一种香豆素衍生物及其合成方法和在检测硫化氢中的应用与流程

本发明涉及香豆素衍生物和硫化氢检测，具体属于一种香豆素衍生物及其合成方法和在检测硫化氢中的应用。

背景技术：

研究表明，内源性的硫化氢主要来自于l-硫化氢的酶解作用，其生成机制至少与4种不同的酶有关:胱硫醚-β-合成酶(cbs)、胱硫醚-γ-裂解酶(cse)、3-巯基丙酮酸硫转移酶(3-mst)和硫化氢酶(cl)。这些酶广泛的存在于人体各种组织和器官中。在生理浓度水平下，硫化氢参与一系列的生理调控过程，例如调节血管张力、心肌收缩、神经传导和胰岛素分泌等。细胞一旦不能维持其正常的硫化氢浓度，便会引起动脉和肺动脉高压、阿尔茨海默氏症、胃粘膜损伤和肝硬化等疾病。此外，硫化氢也可清除活性氧和活性氮物种。许多研究还表明三个气体递质硫化氢、一氧化氮和一氧化碳之间还通过各种交互作用调控人体的健康与疾病。

应生物体系中硫化氢浓度水平检测的要求，设计选择性好、灵敏度高、具有低细胞毒性的用于检测活细胞和组织内硫化氢水平变化的荧光探针，已成为生物医学发展中具有挑战性的前沿课题之一。

在本发明中，合成了一种基于香豆素的化合物，通过硫化氢和化合物在反应前后荧光变化，实现硫化氢的特异性检测。

技术实现要素：

本发明的目的是提供一种香豆素衍生物及其制备方法，所述香豆素衍生物可用于硫化氢检测，且检测方法简单，操作方便，选择性好，灵敏度高。

本发明提供的一种香豆素衍生物，中文名称为2-氧代-2h-色烯-7-基2-((2,4-二硝基苯基)硫代)苯甲酸酯，英文名称为2-oxo-2h-chromen-7-yl2-((2,4-dinitrophenyl)thio)benzoate，命名为cdp结构式为：

本发明提供的一种香豆素衍生物cdp的合成方法，步骤为：

将2-[(2,4-二硝基苯基)硫代]苯甲酸，4-二甲基氨基吡啶，1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐和7-羟基香豆素在无水二氯甲烷中混合，将混合物在室温下搅拌过夜；减压除去溶剂，所得残余物通过硅胶柱色谱进一步纯化，得到浅黄色粉末状目标物cdp；其中2-[(2,4-二硝基苯基)硫代]苯甲酸和7-羟基香豆素的摩尔比为1：1。

所述柱色谱的洗脱剂为体积比20：1的二氯甲烷和甲醇的混合物。

所述香豆素衍生物cdp可用于硫化氢检测。

本发明提供的一种检测硫化氢的方法，步骤为：

(1)、配制ph＝7.4、浓度为10mm的pbs缓冲溶液，配制20mm的硫化氢水溶液；

(2)、取2ml的dmso/pbs(7:3v/v,ph7.4)溶液、2μlcdp的dmso溶液加到一个荧光比色皿中，在荧光分光光度仪上检测，随着待测样硫化氢的加入,465nm处的荧光强度的逐渐增强；

(3)、在6个比色皿中，各加入2ml的dmso/pbs(7:3v/v,ph7.4)溶液、2μlcdp的dmso溶液，分别加入硫化氢溶液的体积为0、4、8、12、16、20μl，30min后在荧光光谱仪上测定465nm处荧光强度为603.5、1581、2748、4030、5632、7173以硫化氢浓度为横坐标，以荧光强度为纵坐标绘制图，得到硫化氢浓度的工作曲线；线性回归方程为：f-f0＝330.6143c-281.14，c的单位为10^-5mol/l；

