一株耐酸产乙偶姻的解淀粉芽孢杆菌及其应用的制作方法

本发明属于微生物
技术领域：
，涉及解淀粉芽孢杆菌及其在促进作物生长和防止植物病害中的应用。
背景技术：
：目前在农业生产内部，由于化肥等农业投入品长期不合理使用，不仅造成农田土壤酸化、板结、次生盐渍化等问题，还破坏了土壤根际微生物群落结构，使许多有益微生物从优势菌群变为次要菌群。我国土壤酸化呈现面积大、分布广、酸化程度高及危害大等特点，其中酸化土壤的总面积高达2.04×108hm2，约占全国土壤面积的22.7％(于天一等，2014)。近几十年来由于高强度人为活动的影响，土壤酸化的进程大大加速，对生态环境和农业生产的危害加重，在热带和亚热带地区情况尤为严重。因此，采取有效措施减缓土壤酸化进程并对严重酸化土壤进行改良和修复，对保护生态环境和保障农业的可持续发展具有重要意义(徐仁扣，2015)。番茄是我国设施蔬菜栽培面积最大的作物之一，其风味独特、营养丰富，深受消费者喜爱。然而，为了提高番茄的产量，番茄在肥料使用上过量施用化肥，造成番茄果实品质不高，农田土壤板结、酸化等问题，因此，如何提高番茄等经济作物的耐酸能力不仅是改良利用酸化土地的重要方法，也是扩大番茄等作物种植范围提高产量的根本途径。植物根际促生菌是指定殖植物根部并能够促进植物生长或抑制植物病害的细菌被称为促进植物生长的根际细菌(pgpr)，现在已经从水稻、小麦、玉米、花生等多种作物的根际分离得到了大量的prpg菌株，并被广泛用于微生物肥料和微生物菌剂的领域。植物根际促生菌的出现为番茄绿色增产提供了一个新的思路。其中解淀粉芽孢杆菌是一种优良的促生菌，其不仅能促进植物生长，还能有效地防止植物病害的发生，例如，它通过产生抗生素、抗菌蛋白或多肽等活性物质来抑制植物病原细菌、真菌、病毒、线虫的生长；通过溶磷、解钾、分泌吲哚乙酸(iaa)、赤霉素(gas)等来促进植物生长。但是，很少有人提及菌株产生挥发性化合物能促进作物生长并能抑制植物病原菌的生长，而挥发性物质可以在不接触根系的情况下发挥作用。如果能获得具备一般芽孢杆菌促生特征并且产生一定量挥发性物质的菌株，将有效扩大微生物肥料和微生物菌剂施用时距离根系的范围，具有高效、安全、施用方便的优点。专利cn200810088388.x公开了一种包含芽孢杆菌属和沙雷氏菌属复合生防菌剂ar156，其能防治多种蔬菜土传病害，并具有促生作用。专利cn201010518034.1公开了一株解淀粉芽孢杆菌lx-11菌株，保藏编号为cgmccno.3789，对水稻细菌性条斑病有良好的防治效果。专利cn200910058487.8公开了一种防治作物土传病害的木霉菌制剂，并且其能显著增加烟草的产量，但是以上专利均未提及菌株分泌的挥发性物质对植物的促生作用，也未提及在酸性土壤中对番茄等作物的促生作用。技术实现要素：本发明所要解决的技术问题是提供一种耐酸产乙偶姻的解淀粉芽孢杆菌，该菌株具有优异的在酸化土壤中促进番茄等植物生长的能力，促进番茄在强酸土壤中生长。本发明还要解决的技术问题是提供上述耐酸产乙偶姻的解淀粉芽孢杆菌的应用。为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案如下：一株耐酸产乙偶姻的解淀粉芽孢杆菌，其分类命名为解淀粉芽孢杆菌(bacillusamyloliquefaciens)，菌株号为nrcb005，已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，其保藏编号为cgmccno.17214，保藏日期为2019年1月18日。保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，邮政编码100101。本发明的解淀粉芽孢杆菌nrcb005是本发明人于2018年8月从江苏省宜兴市大铺镇水稻根际土中分离得到，通过16srdna序列分析，经ncbi中blast比对后与解淀粉芽孢杆菌同源较高，相似度为100％，再根据其外形以及生理生化特性，初步鉴定菌株nrcb005为解淀粉芽孢杆菌(bacillusamyloliquefaciens)。