单核细胞增生李斯特菌三基因缺失减毒突变株制备及其应用的制作方法

本发明属于基因工程技术和免疫技术领域，具体涉及单核细胞增生李斯特菌三基因缺失减毒突变株制备及其应用。

背景技术：

单核细胞增生李斯特菌(listeriamonocytogenes,lm)是革兰染色阳性的兼性胞内寄生菌，作为一种食源性病原菌，能突破人体及动物的肠道屏障、血胎屏障和血脑屏障，引起脑膜炎、胃肠炎、败血症及流产等症状，死亡率高达20％-30％，是重要的人兽共患李斯特菌病的病原菌，也是感染后致死率最高的食源性病原菌。该菌对人类健康造成极大威胁，已引起世界各国的普遍关注和高度重视。

单核细胞增生李斯特菌不仅对畜牧业的发展造成一定影响，还能通过食物链感染人类，威胁到人类的健康，因此做好动物李斯特菌病的预防和控制，消除动物的感染和带菌，从源头上杜绝沿食物链传递感染人类，具有重要公共卫生意义，而疫苗免疫是预防传染病的最有效途径。由于该菌是兼性胞内寄生菌，可以逃逸宿主巨噬细胞的吞噬作用而进入细胞质中，主要介导细胞免疫,这就要求疫苗必须能有效地诱导细胞免疫应答，因此增加了疫苗创制的难度。虽然国际上已对预防李斯特菌病的疫苗进行了几十年的研究，至今尚未有用于临床的有效疫苗问世，无疑增加了李斯特菌病的防控难度。

技术实现要素：

鉴于以上现有技术的情况，本发明的目的在于提供一种单核细胞增生李斯特菌三基因缺失减毒突变株制备及其应用。

为了实现上述目的以及其他相关目的，本发明采用如下技术方案：

本发明的第一方面，提供一种单核细胞增生李斯特菌三基因缺失减毒突变株，为acta基因、plcb基因和orfx基因都不表达的单核细胞增生李斯特菌。

所述单核细胞增生李斯特菌三基因缺失减毒突变株listeriamonocytogenesntsnδacta/plcb/orfx为野毒型单核细胞增生李斯特菌(listeriamonocytogenes,lm)的突变菌株，所述listeriamonocytogenesntsnδacta/plcb/orfx已于2018年09月10日在中国典型培养物保藏中心保藏，保藏号为：cctccm2018606。

在一种实施方式中，所述单核细胞增生李斯特菌三基因缺失减毒突变株，为acta基因、plcb基因和orfx基因被敲除的单核细胞增生李斯特菌。

野毒型单核细胞增生李斯特菌为现有技术，具体信息为：accessionno.cp009897，只要将野毒型单核细胞增生李斯特菌中的acta基因、plcb基因和orfx基因进行敲除，使得acta基因、plcb基因和orfx基因都不表达，即可获得本发明所述单核细胞增生李斯特菌三基因敲除减毒突变株。

在野毒型单核细胞增生李斯特菌中，所述acta基因、plcb基因和orfx基因是相邻的基因。

在野毒型单核细胞增生李斯特菌中，acta的核苷酸序列如seqidno：1所示。

在野毒型单核细胞增生李斯特菌中，acta的氨基酸序列如seqidno：2所示。

在野毒型单核细胞增生李斯特菌中，plcb的核苷酸序列如seqidno：3所示。

在野毒型单核细胞增生李斯特菌中，plcb的氨基酸序列如seqidno：4所示。

在野毒型单核细胞增生李斯特菌中，orfx的核苷酸序列如seqidno：5所示。

在野毒型单核细胞增生李斯特菌中，orfx的氨基酸序列如seqidno：6所示。

在一种实施方式中，将野毒型单核细胞增生李斯特菌中的acta基因、plcb基因和orfx基因进行敲除，使得acta基因、plcb基因和orfx基因都不表达，即可获得本发明所述单核细胞增生李斯特菌三基因敲除减毒突变株。

在一种实施方式中，将野毒型单核细胞增生李斯特菌中的acta基因、plcb基因和orfx基因进行敲除时，acta基因、plcb基因完全敲除，orfx基因敲除1-254位核苷酸序列，获得本发明所述单核细胞增生李斯特菌三基因敲除减毒突变株。

本发明一实施例中，acta基因、plcb基因和orfx基因同时被敲除。被敲除的acta基因、plcb基因和orfx基因含有如seqidno：7所示的序列。

进一步地，所述减毒株还可经过其他基因改造。

所述的其他基因改造是指除acta基因、plcb基因和orfx基因三基因敲除以外的基因改造。所述其他基因改造可以是单个目标基因的改造或者为多个感兴趣目标基因的改造。感兴趣目标基因并不特指，可以根据研究需要设定并改造。例如，可以是一个、两个、三个以上目标基因的改造。理论上可以不断对其进行基因改造，对于目标基因的改造数量可以按照需要操作，没有特别限制。

