵2.0g/l，七水硫酸镁0.5g/l，磷酸氢二钾1.0g/l，氯化钠0.5g/l，琼脂粉18g/l，自来水1000ml，ph7.0。

二、试验方法

1、温度的测量：运用酒精温度计，分别在上午10：00和下午4：00测量，把温度计插到堆体的前、后、左、右和中心5个位置30cm处的测量。

2、取样方法：根据木薯渣发酵进程，分为四个关键阶段不同温度分批取样。初始期在堆体温度达到27℃时取样，升温期在堆体温度达到35℃和45℃时取样，高温期在堆体温度达到55℃和60℃取样，腐熟期在堆体温度达到27℃是取样。取样时采用5点取样法，在堆体深30cm处取样，并装入干净的塑料中，扎好，标记，记录采样时间等，之后储存在4℃冰箱中备用。

3、菌株分离

(1)配制改良高氏一号固体培养基，121℃高压灭菌20min，倒平板，培养基冷却备用。

(2)分批制备样品的菌悬液：称取木薯渣样品10g，放入含有90ml无菌水的锥形瓶中，放入摇床震荡(温度设置与取样温度一致，200转40min)，然后用无菌纱布过滤，此时的滤液中菌液浓度为10^-1，在超净台上用灭过菌的移液枪吸取1ml滤液(菌液浓度为10^-1)加入盛有9ml无菌水的无菌离心管中充分混匀，此时菌液浓度为10^-2，以此类推制成10^-2～10^-4几种稀释度的悬浮菌液。

(3)涂布：在超净工作台中，将培养皿标号，选取10^-2、10^-3、10^-4三个浓度梯度，每个浓度梯度设置3个重复，然后每个皿放入0.1ml相应稀释度的菌悬液，然后用无菌涂布棒将菌液涂开，室温下静置8min。

(4)培养：在生化培养箱中倒置培养，温度设置与样品取样时标记的温度一致。

4、菌株纯化培养

将改良高氏一号固体培养基上的菌株，采用划线的方法纯化，在高氏一号固体培养基上纯化培养，每种分离的放线菌连续纯化2次。

5、菌株筛选培养

菌株筛选培养，采用纤维素刚果红培养基筛选法，主要依据刚果红培养基透明圈的有无进行判断。

(1)配制刚果红培养基，121℃高压灭菌20min，倒平板，培养基冷却备用。

(2)在超净台中，运用接种针挑取放线菌菌落表面的孢子，然后接种到刚果红培养基中，在生化培养箱中倒置培养6d，培养温度设置与样品取样温度一致。

(3)培养6天之后，在长有菌落的培养皿中滴加0.3％的刚果红溶液，摇匀之后静置染色30min，然后用1mnacl溶液冲洗刚果红培养基，来回冲洗5～6次。

(4)依据刚果红培养基中透明圈的有无及大小，筛选出具有纤维素分解能力的放线菌。

6、放线菌菌种鉴定

(1)提取筛选出放线菌的基因组dna。

(2)对上述提取的放线菌基因组dna，采用16s通用引物进行pcr扩增。

(3)将pcr产物送至生物公司测序，将测序结果在ncbi数据库中进行blast，选取比对相似度在98％以上的结果。经鉴定、整理后具有纤维素分解能力3种放线菌分别为热线链霉菌、灰略红链霉菌与湿链霉菌。

7、木薯渣发酵试验

(1)配制木薯渣固体发酵培养基

1)配固体发酵营养液，蛋白胨10g/l，mgso4·7h2o2.5g/l，kh2po45.0g/l，nacl2.5g/l，酵母提取物2.5g/l，cacl21g/l，水1000ml，ph7.0。

2)木薯渣烘干粉碎后过60目筛，称取10g于锥形瓶中，并加入15ml固体发酵营养液。

3)固体培养基121℃高压灭菌20min。

(2)接种菌株

1)将分离出的以上3种菌种分别接种到高氏一号液体培养基中，28℃条件下，200转摇菌培养4d。

2)运用灭菌水将各菌种的初始孢子浓度调为1×10⁷个/ml。

3)木薯渣固体培养基接种菌液2ml。

4)并设置一组不加菌剂只加无菌水的对照(ck)处理。

5)每个处理设置三个重复。

(3)木薯渣固体培养基发酵

发酵条件为28℃条件下培养10d，且每隔3d摇瓶一次，使其发酵均匀。

(4)木薯渣失重率和纤维素含量的测定。

在失重率方面热线链霉菌、灰略红链霉菌与湿链霉菌三者之间和对照相比没有显著的差异，有机废弃物发酵过程中，影响发酵进程的主要因素就是废弃物中木质纤维的发酵降解，因此从纤维素含量的角度发现三株放线菌的纤维素降解率均明显大于对照，其中灰略红链霉菌与热线链霉菌的纤维素降解率大于湿链霉菌。因此，筛选到的促进木薯渣基质发酵进程的放线菌为一株灰略红链霉菌与一株热线链霉菌。