所述菌株解淀粉芽孢杆菌nrcb005是乙偶姻分泌菌株，所述的解淀粉芽孢杆菌nrcb005是耐酸芽孢杆菌，其耐酸度为ph7～ph3.5，所述的解淀粉芽孢杆菌nrcb005菌落呈圆形，不透明，罕见半透明，淡黄色白色和凸起，边缘不规则，易挑起。该菌能够生成吲哚乙酸、溶解无机磷、溶解不溶性钾，这与大多数芽孢杆菌相同。此外，该菌还可以生成挥发性气体乙偶姻，在菌体不接触作物根系的时候发挥作用，有效扩大微生物肥料和微生物菌剂施用时距离根系的范围，具有高效、安全、施用方便的优点。本发明菌株的其他特征将在后面的具体实施部分予以详细说明。其中，所述的解淀粉芽孢杆菌具有较好的耐酸特性，在液体培养基中，其能在ph7～ph3.5的环境中正常生长。其中，所述的解淀粉芽孢杆菌在ph7.0～ph4.2(优选ph6.0～ph4.2)的酸化土壤中正常生长。上述耐酸产乙偶姻的解淀粉芽孢杆菌在发酵生产乙偶姻中的应用也在本发明的保护范围之内。上述耐酸产乙偶姻的解淀粉芽孢杆菌在酸化土壤中促进植物生长中的应用也在本发明的保护范围之内。其中，所述的植物优选为番茄。其中，所述的酸化土壤是指ph7.0～ph4.2(优选ph6.0～ph4.2)的土壤。上述耐酸产乙偶姻的解淀粉芽孢杆菌在抑制尖孢镰刀病原菌、玉米大斑病原菌或甜瓜枯萎病原菌中的应用也在本发明的保护范围之内。有益效果：本发明提供的解淀粉芽孢杆菌nrcb005能显著提高番茄等作物的耐酸能力，在未酸化土壤和酸化土壤中，接种解淀粉芽孢杆菌nrcb005番茄的鲜重分别较空白增加52％和45％。本发明的解淀粉芽孢杆菌株nrcb005通过纯培养试验、实验室平板试验和温室盆栽实验证明其能够产生挥发性有机气体乙偶姻，能有效抑制尖孢镰刀病原菌、玉米大斑病原菌、甜瓜枯萎病原菌，从而促进番茄的生长，具有良好的应用前景。附图说明图1为解淀粉芽孢杆菌nrcb005在固氮培养基上的菌落形态。图2为nrcb005乙偶姻色谱检测结果，其中，a是3g/l乙偶姻标样，b为1/30的酸度为ph7的48h发酵液。图3为实施例4中解淀粉芽孢杆菌nrcb005对尖孢镰刀病原菌的拮抗作用图4为实施例4中解淀粉芽孢杆菌nrcb005对玉米大斑病原菌的拮抗作用。图5为实施例4中解淀粉芽孢杆菌nrcb005对甜瓜枯萎病原菌的拮抗作用。图6为实施例11中解淀粉芽孢杆菌nrcb005在酸化土壤中盆栽促生效果图。图7为实施例11中解淀粉芽孢杆菌nrcb005在未酸化土壤中盆栽促生效果图。图8为实施例3中解淀粉芽孢杆菌nrcb005耐酸特性。具体实施方式下面结合具体实施方式对本发明的技术方案作进一步详细的说明。实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其进行限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的普通技术人员来说，依然可以对前述实施例进行修改，或者对其中部分进行替换；而这些修改或替换，并不使相应的技术方案脱离本发明所要求保护的技术方案的范围。实施例1菌株nrcb005的分离及筛选取10g水稻根际土放入装有90ml盐溶液的锥形瓶中，在28℃、200r/min条件下，振荡1h，制成10-1的土壤悬液，取10-1的土壤悬液10ml，放入装有90ml盐溶液的瓶中，配成10-2的稀释液，以此类推。分别配成10-3、10-4、10-5的稀释液。然后用移液器分别移取10-3、10-4、10-5的稀释液100μl涂布于固氮固体培养基上，每个梯度三个重复。在28℃恒温生化培养箱中培养2～4d，每天观察其生长情况，出现单菌落后，在超净工作台中用接种环挑取比较大的菌落接种到bms培养基上进行纯化，纯化5～6代后，用30％的甘油保藏在-80℃中，待用。实施例2菌株nrcb005的鉴定菌株外观形态见图1。菌株nrcb005通过16srdna序列分析，经ncbi中blast比对后与解淀粉芽孢杆菌同源较高，相似度为100％，在根据其外形以及生理生化特性，初步鉴定菌株nrcb005为解淀粉芽孢杆菌。从图1中可以看出该菌菌落呈圆形，不透明，罕见半透明，淡黄色白色和凸起，边缘不规则，易挑起。生理生化性质见表1：解淀粉芽孢杆菌nrcb005淀粉水解、v-p反应、明胶液化、葡萄糖产酸和溶菌酶均为阳性，甲基红试验为阴性。