基因改造具体是指通过生物或化学或物理的手段使基因相比改造前在结构上发生变化。这种变化主要是指碱基对组成的变化，包括但不限于一个或多个碱基对的替换、增添、缺失引起的改变。所述基因改造包括但不限于目标基因的敲入、目标基因的敲除等。目标基因的敲入、目标基因的敲除可以采用基因打靶、同源重组等技术来完成。

进一步地，本发明一实施例中，与野毒型单核细胞增生李斯特菌相比，所述单核细胞增生李斯特菌三基因敲除减毒突变株不引入新的序列。

进一步地，所述单核细胞增生李斯特菌三基因敲除减毒突变株不能表达肌动蛋白聚集因子acta、磷脂酶pc-plc和溶解双层膜活性的orfx。丧失胞内极向运动、裂解磷脂酶活性和溶解双层膜活性。

进一步的，所述单核细胞增生李斯特菌三基因敲除减毒突变株可采用血清型4b菌株为亲本株制备减毒疫苗。所述疫苗免疫易感宿主后，能免疫保护血清型4b强毒菌株的感染。

进一步的，所述单核细胞增生李斯特菌三基因敲除减毒突变株可基于血清型1/2b等其他野毒菌株为基础制备减毒疫苗。所述疫苗免疫易感宿主后，能免疫保护血清型1/2b等其他血清型强毒菌株的感染。

本发明的第二方面，提供了前述单核细胞增生李斯特菌三基因缺失减毒突变株的构建方法，包括步骤：将野毒型单核细胞增生李斯特菌中的acta基因、plcb基因和orfx基因敲除。

可以采用现有的基因编辑方法敲除所述acta基因、plcb基因和orfx基因。优选地，可采用同源重组的方法敲除acta基因、plcb基因和orfx基因。还可采用其他方法实现基因敲除，并不限于实施例所列举的方式。

基于acta基因的敲除，acta基因的完整序列或部分序列从染色体dna中去除；基于plcb基因的敲除，plcb基因的完整序列或部分序列从染色体dna中被去除；基于orfx基因的敲除，orfx基因的完整序列或部分序列从染色体dna中去除。

在一实施例中，基于acta基因的敲除，acta基因的完整序列从染色体dna中去除；基于plcb基因的敲除，plcb基因的完整序列从染色体dna中被去除；基于orfx基因的敲除，orfx基因的部分序列从染色体dna中去除。

进一步的，基于orfx基因的敲除，orfx基因的1-254位序列从染色体dna中去除。

在一实施例中，同时敲除acta基因、plcb基因和orfx基因。

本发明的第三方面，提供了前述单核细胞增生李斯特菌三基因缺失减毒突变株在制备单核细胞增生李斯特菌活疫苗中的用途。

本发明的第四方面，提供了一种单核细胞增生李斯特菌活疫苗，含有前述单核细胞增生李斯特菌三基因缺失减毒突变株。

进一步的，所述单核细胞增生李斯特菌活疫苗中还含有佐剂。

所述单核细胞增生李斯特菌活疫苗包含疫苗载体，所述载体用于运送同源或异源抗原的增生李斯特菌三基因缺失减毒突变株。所述异源抗原包括多种肿瘤抗原、多种传染性病原的抗原。

本发明的第五方面，提供了acta基因、plcb基因和orfx基因共同作为靶基因在筛选单核细胞增生李斯特菌感染治疗药物中的用途。

本发明所述单核细胞增生李斯特菌感染治疗药物为以acta基因、plcb基因和orfx基因为治疗靶基因，使acta基因、plcb基因和orfx基因敲除、不表达的药物或者以acta基因、plcb基因和orfx基因表达的蛋白为拮抗对象的药物；或者以acta基因、plcb基因和orfx基因和其他基因共同作为靶基因加以沉默的药物。以acta基因、plcb基因和orfx基因为靶点，筛选使这三个基因不表达的药物，用于使单核细胞增生李斯特菌毒性减弱，以治疗单核细胞增生李斯特菌感染。例如，该单核细胞增生李斯特菌感染治疗药物可以通过rna干扰或者基因重组的方法使acta基因、plcb基因和orfx基因敲除或不表达；或者通过制备acta蛋白拮抗剂、plcb蛋白拮抗剂和orfx蛋白拮抗剂，使acta基因、plcb基因和orfx基因表达的蛋白不发挥作用。

本发明的第六方面，提供一种pcr检测试剂盒，所述pcr检测试剂盒用于鉴定前述单核细胞增生李斯特菌三基因缺失减毒突变株/野毒单核细胞增生李斯特菌，所述试剂盒中包括acta基因检测引物和/或plcb基因检测引物。