(4)、测定样品溶液时，将测得的荧光强度代入线性回归方程，即可求得硫化氢的浓度。

与现有技术相比，本发明具有如下优点和效果：

1、本发明香豆素衍生物的合成方法简单，操作方便；

2、本发明香豆素衍生物能实现对硫化氢的特异性检测，显示了高的灵敏性和极好的选择性；

3、本发明检测手段简单，只需要借助荧光光谱仪即可实现；

4、本发明检测信号明显，为增强型荧光。

附图说明

图1实施例1制备的香豆素衍生物cdp的核磁氢谱图

图2实施例1制备的香豆素衍生物cdp的核磁碳谱图

图3实施例1制备的香豆素衍生物cdp的质谱图

图4香豆素衍生物cdp与硫化氢作用的荧光发射图

图5香豆素衍生物cdp与各种分析物的荧光柱状图

图6香豆素衍生物cdp测定硫化氢的工作曲线

图7香豆素衍生物cdp测定样品的荧光发射图

图8香豆素衍生物cdp细胞成像图

具体实施方式

下面结合实施例和附图对本发明做进一步说明，但本发明不受下述实施例的限制。

实施例1

cdp的制备和表征

将4-二甲基氨基吡啶(12mg，0.1mmol)，1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(192mg，1mmol)，以及2-[(2,4-二硝基苯基)硫代]苯甲酸(320mg，1mmol)和7-羟基香豆素(162mg，1mmol)在25ml无水二氯甲烷中混合，将混合物在室温下搅拌过夜。减压除去溶剂，所得残余物通过硅胶柱色谱进一步纯化，用二氯甲烷：甲醇(20：1，v/v)作为洗脱剂，得到浅黄色粉末状目标物(412mg，88％)。¹hnmr(dmso-d6,600mhz):δ8.88(d,j＝2.2hz,1h),8.43-8.28(m,2h),8.08(d,j＝9.6hz,1h),7.86(d,j＝5.4hz,3h),7.79(d,j＝8.5hz,1h),7.36(s,1h),7.24-7.13(m,2h),6.49(d,j＝9.6hz,1h).(图1)¹³cnmr(dmso-d6,150mhz):δ163.3,159.4,153.9,152.2,144.7,144.4,143.6,137.4,134.4,133.3,132.1,131.2,130.0,129.4,127.6,121.0,118.2,116.9,115.9,109.8(图2).esi-msm/z:[m+na]⁺calcdfor487.0212,found487.0210(图3).

实施例2

配制ph＝7.4、浓度为10mm的pbs缓冲溶液，配制2mmcdp的dmso溶液，配制20mm硫化氢水溶液；取2ml的dmso/pbs(7:3v/v,ph7.4)溶液、2μlcdp的dmso溶液加到荧光比色皿中，逐渐加入硫化氢溶液的体积为0、4、8、12、16、20μl，30min后在荧光光谱仪上测定465nm处荧光强度为603.5、1581、2748、4030、5632、7173，荧光强度逐渐增强。荧光发射图见图4。

实施例3

配制ph＝7.4、浓度为10mm的pbs缓冲溶液，配制2mmcdp的dmso溶液，配制20mm的硫化氢水溶液；在荧光比色皿中，各加入2ml的dmso/pbs(7:3v/v,ph7.4)溶液和2μlcdp的dmso溶液，再分别加入10倍当量的其它分析物和硫化氢：cys,hcy,gsh,s2o3^2-,so3^2-,br^-,cl^-,f^-,hso3^-,no2^-,s2o4^2-,s2o5^2-,scn^-,co3^2-,hco3^-的水溶液，在荧光分光光度仪上检测，绘制不同分析物对应的465nm处荧光强度柱状图(见图5)。硫化氢使得检测体系在465nm处荧光强度明显升高，其它的分析物基本没有引起检测体系荧光强度的变化。

实施例4

配制ph＝7.4、浓度为10mm的pbs缓冲溶液，并用dmso配制2mmcdp的溶液，配制20mm硫化氢水溶液；在8个比色皿中，各加入2ml的dmso/pbs(7:3v/v,ph7.4)溶液、2μlcdp的dmso溶液，分别加入硫化氢溶液的体积为0、4、8、12、16、20μl，3min后在荧光光谱仪上测定465nm处荧光强度为603.5、1581、2748、4030、5632、7173，以硫化氢浓度为横坐标，以荧光强度为纵坐标绘制图，得到硫化氢浓度的工作曲线；线性回归方程为：f-f0＝330.6143c-281.14，c的单位为10^-5mol/l。见图6。

实施例5

配制ph＝7.4、浓度为10mm的pbs缓冲溶液，并用dmso配制2mmcdp的溶液，配制20mm硫化氢水溶液；把2μlcdp的dmso溶液加入到2ml的dmso/pbs(7:3v/v,ph7.4)溶液的荧光比色皿中，取硫化氢的溶液10μl，用微量进样器加到此比色皿中，同时在荧光光谱仪上测定465nm荧光强度为3790，通过实施例4的线性回归方程，求得c＝10.219×10^-5mol/l。偏差为2.1％。见图7。

实施例6

配制ph＝7.4、浓度为10mm的pbs缓冲溶液，并用dmso配制2mmcdp的溶液，配制20mm硫化氢水溶液；把5μlcdp的dmso溶液加入到2ml的pbs中；将探针溶液加入hepg-2细胞培养液中，使得其浓度为5μm，与hepg-2细胞在37℃下，反应15min，体系在荧光成像仪下几乎没有荧光(图8b)；把5μlsnp(刺激内源性硫化氢)溶液加入到2ml的pbs中，将溶液加入hepg-2细胞培养液中，在37℃下孵育15min，再加入5μm的探针溶液，在37℃下孵育15min，体系在荧光成像仪下显示蓝色荧光(图8a)；将探针溶液加入hepg-2细胞培养液中，使得其浓度为5μm，与hepg-2细胞在37℃下，反应15min，再加入外源的硫化氢，使其浓度为分别为50μm，在37℃下，反应15min，体系在荧光成像仪下显示蓝色荧光(图8c)；将探针溶液加入hepg-2细胞培养液中，使得其浓度为5μm，与hepg-2细胞在37℃下，反应15min，再加入外源的硫化氢，使其浓度为分别为100μm，在37℃下，反应15min，体系在荧光成像仪下显示蓝色荧光(图8d)。