表1菌株nrcb005生理生化性质菌株编号淀粉水解v-p反应甲基红试验明胶液化葡萄糖产酸溶菌酶nrcb005++-+++注：“+”为阳性，“-”为阴性实施例3解淀粉芽孢杆菌nrcb005耐酸能力测定用稀盐酸和naoh将液体lb培养基的ph值调到7、6、5、4.5、4、3.5、3、2.5后分装在250ml锥形瓶中，每个锥形瓶分装50ml；接入对数生长期的菌液100μl；每个盐浓度每种菌3个重复；培养温度30℃；摇床200rpm；培养2～3d；测od600值，菌株耐酸特性见图8。从图8中可以看出在lb培养基酸度大于ph3.5时，解淀粉芽孢杆菌nrcb005的od600虽然逐渐降低，但是均在1.5以上，但是在lb培养基酸度小于ph3.5时，解淀粉芽孢杆菌nrcb005的od600均小于0.3，以上数据说明，解淀粉芽孢杆菌nrcb005具有较好的耐酸能力，其耐酸度为ph7～ph3.5。实施例4解淀粉芽孢杆菌nrcb005对主要植物病原菌的平板抑菌作用平板对峙法：将pda平板上培养3～5天的尖孢镰刀病原菌、玉米大斑病原菌、甜瓜枯萎病原菌接种于pda培养基中央，然后将在pda培养基上活化24h的解淀粉芽孢杆菌nrcb005接种于距菌饼2.5cm处，每个pda平板接种1个点，重复3次，以接无菌水为空白对照。置于28℃培养箱中培养，待对照中病原菌长满培养皿后，测量处理组菌落直径和对照菌落直径，并计算抑菌率，抑菌率见表2。菌株nrcb005对抑制甜瓜枯萎病原菌率为63％、对玉米大斑病原菌抑菌率为58％、对尖孢镰刀病原菌抑菌率为80％，并且从图3、图4、图5中可以直观的看出解淀粉芽孢杆菌nrcb005能有效抑制甜瓜枯萎病原菌、玉米大斑病原菌、尖孢镰刀病原菌的生长，具有良好的生物防治效果。抑制率(％)＝(对照组菌落直径-处理组菌落直径)/(对照组菌落直径)*100％。表2解淀粉芽孢杆菌nrcb005平板抑菌作用实施例5解淀粉芽孢杆菌nrcb005产挥发性气体乙偶姻的测定发酵种子培养基：采用lb培养基(酵母粉5g/l，蛋白胨10g/l，nacl10g/l)，培养条件为旋转式摇床28℃，200r/min。发酵培养基；酵母膏5g/l，玉米浆4g/l，尿素4g/l，葡萄糖10g/l，用稀盐酸和naoh将上述发酵培养基的ph值调到7、6、5、4.5、4、3.5、3、2.5，在培养条件为28℃，200r/min摇床里面培养48h后，用气相色谱测定发酵液中乙偶姻含量。乙偶姻采用agilent7890agc分析，gc条件为：氢火焰检测器220℃，进样口温度210℃，载气n2，程序升温。菌株nrcb005产乙偶姻能力见表3。从表中可以看出，菌株nrcb005在不同的酸度的培养基中，其分泌乙偶姻能力不同，在培养基酸度为ph7时，菌株nrcb005分泌乙偶姻能力最强，达15g/l。图2为菌株nrcb005乙偶姻色谱检测结果，其中，a是3g/l乙偶姻标样，b为1/30的酸度为ph7的48h发酵液，标样中乙偶姻出峰时间为6.177min，样品色谱图中在6.180min出现吸收峰，说明菌株nrcb005能产生乙偶姻。实施例6解淀粉芽孢杆菌nrcb005产吲哚乙酸(iaa)能力鉴定采用salkowski比色法测定菌株nrcb002分泌iaa的能力。发酵培养基：酵母粉5g/l，蛋白胨10g/l，nacl10g/l，色氨酸1g/l。将活化好的菌株按1％的接种量接入发酵培养基中，用稀盐酸和naoh将上述发酵培养基的ph值调到7、6、5、4.5、4、3.5、3、2.5。在28℃，200r/min下培养2～3d，每株菌3个重复。发酵液在8000r/min离心5min，取上清液1ml于4ml离心管中，加入2ml比色液，摇匀，在室温黑暗条件下放置15～20min，在530nm处测定吸光值。用iaa标品配不同浓度的iaa溶液，与测样品相同方法处理并测定吸光值，绘制标准曲线。参考标准曲线确定iaa含量。解淀粉芽孢杆菌nrcb005产吲哚乙酸(iaa)的情况见表3。