一种培育具有马铃薯Y病毒属广谱病毒抗性的转基因大豆的方法与流程

本发明属于基因工程领域，涉及一种培育具有马铃薯y病毒属广谱病毒抗性的转基因大豆的方法。
背景技术：
：大豆花叶病毒(soybeanmosaicvirus，smv)病是一种全球性大豆病害，广泛分布于世界各大豆产区，严重影响大豆的产量和品质。smv属于马铃薯y病毒科(potyviridae)，马铃薯y病毒属(potyvirus)，大豆花叶病毒种。大豆感染smv后，会产生花叶和坏死等症状，造成大豆光合面积减少和光合能力降低，植株矮化，生长量下降，籽粒出现褐斑，造成大豆产量损失约35％-50％，甚至绝收。根据遗传学标准可将抗性基因划分为显性抗性基因和隐性抗性基因两个类型，寄主拥有显性抗性基因或者病毒繁殖所依赖的隐性抗性基因发生突变、缺失都将阻碍病毒的侵染。大多数已知的显性抗性基因主要是在抗真菌和细菌病害中发挥作用，而在植物抗病毒研究中则更容易发现隐性抗性基因。目前，在已知的植物对potyvirus的抗性基因中，40％是隐性的，其中绝大多数与真核翻译起始因子eif4e(eukaryotictranslationinitiationfactor4e)有关。eif4e能够连接在植物mrna帽子结构上，对蛋白翻译的起始阶段进行调节，所以目前普遍认为病毒的vpg蛋白起到类似于帽子结构的作用，通过植物eif4e介导病毒rna的翻译，病毒的vpg蛋白能否与寄主的eif4e发生互作影响着寄主对病毒的抗性。eif4e为植物抗病毒研究提供了新的思路，即可以通过转基因技术将其干扰片段导入植株体内，通过诱发rna干扰(rnainterference，rnai)在转录水平沉默同源靶基因的功能，从而获得抗病材料。因此，应用基于rnai原理的大豆转基因技术，对隐性抗病基因eif4e进行特异性沉默，进而通过抗病鉴定确认该基因是否对smv存在抗性，这对挖掘smv隐性抗病基因、明确其抗性机制以及探索隐性抗病基因在转基因抗病育种中的应用具有重要价值。技术实现要素：本发明的目的是针对现有技术的上述不足，提供一种培育具有马铃薯y病毒属广谱病毒抗性的转基因大豆的方法。本发明的目的可通过以下技术方案实现：一种培育具有马铃薯y病毒属广谱病毒抗性的转基因大豆的方法，通过基因工程的手段沉默大豆中的eif4e基因获得具有广谱病毒抗性的转基因大豆。所述的方法，优选通过构建seqidno.1所示的大豆eif4e基因干扰片段，将其导入大豆获得具有广谱病毒抗性的转基因大豆。所述的方法，进一步优选通过构建含有seqidno.1所示的大豆eif4e基因干扰片段的rnai载体，将其导入大豆获得具有广谱病毒抗性的转基因大豆。大豆eif4e基因在培育具有马铃薯y病毒属广谱病毒抗性的转基因大豆中的应用。所述的马铃薯y病毒属广谱病毒抗性包括对smv、bcmv和wmv的抗性。seqidno.1所示的大豆eif4e基因干扰片段在培育具有马铃薯y病毒属广谱病毒抗性的转基因大豆中的应用。所述的马铃薯y病毒属广谱病毒抗性包括对smv、bcmv和wmv的抗性。有益效果：本发明提供了一种培育具有马铃薯y病毒属广谱病毒抗性的转基因大豆的方法，按照该方法能够获得具有马铃薯y病毒属广谱病毒抗性的转基因大豆。在面对培育具有马铃薯y病毒属广谱病毒抗性的转基因大豆的技术问题时，本发明选择通过基因工程的手段沉默大豆中的eif4e基因具有以下优点：(1)能够对多个smv株系、bcmv和wmv产生广谱、持久的抗性；(2)我国生产实践中大量推广种植抗病大豆品种，这些抗病品种携带显性抗病基因，这给自然界中侵染大豆的马铃薯y病毒带来很大的筛选压力，容易引发病毒变异，导致寄主丧失抗性，造成病害流行；本研究采用隐性抗病基因介导的抗性，很难使病毒变异，因此抗性稳定持久；(3)田间生产实践中，往往存在多病毒株系混合侵染，然而显性抗病基因具明显的株系专化性，即抗谱较窄，因此应用隐性抗病基因(eif4e)能够获得更加广谱的抗性；(4)病毒能够与寄主eif4e互作，介导自身的翻译，同时抑制寄主内源rna干扰，保护自身不受破坏，完成病毒自身的生活史。本发明靶向沉默大豆eif4e基因，不但使得病毒不能翻译，还能间接释放寄主的rna干扰作用，进一步增强寄主对病毒的抗病性。