所述acta基因检测引物为能够扩增acta基因中部分片段或全长序列的引物。

所述plcb基因检测引物为能够扩增plcb基因中部分片段或全长序列的引物。

进一步的，所述acta基因检测引物包括核苷酸序列如seqidno.8所示的正向引物和核苷酸序列如seqidno.9所示的反向引物。所述plcb基因检测引物包括核苷酸序列如seqidno.10所示的正向引物和核苷酸序列如seqidno.11所示的反向引物。

acta基因正向引物：5’-agcggatgagtctacaccacaa-3’(seqidno.8)；

acta基因反向引物：5’-gattactggtaggctcggcata-3’(seqidno.9)。

plcb基因正向引物：5’-gataatccgacaaatactgacg-3’(seqidno.10)；

plcb基因反向引物：5’-ttcatagagccattctttcacg-3’(seqidno.11)。

本发明的试剂盒采用pcr检测技术进行acta基因和/或plcb基因检测，根据扩增及检测情况可分析判断检测对象是否属于前述单核细胞增生李斯特菌三基因缺失减毒突变株/野毒单核细胞增生李斯特菌。因此，引物的设计是本发明试剂盒的关键。

基于本发明所述试剂盒是采用pcr技术来进行检测的，所以试剂盒中还可以包括其他一些pcr所需要的常规试剂，如：无菌水(ddh2o)、dntp、pcrbuffer、rtaq酶、样品基因组dna提取试剂等常用pcr反应试剂中的一种或多种。由于此类pcr常用试剂均可经市场途径单独购得或者自行配置，因此具体需要将哪些试剂装配入试剂盒，可以根据客户实际需要配置，为方便起见，也可全部装配入试剂盒。

本发明的试剂盒，可以是含有独立包装的引物对，也可以是含有配置好的含有引物对的pcr检测液。

所述pcr检测液可自行配置，也可直接以市售的不含引物的通用pcr检测液加入引物获得。例如，所述试剂盒中还可以含有无菌水(ddh2o)、dntp、pcrbuffer、rtaq酶。加入本发明的引物、待检样本dna提取物或者样本菌液即可获得pcr反应体系。

优选地，所述试剂盒中还可含有阳性对照。所述阳性对照为含有单核细胞增生李斯特菌acta基因和/或plcb基因表达的dna样本。

优选地，所述试剂盒中还可含有阴性对照。阴性对照可为不含有单核细胞增生李斯特菌acta基因和/或plcb基因表达的dna样本。

本发明的第七方面，提供前述试剂盒的使用方法，包括如下步骤：

(1)提取样品基因组dna；

(2)加样：将样品基因组dna、阳性对照或阴性对照分别加入装有pcr反应体系的pcr管中，获得对应的样品反应管、阳性反应管或阴性反应管，所述pcr反应体系中含有前述acta基因和/或plcb基因检测引物；

(3)pcr反应：反应管置于pcr仪上，设置循环参数，进行pcr反应；

(4)pcr反应结束后，分析结果。

优选地，所述方法为非疾病诊断目的的方法。

步骤(1)中，提取样品基因组dna为现有技术。

优选地，步骤(3)中，pcr反应的条件设置为：94℃5min，94℃30s，60℃35s，72℃5min，30个循环。

本发明的第八方面，提供了前述试剂盒在制备acta基因和/或plcb基因检测产品中的用途。

优选地，所述检测产品用于检测和筛选单核细胞增生李斯特菌三基因缺失减毒突变株/野毒单核细胞增生李斯特菌。

本发明的第九方面，提供plcb蛋白和llo蛋白在制备elisa诊断试剂盒中的用途，所述试剂盒用于鉴定单核细胞增生李斯特菌三基缺失减毒突变株免疫或野毒单核细胞增生李斯特菌感染。

在一实施例中，所述elisa诊断试剂盒至少包括：elisa反应板，所述elisa反应板上分别包被有plcb蛋白和llo蛋白。

所述plcb蛋白的氨基酸序列如seqidno：4所示。

所述llo蛋白的氨基酸序列如seqidno：12所示。

与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：

本发明旨研制了一种单核细胞增生李斯特菌三基因缺失减毒突变株，所述突变株毒力显著降低(比野毒型降低了至少794倍)，同时具有激发较好的免疫保护作用。本发明所述的试剂盒，具有操作简单，检测时间短，特异性强，准确度高，灵敏度高，并且能够准确区分单核细胞增生李斯特菌三基因缺失减毒突变株和野毒单核细胞增生李斯特菌。