实施例7解淀粉芽孢杆菌nrcb005的溶磷活性分析发酵培养基：kh2po4，0.2g/l；k2hpo4，0.8g/l；mgso4·7h2o，0.2g/l；ca3(po4)25g/；nacl，0.2g/l；caso4·2h2o，0.1g/l；fecl3，微量；na2mo4·2h20，微量；酵母提取物，0.5g/l；甘露醇，20g/l，用稀盐酸和naoh将上述发酵培养基的ph值调到7、6、5、4.5、4、3.5、3、2.5。将活化好的菌株按1％的接种量接入发酵培养基中，在28℃，200r/min下培养2～3d，每株菌3个重复。发酵液在8000r/min离心，取上清液5ml于50ml容量瓶中，加去离子水约30ml，加入二硝基苯酚指示剂2滴，用氢氧化钠和稀硫酸调溶液至微黄，然后加入钼锑抗显色剂5ml，摇匀，定溶，在700nm处比色。解淀粉芽孢杆菌nrcb005的溶磷活性见表3。实施例8解淀粉芽孢杆菌nrcb005的解钾能力测定发酵种子培养基：采用lb培养基(酵母粉5g/l，蛋白胨10g/l，nacl10g/l)，培养条件为旋转式摇床28℃，200r/min。发酵培养基：蔗糖50g，mgso4·7h2o0.5g，cacl20.1g，fecl30.005g，钾长石粉1.0g，去离子水1.0l，用稀盐酸和naoh将上述发酵培养基的ph值调到7、6、5、4.5、4、3.5、3、2.5。，在培养条件为28℃，200r/min摇床培养3d后，用原子吸收光谱仪测定发酵液中速效钾的含量。解淀粉芽孢杆菌nrcb005的解钾能力见表3。从表3中可以看出，菌株nrcb005发酵液酸度为ph7时，iaa和乙偶姻分泌量最高，分别为56mg/l和15g/l，并且溶磷量解钾能力最强，分别达到82mg/l和7.9mg/l。菌株nrcb005随着发酵液ph的降低，其iaa和乙偶姻分泌量逐渐降低，溶磷量解钾能力也逐渐减弱。表3解淀粉芽孢杆菌nrcb005的促生特性实施例9由解淀粉芽孢杆菌nrcb005发酵产生的有机性挥发气体乙偶姻对番茄的促生作用将解淀粉芽孢杆菌nrcb005种接种于lb液体养基中，在25～30℃，150～200r/min摇床下培养至对数中期(od600＝1.0)，4℃离心收集菌体，菌体用无菌水重悬，待用。番茄种子表面消毒，过程如下：70％乙醇浸泡15s，2.5％次氯酸钠浸泡15min，再用无菌水冲洗7～8次，将番茄种子移到1/2ms培养基后，放入24℃光照培养箱中催芽2天。将发芽的番茄种子移到带有隔板的13*13cm培养皿的一室中，每皿移栽五株，培养基另一室加200μl无菌水悬浮的nrcb005的菌液(od600＝1)。培养基两边均为1/2ms，并且用稀盐酸和naoh将上述ms培养基的酸度调到ph7和ph4.2。以200μl无菌水为对照。培养皿用封口膜封住，放置于24℃，16h光照、8h黑暗的光照培养箱中培养。培养7d后，测量番茄的株高、鲜重、干重。从表中可知，在ph7和ph4.2时解淀粉芽孢杆菌nrcb005均能显著增加番茄的生物量，并且在酸度为ph4.2时，解淀粉芽孢杆菌nrcb005对番茄促生效果最明显，接种nrcb005的番茄鲜重和干重分别较空白增加21％和32％。表4解淀粉芽孢杆菌nrcb005产生的有机性挥发气体对番茄促生实验数据实施例10供试土壤的理化性质依据鲁如坤主编的《土壤农业化学分析方法》进行测定，供试土壤初始理化性质见表5。表5供试土壤的理化性质实施例11解淀粉芽孢杆菌nrcb005对盆栽番茄的促生作用将解淀粉芽孢杆菌nrcb005接入lb培养基，在28℃、200r/min条件下，摇床培养，每隔2小时测od600，当od600值为1时，将菌液在8000r/min离心，收集已经活化的菌株。将收集菌体用0.86％生理盐水清洗，然后用等体积的无菌水重悬，并将其稀释100倍后制成菌悬液待用，以不接种解淀粉芽孢杆菌nrcb005为空白对照。将挑选大小一致，无损伤的番茄种子用清水冲洗后，放入装有待测菌悬液的培养皿内，浸泡2～3h后，将其移入装有供试土壤的花盆中，每盆移入20颗番茄籽，每处理播种4盆，在自然光照条件下，生长30d后测量株高、叶面积、鲜重。实验结果见表6。从表中可知，在未酸化土壤和酸化土壤中，解淀粉芽孢杆菌nrcb005均能显著增加番茄的生物量，接种nrcb005的番茄鲜重和鲜重分别较空白增加52％和45％。