说明书附图图1rnai干扰片段eif4ei克隆图2pdonr221-eif4ei菌液pcr扩增图3pb7gwiwg2(ii)-eif4ei菌液pcr扩增图4转基因大豆植株除草剂涂抹鉴定图5转基因大豆植株pcr检测图6转基因大豆植株pat/bar转基因检测试纸鉴定图7t1代转基因大豆植株及其对照的smv发病症状图8t2代转基因大豆植株qrt-pcr分析图9t4代抗病大豆植株及其对照对不同病毒的发病症状图10t4代转基因大豆植株qrt-pcr分析具体实施方式以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定于本发明。实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均能通过商业途径获得。实施例11.大豆eif4e基因干扰片段的克隆根据大豆eif4e基因的核苷酸序列(genebank登录号为eu912426)，采用primerpremier5.0软件设计正向引物attb1-eif4ei-f和反向引物attb2-eif4ei-r(表1)，用于克隆长度为348bp的干扰片段eif4ei，其中attb1和attb2为29bp的特异性重组位点(表1，下划线所示)。eif4ei的核苷酸序列：cccatctacactttcgccaccgttgaagagttttggagcatttacaataacattcaccacccgagcaagttgggtttgggggcggactttcactgcttcaagcacaagattgagccaaagtgggaggaccctatctgcgccaatgggggaaagtggactatgaccttcccaaggggaaaatctgataccagttggttgtatacgttgttggcgatgattggagaacagtttgatcacggagatgaaatatgtggagctgttgtgaatgtcagaagtaggcaggataaaattgctatttggactaagaacgcttcaaatgaagctgctcaggtgagcattggaaagcag(seqidno.1)表1实验所用引物采用rt-pcr方法克隆干扰片段eif4ei:播种大豆品种天隆1号于装有营养土的花盆中，在人工气候箱中培养至幼苗期，采取幼嫩叶片于液氮中研磨充分，利用rna提取试剂盒(购自tiangen公司，货号为dp432)提取大豆总rna，利用反转录试剂盒(购自takara公司，货号为rr00036a)合成cdna第一链。按照如下步骤进行rna反转录：(1).在microtube中配制下列混合液：组分体积oligodtprimer(50μm)1μldntpmixture(10mmeach)1μltotalrna(orpoly(a)+rna)2μlrnasefreeddh2o6μltotal10μl(2).在pcr仪上进行下列条件的变性、退火反应：(3).在上述microtube管中配制下列反转录反应液：(4).在pcr仪上按下列条件进行反转录反应：以上述cdna为模板，以attb1-eif4ei-f、attb2-eif4ei-r分别为正、反向引物，采用kodfx高保真酶(购自toyobo公司，货号为kfx-101)扩增eif4ei，pcr反应体系下：组分体积template(cdna)1μldntpmixture(2mm)10μl2×pcrbufferforkodfx25μlattb1-eif4ei-f1.5μlattb2-eif4ei-r1.5μlkodfx(1.0u/μl)1μlautoclavedddh2o10μltotal50μl设置如下pcr反应程序：反应完成后在1％琼脂糖凝胶上检测pcr产物，电泳结果与预期一致(图1)。采用dna凝胶回收试剂盒(购自axygen公司，货号为ap-gx-50)纯化回收目的条带，送交上海英俊公司进行测序，测序结果在ncbi进行blast比对，结果显示与目标序列匹配度为100％，表明克隆基因片段正确。2.rnai载体的构建通过gateway载体同源重组技术进行bp反应和lr反应，将rnai片段eif4ei先后连接至入门载体pdonr221和终端载体的pb7gwiwg2(ii)，完成rnai载体的构建。按照下列操作进行bp反应：(1).采用10μl反应体系。