本发明菌株保藏信息如下：

菌株名称：listeriamonocytogenesntsnδacta/plcb/orfx

保藏号为：cctccm2018606；

保藏日期：2018年09月10日；

保藏单位名称：中国典型培养物保藏中心；

保藏单位简称：cctcc；

保藏单位地址：武汉市武昌珞珈山街道武汉大学生命科学学院。

附图说明

图1：本发明的pcr扩增内外侧引物试验结果图

(m：dl50001：sw-ntsnδacta/plcb/orfx2：sw-ntsn3：sw-ntsnδacta/plcb/orfx

4：sw-ntsnδacta/plcb/orfx5：sw-ntsnδacta/plcb/orfx

6：sn-ntsn7:sn-ntsnδacta/plcb/orfx8:sn-ntsnδacta/plcb/orfx

9:sn-ntsnδacta/plcb/orfx10:sn-ntsnδacta/plcb/orfx)。

图2a：本发明的pcr方法鉴别ntsnacta/plcb/orfx和野毒型李斯特菌结果图

(m：dl20001：ntsnacta/plcb/orfx-acta2：ntsnδacta/plcb/orfx-acta

3：ntsnδacta/plcb/orfx-acta4：ntsn-acta5：ntsn-acta)。

图2b：本发明的pcr方法鉴别ntsnacta/plcb/orfx和野毒型李斯特菌结果图

(m：dl20001：ntsnacta/plcb/orfx-plcb2：ntsnδacta/plcb/orfx-plcb

3：ntsnδacta/plcb/orfx-plcb4：ntsn-plcb5：ntsn-plcb)。

图3：本发明的ntsnδacta/plcb/orfx对靶动物绵羊免疫保护作用的测定结果图。

图4：本发明的lm在yac培养基上的磷脂酶活性测定结果图。

图5a：本发明的ntsnδacta/plcb/orfx免疫绵羊后，采用间接elisa方法区分野毒毒株感染结果图。

(间接elisa方法检测抗plcb血清抗体，****表示为极显著差异)

图5b：本发明的ntsnδacta/plcb/orfx免疫绵羊后，采用间接elisa方法检测诱导绵羊产生的免疫应答结果图。

(间接elisa方法检测抗llo血清抗体，ns表示无显著性差异)

具体实施方式

由于单核细胞增生李斯特菌是兼性胞内寄生菌，在预防和控制该菌感染的过程中，机体的细胞免疫应答起着决定性的作用，因此要求疫苗必须具有较好地诱导细胞免疫应答的特性，而减毒活疫苗则在诱导细胞免疫应答方面具有较好潜力的疫苗类型重要的内容。另一方面，由于单核细胞增生李斯特菌是胞内寄生菌，能溶解宿主细胞吞噬泡膜，在胞浆中生长繁殖，并可侵袭多种非吞噬细胞，这使它具有诱导cd8⁺t细胞介导的保护性免疫应答的能力，单核细胞增生李斯特菌所具有的独特免疫应答机制使它成为一种非常具有吸引力的运送来自肿瘤和传染性病原体的外源抗原的疫苗载体。

单核细胞增生李斯特菌种由13个血清型构成，引起临床李斯特菌病暴发的主要血清型为4b，其次为1/2b，因此研制抗血清型4b和1/2b型菌株感染的疫苗显得尤为必要。血清型致病性与其携带的毒力基因密切相关，因此通过毒力基因缺失的方法可使其毒力降低。已有的研究报道主要针对血清型1/2a的菌株开展的研究，科研者已开展了与减毒相关的研究工作,如lm△dal/dat、lm△acta、lm△hly、lm△plcb、lm△plca、lm△inla、lm△inlb、lm△inlab等。目前尚未有对acta、plcb和orfx基因同时敲除的研究报道。

单核细胞增生李斯特菌的致病性与其多个毒力基因密切相关，它们参与了粘附、入侵、胞内繁殖及细胞间的扩散和传播。其中，hly基因编码的llo是该菌的重要毒力因子，可促使细菌从细胞内的吞噬小体中释放，进入细胞质得以扩散。acta，plcb基因和orfx基因的编码产物acta和pc-plc是与lm致病性相关的主要毒力因子，acta编码的表面蛋白acta在该菌胞内运动中起着重要作用，能产生一种使肌动蛋白聚合的因子，诱导单核细胞增生李斯特菌一极的肌动蛋白的聚合，以促进其在宿主细胞内的极向运动。基因plcb编码广谱磷脂酶c(pc-plc)，在吞噬泡双层膜溶解中起作用。orfx与溶解双层膜密切相关。本研究通过同源重组的方法将单核细胞增生李斯特菌基因组中的上述三个基因进行了无痕敲除，使其丧失表达acta、pc-plc和orfx的基础上，具有良好的安全性和免疫保护特性。llo、plcb和acta是重要的毒力因子，同时具有保护性抗原的特性，野毒菌株在感染的过程中宿主能针对这些抗原产生特异性抗体。因此，通过测定野毒株和减毒缺失株中均能表达的llo的抗体，以及只有野毒株诱导宿主产生的抗plcb抗体，可以精确的区分疫苗免疫和野毒强毒株感染。