从图6和图7中可以明显看出，在酸化土壤和未酸化土壤中，接种解淀粉芽孢杆菌nrcb005番茄的株高均比空白高，长势也比空白旺盛，这说明解淀粉芽孢杆菌nrcb005具有较好的在酸化土壤中和未酸化土壤中促进番茄生长的能力。其中供试土壤为实施例10中所述的土壤，酸化土壤是指用稀硫酸将未酸化土壤的酸度调至ph4.2的土壤。表6解淀粉芽孢杆菌nrcb005盆栽实验数据序列表<110>南京工业大学<120>一株耐酸产乙偶姻的解淀粉芽孢杆菌及其应用<160>1<170>siposequencelisting1.0<210>1<211>1399<212>dna<213>解淀粉芽孢杆菌(bacillusamyloliquefaciens)<400>1tacctcaccgacttcgggtgttacaaactctcgtggtgtgacgggcggtgtgtacaaggc60ccgggaacgtattcaccgcggcatgctgatccgcgattactagcgattccagcttcacgc120agtcgagttgcagactgcgatccgaactgagaacagatttgtgggattggcttaacctcg180cggtttcgctgccctttgttctgtccattgtagcacgtgtgtagcccaggtcataagggg240catgatgatttgacgtcatccccaccttcctccggtttgtcaccggcagtcaccttagag300tgcccaactgaatgctggcaactaagatcaagggttgcgctcgttgcgggacttaaccca360acatctcacgacacgagctgacgacaaccatgcaccacctgtcactctgcccccgaaggg420gacgtcctatctctaggattgtcagaggatgtcaagacctggtaaggttcttcgcgttgc480ttcgaattaaaccacatgctccaccgcttgtgcgggcccccgtcaattcctttgagtttc540agtcttgcgaccgtactccccaggcggagtgcttaatgcgttagctgcagcactaagggg600cggaaaccccctaacacttagcactcatcgtttacggcgtggactaccagggtatctaat660cctgttcgctccccacgctttcgctcctcagcgtcagttacagaccagagagtcgccttc720gccactggtgttcctccacatctctacgcatttcaccgctacacgtggaattccactctc780ctcttctgcactcaagttccccagtttccaatgaccctccccggttgagccgggggcttt840cacatcagacttaagaaaccgcctgcgagccctttacgcccaataattccggacaacgct900tgccacctacgtattaccgcggctgctggcacgtagttagccgtggctttctggttaggt960accgtcaaggtgccgccctatttgaacggcacttgttcttccctaacaacagagctttac1020gatccgaaaaccttcatcactcacgcggcgttgctccgtcagactttcgtccattgcgga1080agattccctactgctgcctcccgtaggagtctgggccgtgtctcagtcccagtgtggccg1140atcaccctctcaggtcggctacgcatcgtcgccttggtgagccgttacctcaccaactag1200ctaatgcgccgcgggtccatctgtaagtggtagccgaagccaccttttatgtctgaacca1260tgcggttcaaacaaccatccggtattagccccggtttcccggagttatcccagtcttaca1320ggcaggttacccacgtgttactcacccgtccgccgctaacatcagggagcaagctcccat1380ctgtccgctcgactgcatg1399当前第1页12