冰浴条件下，在1.5ml无菌离心管中依次加入rnai片段eif4ei4μl，pdonor221vector1μl，轻柔混匀后加入bpclonaseⅱ连接酶(购自invitrogen公司，货号为11789-020)2μl，tebuffer(ph＝8.0)3μl，轻柔地涡旋混匀后短暂离心。(2).25℃温浴4h(可延长至12h)。(3).加入蛋白酶k溶液1μl，37℃温浴10min，终止反应。(4).取出上述bp连接产物10μl，通过热激法转化大肠杆菌感受态dh5α，涂布于lb固体培养基(含有50mg/lkana)。对bp反应后转化的大肠杆菌单克隆菌液进行pcr反应，鉴定rnai片段eif4ei是否连接至入门载体pdonr221。采用2×taqmastermix聚合酶(购自tiangen公司，货号为kt201-01)进行pcr扩增，pcr反应体系如下：组分体积菌液1μlattb1-eif4ei-f1μlattb1-eif4ei-r1μl2×taqmastermix12.5μlautoclavedddh2o9.5μltotal25μl设置如下程序进行pcr反应：pcr扩增产物进行1％琼脂糖凝胶电泳检测，结果显示条带大小正确(图2)，说明干扰片段eif4ei已经成功地插入到入门载体pdonr221中。阳性单克隆菌液样本送交上海英俊公司进行测序，测序结果在ncbi进行blast比对，结果显示与目标序列匹配度为100％。测序正确的单克隆菌液进行扩大培养，之后采用质粒dna提取试剂盒(购自axygen公司，货号为ap-mn-p-50)抽提质粒，获得入门克隆pdonr221-eif4ei，用于lr反应。按照下列操作进行lr反应：(1).采用10μl反应体系。冰浴条件下，在1.5ml无菌离心管中依次加入入门克隆pdonr221-eif4ei4μl，终端质粒pb7gwiwg2(ii)2μl，轻柔混匀后加入lrclonaseⅱ连接酶(购自invitrogen公司，货号为11791-020)2μl，tebuffer(ph＝8.0)2μl，轻柔地涡旋混匀后短暂离心。(2).25℃温浴4h(可延长至12h)。(3).加入蛋白酶k溶液1μl，37℃温浴10min，终止反应。(4).取出上述lr连接产物10μl，通过热激法转化大肠杆菌感受态dh5α，涂布于lb固体培养基(含有100mg/lspec)。对lr反应后转化的大肠杆菌单克隆菌液进行pcr反应，鉴定入门克隆pdonr221-eif4ei是否与终端质粒pb7gwiwg2(ii)发生了同源重组。采用2×taqmastermix聚合酶(购自tiangen公司，货号为kt201-01)进行pcr扩增，pcr反应体系和程序与bp反应相同。pcr扩增产物进行1％琼脂糖凝胶电泳检测，结果显示条带大小正确(图3)，说明干扰片段eif4ei已经成功地插入到终端质粒pb7gwiwg2(ii)中。阳性单克隆菌液样本送交上海英俊公司进行测序，测序结果在ncbi进行blast比对，结果显示与目标序列匹配度为100％。测序正确的单克隆菌液进行扩大培养，之后采用质粒dna提取试剂盒(购自axygen公司，货号为ap-mn-p-50)抽提质粒，获得表达克隆pb7gwiwg2(ii)-eif4ei。之后采用电击法转化农杆菌eha105感受态，在含有25mg/lrif和50mg/lkana的yeb固体培养基上筛选阳性单克隆菌落，并在含有相同抗生素的yeb液体培养基中进行扩繁，加入适量的无菌甘油并保存于-80℃冰箱。3.大豆遗传转化及阳性t0代植株的筛选应用农杆菌介导大豆子叶节的遗传转化体系(characterizationofsoybeanmosaicvirusresistancederivedfrominvertedrepeat-smv-hc-progenesinmultiplesoybeancultivars)(doi10.1007/s00122-015-2522-0)，选用smv感病大豆品种天隆1号为受体材料，以萌发24h的成熟大豆子叶节为外植体，以bar基因作为筛选标记，利用上述已构建的rnai载体(即eha105-pb7gwiwg2(ii)-eif4ei)进行大豆转基因实验。通过氯气表面灭菌、种子萌发、外植体制备、侵染液制备、侵染、共培养、丛生芽诱导、芽伸长、生根、炼苗、驯化等一系列组织培养步骤，共计对1388个外植体进行遗传转化，获得抗性组培苗46株(表2)。