所述单核细胞增生李斯特菌三基因缺失减毒突变株listeriamonocytogenesntsnδacta/plcb/orfx为野毒型单核细胞增生李斯特菌(listeriamonocytogenes,lm)的突变菌株，所述listeriamonocytogenesntsnδacta/plcb/orfx已于2018年09月10日在中国典型培养物保藏中心保藏，保藏号为：cctccm2018606。

在进一步描述本发明具体实施方式之前，应理解，本发明的保护范围不局限于下述特定的具体实施方案；还应当理解，本发明实施例中使用的术语是为了描述特定的具体实施方案，而不是为了限制本发明的保护范围。下列实施例中未注明具体条件的试验方法，通常按照常规条件，或者按照各制造商所建议的条件。

当实施例给出数值范围时，应理解，除非本发明另有说明，每个数值范围的两个端点以及两个端点之间任何一个数值均可选用。除非另外定义，本发明中使用的所有技术和科学术语与本技术领域技术人员通常理解的意义相同。除实施例中使用的具体方法、设备、材料外，根据本技术领域的技术人员对现有技术的掌握及本发明的记载，还可以使用与本发明实施例中所述的方法、设备、材料相似或等同的现有技术的任何方法、设备和材料来实现本发明。

除非另外说明，本发明中所公开的实验方法、检测方法、制备方法均采用本技术领域常规的分子生物学、生物化学、染色质结构和分析、分析化学、细胞培养、重组dna技术及相关领域的常规技术

bhi培养基(bactotmbrainheartinfusion)购买自bd公司；高保真taq酶、限制性内切酶sali、ecori和高保真酶购自takara公司；羊抗鼠igg购自sigma公司；6周龄balb/c小鼠由扬州大学比较医学中心提供。

本发明中，ntsnδacta/plcb/orfx与listeriamonocytogenesntsnδacta/plcb/orfx指代相同内容，均指代本发明所述的单核细胞增生李斯特菌三基因缺失减毒突变株。

实施例1单核细胞增生李斯特菌三基因缺失减毒突变株(ntsnδacta/plcb/orfx)的构建

1.单核细胞增生李斯特菌敲除相邻3个基因acta、plcb、orfx所用上游同源片段的扩增试剂盒提取血清型4b的单核细胞增生李斯特菌ntsn基因组，设计引物如下：

正义：

5’-acgacgttgtaaaacgacggccagtttagaatacgaagggcaatcag-3’(seqidno：13)

反义：

5’-cgctcgtgttcattcaaaattcttatactccctcctcgtgat-3’(seqidno：14)

正义引物含paula载体同源片段(下划线标出)。pcr反应体系为50μl:

ntsn：1μl

10×缓冲液：10μl

上游引物(100μmol/l)：2μl

下游引物(100μmol/l)：2μl

taq酶(3u/μl)：1μl

4种dntp混合物(2.5mmol/l):1μl

超纯水：33μl

pcr反应条件为：94℃预变性5min；94℃变性30s，60℃退火35s，72℃延伸5min，

30个循环，结束后用浓度为1％的琼脂糖电泳分离，回收长为649bp的基因同源片段。2.单核细胞增生李斯特菌敲除相邻3个基因acta、plcb、orfx基因所用下游同源片段的扩

增

试剂盒提取单核细胞增生李斯特菌ntsn基因组，采用引物如下：

正义：

5’-atcacgaggagggagtataagaattttgaatgaacacgagcg-3’(seqidno：

15)

反义：

5’-ttacgccaagcttgcatgcctgcagatcaccgtttgaagacataccagg-g3’

(seqidno：16)

正义引物含paula载体同源片段(下划线标出)。pcr反应体系为50μl:

ntsn：1μl

10×缓冲液：10μl

上游引物(100μmol/l)：2μl

下游引物(100μmol/l)：2μl

taq酶(3u/μl)：1μl

4种dntp混合物(2.5mmol/l):1μl

超纯水：33μl

pcr反应条件为：94℃预变性5min；94℃变性30s，67℃退火35s，72℃延伸5min，

30个循环，结束后用浓度为1％的琼脂糖电泳分离，回收长为611bp的基因同源片段。

3.ecori和sali双酶切paula质粒

pcr反应体系为50μl:

paula质粒：5μl

10×缓冲液：2μl

ecori酶：0.5μl

sali酶：0.5μl

超纯水：12μl

37℃酶切3h，结束后用浓度为1％的琼脂糖电泳分离，回收长为9086bp的paula质粒。

4.重组质粒paula-acta-u/orfx-d的构建

将acta，orfx基因同源片段acta-u和orfx-d与载体进行连接反应，体系如下：

acta基因同源片段：1μl(seqidno：17)

orfx基因同源片段：1μl(seqidno：18)

paula(ecori-sali)：3μl

5×ceiibuffer：4μl

exnasetmii：2μl

体系配制完成后，用移液器上下轻轻吹打几次混匀各组分，避免产生气泡。置于37℃反应30min。待反应完成后，立即将反应管置于冰水浴中冷却5min。

获得质粒用ecori和sali进行双酶切，0.8％琼脂糖电泳观察到长约2200bp的目的条带，然后将重组质粒插入的序列进行测序，以验证构建的正确性。

5.穿梭载体paula-acta-u/orfx-d的构建

将重组质粒paula-acta-u/orfx-d热击法转化至e.colidh5α宿主菌中，取20μl冷却反应液，加入到200μl感受态细胞中，在冰上放置30min。42℃热激45秒，冰水浴孵育2min。加入900μlsoc或lb培养基，37℃金属浴孵育10min充分复苏。37℃摇菌2h后，将菌液均匀涂布在含有红霉素的lb平板上，于37℃过夜培养。提取质粒进行pcr鉴定，验证正确。将初步鉴定为阳性的克隆穿梭载体paula-acta-u/orfx-d送到南京金斯瑞生物科技有限公司测序，测序结果通过mega5软件进行比对分析，选取比对结果正确的阳性克隆菌进行保存，并作为下一步构建的实验材料。

6.突变菌ntsnδacta/plcb/orfx的构建

取10μl穿梭载体paula-acta-u/orfx-d以电穿孔法转化野毒型单核细胞增生李斯特菌ntsn。将阳性克隆接种含有5μg/ml红霉素的bhi固体培养基中在42℃培养箱培养24小时后，取单菌落转接至同样的培养基中在同样的条件下培养，转接8代，使同源片段acta-u/orfx-d与染色体上的acta-u//acta/plcb/orfx/orfx-d基因进行同源重组；再转接至bhi固体培养基中转接8代后，促使lm中的质粒脱掉，将菌液稀释后涂布到bhi平板上，将长出的菌落进行对应，接种至加有终浓度为5μg/ml红霉素的bhi平板上，凡在该平板上不长的菌落，进行pcr鉴定，将阳性克隆命名为ntsnδacta/plcb/orfx。所述ntsnδacta/plcb/orfx已于2018年09月10日在中国典型培养物保藏中心保藏，保藏号为：cctccm2018606。

pcr鉴定所用引物及pcr条件如下：

外侧鉴定正义引物sw-f:5’-gtgtccttaactctctctgtca-3’(seqidno：19)

外侧鉴定反义引物sw-r:5’-acaagccttagaaaaccccaat-3’(seqidno：20)

pcr反应体系为25μl:

10×缓冲液：2.5μl

外侧鉴定正义引物sw-f(100μmol/l)：0.5μl

外侧鉴定反义引物sw-r(100μmol/l)：0.5μl

taq酶(3u/μl)：0.25μl

4种dntp混合物(2.5mmol/l):2μl

基因组dna：2μl

超纯水：17.25μl

pcr反应条件为：94℃预变性5min；94℃变性50s，60℃退火4min，72℃延伸5min，30个循环；72℃10min。扩增后进行电泳。

内侧鉴定正义引物sn-f：5’-gtcagcggatgagtctacaccacaa-3’(seqidno：21)

内侧鉴定反义引物sn-r：5’-tttggattactggtaggctcggcat-3’(seqidno：22)

pcr反应体系为25μl:

10×缓冲液：2.5μl

内侧鉴定正义引物sn-f(100μmol/l)：0.5μl

内侧鉴定反义引物sn-r(100μmol/l)：0.5μl

taq酶(3u/μl)：0.25μl

4种dntp混合物(2.5mmol/l):2μl

基因组dna：2μl

超纯水：17.25μl

pcr反应条件为：94℃预变性5min；94℃变性50s，60℃退火4min，72℃延伸5min，30个循环；72℃10min。扩增后进行电泳。

7.结果

外侧，内侧引物分别扩增野毒株和突变株。外侧引物扩增出野毒株片段大小为3588bp，突变株片段大小为2353bp；内侧引物扩增出野毒株片段大小为1073bp，突变株扩增不出片段，表明成功地敲除了三个相邻的毒力基因acta、plcb和orfx。结果如图1所示。

实施例2ntsnδacta/plcb/orfxld50的测定

将野毒型菌株ntsn及传代至15代的突变菌株挑单菌落接种于bhi液体培养基，37℃摇振培养12h，把培养物离心并用pbs洗两次，沉淀用pbs悬浮后测定od600并调整od600使其达到0.80，将李斯特菌悬液进行梯度稀释，做平板菌落计数，取适宜稀释度的菌液进行动物实验，不同实验组腹腔注射所用剂量呈5倍递减。每一稀释度稀释菌液腹腔注射5只6周龄balb/c小鼠，150μl/只，连续观察14天，记录接种后小鼠死亡情况，结果见下表1。由以上实例表明：发明人成功地构建了缺失acta,plcb和orfx基因的单核细胞增生李斯特菌减毒株ntsnδacta/plcb/orfx，毒力比野毒型菌株显著降低794倍。