采用3种检测手段对获得的46株抗性组培苗进行鉴定，包括除草剂涂抹(200mg/lbasta，购自鼎国生物技术公司，货号为mb-b5012)、pcr(35s-t、35s-p、bar引物见表1)和pat/bar转基因检测试纸(购自envirologix公司，货号为as013ls)。除草剂涂抹后，阳性材料的处理叶与对照无明显差异，而非转基因植株和转基因阴性植株的叶片均出现了明显的药害症状(图4)；利用3对引物(表1)对抗除草剂的植株进行pcr检测及1％琼脂糖凝胶电泳，结果显示阳性材料在正确的位置出现了条带(图5，m为dnamarker，v为阳性对照，n为阴性对照，d为空白对照，1-10为阳性转基因大豆)；进一步pat/bar转基因检测试纸鉴定，结果显示阳性材料呈现出2条显色带，即控制线和检测线(图6，nt为非转基因植株，na为转基因阴性植株，1-10为阳性转基因大豆)。将上述3种检测方法均表现为阳性的幼苗认定为阳性t0代大豆植株，共筛选出31株阳性材料(表2)。表2农杆菌介导大豆子叶节遗传转化试验批次侵染外植体数组培苗数阳性t0植株数12874422121073209128425963523065619184总计138846314.t1/t2代转基因大豆对smv的抗病鉴定在感病大豆品种南农1138-2上对smvsc3株系进行繁殖、活化，发病后收集症状典型的叶片放置于冷却的高温灭菌的洁净研钵中，加入适量的smv接种液(0.01m磷酸缓冲液，ph＝7.4，约每1g叶片组织加入3-5ml缓冲液)以及少量的金刚砂(600目)，在研钵中碾磨成匀浆。用毛刷将匀浆涂抹至t1/t2代大豆材料展平的真叶上，第一组复叶展平时重复接种一次，每次接种后均用自来水进行冲洗，非转基因植株接种smvsc3株系或0.01m磷酸缓冲液分别作为阳性、阴性对照。调查t1/t2植株第1对至第4对复叶(v1-v4)的smv发病症状，根据v1-v4的发病情况将各个植株划分为4种反应类型(表3)。表3反应类型划分标准类型划分标准高度抗病(hr)v1-v4均不发病延迟抗病(dr)早期发病，后期smv症状消失轻微抗病(mr)症状延迟出现，或程度轻于对照感病(s)v1-v4均发病，程度与对照相同本研究对148株阳性t1代和42株阳性t2代转基因大豆植株进行了smv接种鉴定，结果表明smv抗性在t1/t2材料中得到了显著提升(表4)。就t1代而言，筛选出高抗植株(hr)50株，占总调查株数的33.8％；延迟抗病(dr)植株15株，占10.1％；轻微抗病(mr)植株42株，占28.4％；感病(s)植株41株，占27.7％。就t2代而言，筛选出高抗植株(hr)33株，占总调查株数的78.6％；延迟抗病(dr)植株6株，占14.3％，轻微抗病(mr)植株3株，占7.1％；未发现感病(s)植株。非转基因植株(nt)接种smv后全部表现为感病(s)。smv反应类型的统计结果见表4，t1代大豆植株及其对照的smv发病症状如图7所示。表4阳性t1/t2植株对smv株系sc3的反应类型世代接种植株数hrdrmrsnt400(0)0(0)0(0)40(100.0％)t114850(33.8％)15(10.1％)42(28.4％)41(27.7％)t24233(78.6％)6(14.3％)3(7.1％)0(0)5.t2代转基因大豆植株qrt-pcr和das-elisa分析接种smvsc3株系15天后(15dpi)和30天后(30dpi)，采取t2植株及其非转基因对照的顶端嫩叶，利用rna提取试剂盒(购自北京天根生化科技有限公司，货号为dp432)进行总rna提取，利用反转录试剂盒(购自takara公司，货号为rr00036a)合成cdna，利用premixextaqtm试剂盒(购自takara公司，货号为hrr041a)，以上述cdna为模板，在荧光定量pcr仪(roche，lc480ii)上进行qrt-pcr实验，在rna水平检测smv含量。大豆看家基因gmtubulin作为内参，每个样本设置3次重复，数据由荧光定量pcr仪自动读取，采用2-δδct法进行相对定量分析。qrt-pcr所涉及引物如表5所示，反应体系如表6所示。