表1ntsnδacta/plcb/orfxld50的测定

实施例3ntsnδacta/plcb/orfx对balb/c小鼠免疫保护作用的测定

按照实施例2中方法制备细菌，皮下免疫2组6-8周龄雌性balb/c小鼠，2×10⁶cfu/只，每组6只，同时设定2组pbs磷酸缓冲液免疫阴性对照组(100μl/只)。第一次免疫两周后进行第二次免疫，二免14天后分别用血清型为4b的野毒株ntsn(7x10⁵cfu/只)和血清型为1/2b的菌株yc3-2(2.5x10⁶cfu/只)攻毒。结果如表2所示，ntsnδacta/plcb/orfx能对上述两种血清型的野毒菌株的攻击提供100％的免疫保护，而pbs对照组小鼠不能对野毒菌株的攻击提供免疫保护。

表2ntsnδacta/plcb/orfx对小鼠的免疫保护效力

实施例4、ntsnδacta/plcb/orfx对靶动物绵羊免疫保护作用的测定结果

按照实施例2中方法制备细菌，皮下免疫羊ntsnδacta/plcb/orfx，1×10⁹cfu/只，共免疫8只，同时设定pbs磷酸缓冲液(1ml/只)免疫阴性对照组。第一次免疫两周后进行第二次免疫，二免14天后用野毒株ntsn攻毒，4×10¹⁰cfu/只。结果如图4所示，免疫组ntsnδacta/plcb/orfx保护效力为87.5％。

实施例5pcr方法鉴别ntsnδacta/plcb/orfx和野毒型李斯特菌

设计毒力基因acta的引物分别扩增野毒株和突变株ntsnδacta/plcb/orfx。野毒株能够扩增出acta，片段大小为810bp；突变株ntsnδacta/plcb/orfx不能够扩增出acta。

设计引物如下：

acta基因正向引物：

5’-agcggatgagtctacaccacaa-3’(seqidno.8)

acta基因反向引物：

5’-gattactggtaggctcggcata-3’(seqidno.9)

pcr反应体系为25μl：

ntsn：1μl

mix酶：12.5μl

acta基因正向引物：：(100μmol/l)：1μl

acta基因反向引物：(100μmol/l)：1μl

超纯水：9.5μl

pcr反应条件为：94℃5min，94℃30s，60℃35s，72℃5min，30个循环，结束后用浓度为1％的琼脂糖电泳分离长为810bp的acta基因同源片段。

设计毒力基因plcb的引物分别扩增野毒株和突变株ntsnδacta/plcb/orfx。野毒株能够扩增出plcb，片段大小为504bp；突变株ntsnδacta/plcb/orfx不能够扩增出plcb。

设计引物如下：

plcb基因正向引物：

5’-gataatccgacaaatactgacg-3’

plcb基因反向引物：

5’-ttcatagagccattctttcacg-3’

pcr反应体系为25μl：

ntsn：1μl

mix酶：12.5μl

plcb基因正向引物：(100μmol/l)：1μl

plcb基因反向引物：(100μmol/l)：1μl

超纯水：9.5μl

pcr反应条件为：94℃5min，94℃30s，60℃35s，72℃5min，30个循环，结束后用浓度为1％的琼脂糖电泳分离长为810bp的plcb基因同源片段。

电泳结果显示，野毒株能够扩增出acta和plcb基因，片段大小分别为810bp(图2a)和504bp(图2b)。突变株不能够扩增出acta和plcb基因(图2a和图2b)。

实施例6、磷脂酶活性试验鉴别ntsnδacta/plcb/orfx和野毒型李斯特菌

生物活性鉴定：pc-plc具有水解磷脂产生一系列水溶性脂肪酸的生物活性，而卵黄中富含磷脂，因此卵黄琼脂法成为一种定性鉴定pc-plc生物活性的简便方法。配制卵黄琼脂炭粉(yac)培养基：于100mlbhi固体培养基中加入0.5克活性炭粉，调ph值至6.5后高压灭菌，待冷却至45℃，李斯特菌在yac培养基表面划线接种，置于37℃培养。在yac培养基上培养约24小时后，接种在平板上的野毒型菌株周围出现透明圈。而ntsnδacta/plcb/orfx周围始终未出现此现象，如图4所示。由此表明ntsnδacta/plcb/orfx不具有磷脂酶生物活性，从蛋白水平上用于区分ntsnδacta/plcb/orfx和野毒型李斯特菌。