表5实时荧光定量引物引物名称引物序列qsmv-fcagatgggcgtggttatga(seqidno.8)qsmv-racaatgggtttcagcggata(seqidno.9)qgmtubulin-fggagttcacagaggcagag(seqidno.10)qgmtubulin-rcacttacgcatcacatagca(seqidno.11)表6荧光定量pcr反应体系设置如下程序进行pcr反应：结果表明(图8，nt为非转基因对照，其余为转基因t2植株)：在接种smv后的两个时间点(15dpi和30dpi)，nt体内的smv含量均明显高于t2植株，且随着时间推移，smv含量在转基因t2植株体内呈现下降趋势，而在nt体内迅速增加。进一步，在接种smv2个月后，采取t2植株及其非转基因对照(nt)的顶端嫩叶，利用双抗体夹心酶联免疫吸附分析法(das-elisa)对smv进行血清学分析，在蛋白水平探测smv的含量。das-elisa试剂盒购自美国acd公司(货号为v094-r1)，每个样本设置3次重复，同时设置阳性对照(nt接种smvsc3)、阴性对照(nt接种0.01m磷酸缓冲液)、空白对照(底物缓冲液)。显色1小时后，在酶标仪405nm波长下测定光密度值(od)，并参照以下标准分析实验结果：(1)对照孔od值(底物孔、阴性对照及阳性对照孔)应在产品质量控制范围内(2)底物孔od值<0.15(3)阳性对照od值/阴性对照od值>10.0(4)样品od值＝原始od值-底物孔od值(5)样品od值/阴性对照od值≥2.0，判为阳性(6)样品od值/阴性对照od值<2.0，判为阴性结果表明(表7)：转基因t2植株的od值均低于2.0，呈smv阴性；非转基因对照植株(nt)的od值高达14.11，呈smv阳性。表7t2代大豆植株das-elisa分析注：p＝检测样品；n＝阴性对照；nt＝非转基因植株；n(od405nm)＝0.098；(+)：smv阳性；(-)：smv阴性。6.纯合t3/t4代转基因大豆植株广谱抗病性鉴定对纯合的t3/t4代转基因大豆植株分别接种smv-sc3、smv-sc7、smv-sc15、smv-sc18、smv-r、菜豆普通花叶病毒(beancommonmosaicvirus，bcmv)、西瓜花叶病毒(watermelonmosaicvirus，wmv)，并且分别设置阳性、阴性对照。调查t3/t4植株v1-v4的发病症状，根据v1-v4的发病情况将各个植株划分为4种反应类型(表3)，实验方法、鉴定方法同第4部分内容。调查结果表明(表8)：t3/t4代转基因大豆植株在接种smv-sc3、smv-sc7、smv-sc15、smv-sc18、smv-r、wmv、bcmv后，绝大多数表现为hr，少部分表现为dr，个别表现为mr，未发现s；然而，t3/t4代转基因大豆植株在接种bpmv后，全部表现为s；此外，非转基因植株接种上述所有病毒，即阳性对照，均表现为s。由此可见，t3/t4代转基因大豆植株对potyvirus(包括smv、bcmv、wmv)具有广谱抗性，且抗性极强，绝大多数表现为hr(表8)。t3/t4代转基因大豆植株对不同病毒反应类型的统计结果见表8，t4代抗病大豆植株及其对照对不同病毒的发病症状如图9所示。表8t3/t4植株对不同病毒的反应类型7.纯合t3/t4代转基因大豆植株das-elisa分析在接种smv-sc3、smv-sc7、smv-sc15、smv-sc18、smv-r、wmv、bcmv3周后(3wpi)和5周后(5wpi)，每个t2/t3家系中随机选取5株t3/t4植株，进行das-elisa血清学分析，这5株t3/t4植株的平均od值代表该t2/t3家系的od值，实验方法、鉴定方法同第5部分内容。其中，das-elisa试剂盒购自美国acd公司(smv货号为v094-r1，bcmv货号为v097-r1，wmv货号为v065-r1)。结果表明(表9和表10)：t2/t3家系(t3/t4植株)在接种smv-sc3、smv-sc7、smv-sc15、smv-sc18、smv-r、wmv、bcmv后，od值均低于2.0，呈smv阴性；非转基因对照植株(nt)的od值均高达10以上，呈smv阳性；然而，t2/t3家系(t3/t4植株)在接种bpmv后，od值均在10以上，呈smv阳性。