实施例7间接elisa方法鉴别ntsnδacta/plcb/orfx和野毒型李斯特菌

将ntsn和ntsnδacta/plcb/orfx以相同的剂量分别皮下注射体重约为10公斤的绵羊，同时设pbs注射的对照组，分别于7天、14天和21天采集血样并制备血清。利用间接elisa方法检测抗plcb的血清抗体和抗llo的血清抗体，将plcb蛋白1.12μg/孔包板，血清从1：400开始做倍比稀释，同时设空白对照，opd显色。测定结果显示，从血清抗体进行1:400稀释到1:6400稀释，ntsnδacta/plcb/orfx接种组的抗体水平均极显著低于ntsn感染组(图5a)。将llo蛋白0.64ug/孔包板，血清从1:400开始倍比稀释，同时设空白对照，opd显色。测定结果显示，从血清抗体进行1:400稀释到1:6400稀释，ntsnδacta/plcb/orfx接种组的抗体水平与ntsn感染组的抗体水平没有显著性差异，表明检测plcb抗体和llo抗体的间接elisa方法可用于区分本发明的ntsnδacta/plcb/orfx疫苗免疫与野毒菌株的自然感染(图5b)。

以上的实施例是为了说明本发明公开的实施方案，并不能理解为对本发明的限制。此外，本文所列出的各种修改以及发明中方法、组合物的变化，在不脱离本发明的范围和精神的前提下对本领域内的技术人员来说是显而易见的。虽然已结合本发明的多种具体优选实施例对本发明进行了具体的描述，但应当理解，本发明不应仅限于这些具体实施例。事实上，各种如上所述的对本领域内的技术人员来说显而易见的修改来获取发明都应包括在本发明的范围内。

序列表

<110>扬州大学

<120>单核细胞增生李斯特菌三基因缺失减毒突变株制备及其应用

<160>22

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>1920

<212>dna

<213>listeriamonocytogenes

<400>1

gtgggattaaatagatttatgcgtgcgatgatggtagttttcattaccgccaactgcatt60

acgattaaccccgacataatatttgcagcgacagatagcgaagattccagtctgaacaca120

gatgaatgggaagaagaaaaaacagaagagcagccaagcgaggtaaatacgggaccaaga180

tacgaaactgcacgtgaagtaagttcacgtgatattgaggaactagaaaaatcgaataaa240

gtgaaaaatacgaacaaagcagacctaatagcaatgttgaaagcaaaagcagaaaaaggt300

ccaaatattaataataacaacagtgaacaaagcgagaatgtggctataaatgaagaagct360

tcaggatccgcccgaccagctatacaagtggagcgtcgtcatccagggttgccatcggat420

agcgccgcggaaattaaaaaaagaaggaaagctatagcatcatcggatagtgagcttgaa480

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gttacggatacttctgaaagtgacttagattctagcatgcagtcagcggatgagtctaca600

ccacaacctttaaaagcaaatcaacaaccatttttccctaaagtatttaaaaaaataaaa660

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ccaccaccacctacggatgaagagttaagacttgctttgccagagacgccaatgcttctt960

ggttttaatgctcctgctacatcggaaccgagctcattcgaatttccaccgcctccaaca1020

gaagatgaactagaaattatgcgggaaacagcaccttcgctagattctagttttacaagc1080

ggggatttagctagtttgagaagtgctattaatcgccatagccaaaatttctctgatttt1140

ccaccaatcccaacagaagaagagttgaacgggagaggcggtataccaacatctgaagaa1200

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ccaattgatatgccgagcctaccagtaatccaaaaagaagttacagaaagaaataaagag1680

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attggcgtgttctctttaggagcggttatcaaaatcattcaattaagaaaaaatagttga1920

<210>2

<211>639

<212>prt

<213>listeriamonocytogenes

<400>2

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151015

alaasncysilethrileasnproaspileilephealaalathrasp

202530

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354045

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505560

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65707580

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859095

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100105110

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115120125

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130135140

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145150155160

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165170175

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180185190

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195200205

glnprophepheprolysvalphelyslysilelysaspalaglylys

210215220

trpvalargasplysileaspgluasnprogluvallyslysalaile

225230235240

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245250255

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260265270

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275280285

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290295300

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305310315320

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325330335

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340345350

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355360365

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370375380

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385390395400

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405410415

thrthrgluglugluileaspargleualaaspleuargasparggly

420425430

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435440445

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450455460

alaproalaleuilethraspilethrlyslysalaprophelysasn

465470475480

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485490495

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500505510

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515520525

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530535540

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545550555560

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565570575

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<210>3

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<212>dna

<213>listeriamonocytogenes

<400>3

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ttttataaattgggcctagcaatccattattatacggatattagtcaacctatgcacgcc540

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<213>listeriamonocytogenes

<400>4

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<210>6

<211>107

<212>prt

<213>listeriamonocytogenes

<400>6

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151015

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202530

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354045

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<213>人工序列(artificialsequence)

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