由此可见，t3/t4代转基因大豆植株对potyvirus(包括smv、bcmv、wmv)具有良好的广谱抗性。表9t3代大豆植株(t2家系)das-elisa分析注：nt＝非转基因植株；(+)：smv阳性；(-)：smv阴性。表10t4代大豆植株(t3家系)das-elisa分析病毒t3家系3wpi5wpi病毒t3家系3wpi5wpismv-sc3nt>10(+)>10(+)smv-sc18nt>10(+)>10(+)1-1-1-71.05(-)0.96(-)1-1-4-141.00(-)1.01(-)1-1-1-171.07(-)1.15(-)1-1-14-81.02(-)1.32(-)1-1-2-41.12(-)1.28(-)1-1-14-130.99(-)1.08(-)1-16-4-151.13(-)1.22(-)1-16-4-181.07(-)1.10(-)1-16-5-141.06(-)0.97(-)smv-rnt>10(+)>10(+)smv-sc7nt>10(+)>10(+)1-16-4-31.02(-)1.00(-)1-1-16-11.29(-)1.08(-)1-16-4-121.08(-)0.93(-)1-1-16-51.05(-)1.89(-)wmvnt>10(+)>10(+)1-1-19-80.98(-)0.89(-)1-16-5-20.99(-)1.07(-)1-1-24-11.05(-)1.98(-)1-16-5-50.99(-)1.20(-)1-16-6-31.04(-)1.10(-)bcmvnt>10(+)>10(+)1-16-10-51.00(-)1.06(-)1-16-2-90.96(-)0.93(-)smv-sc15nt>10(+)>10(+)1-16-2-121.05(-)0.93(-)1-1-9-31.78(-)1.12(-)1-1-9-91.37(-)1.69(-)1-16-2-111.16(-)1.49(-)1-16-16-61.25(-)1.26(-)注：nt＝非转基因植株；(+)：smv阳性；(-)：smv阴性。8.t4代转基因大豆植株qrt-pcr分析在接种smv-sc3、smv-sc7、smv-sc15、smv-sc18、smv-r、wmv、bcmv15天后(15dpi)和30天后(30dpi)，采取t4植株及其非转基因对照的顶端嫩叶，利用rna提取试剂盒(购自北京天根生化科技有限公司，货号为dp432)进行总rna提取，利用反转录试剂盒(购自takara公司，货号为rr00036a)合成cdna，利用premixextaqtm试剂盒(购自takara公司，货号为hrr041a)，以上述cdna为模板，在荧光定量pcr仪(roche，lc480ii)上进行qrt-pcr实验，在rna水平检测smv含量。大豆看家基因gmtubulin作为内参，每个样本设置3次重复，数据由荧光定量pcr仪自动读取，采用2-δδct法进行相对定量分析。实验所涉及引物如表11所示，反应体系如表6所示。表11实时荧光定量引物引物名称引物序列qsmv-fcagatgggcgtggttatga(seqidno.8)qsmv-racaatgggtttcagcggata(seqidno.9)qbcmv-faatgctgtgaaggctgagtatga(seqidno.12)qbcmv-rtgatttggcggagtgttgg(seqidno.13)qwmv-ftcccacgactacagaagataaca(seqidno.14)qwmv-racacccatctgctcatcattaa(seqidno.15)qgmtubulin-fggagttcacagaggcagag(seqidno.10)qgmtubulin-rcacttacgcatcacatagca(seqidno.11)结果表明(图10，nt为非转基因对照，其余为转基因t4植株)：在接种smv-sc3、smv-sc7、smv-sc15、smv-sc18、smv-r、wmv、bcmv后的两个时间点(15dpi和30dpi)，nt体内的病毒含量均明显高于t4植株，且随着时间推移，病毒含量在nt体内迅速增加，而在绝大多数转基因t4植株体内呈现下降趋势。然而，t4代转基因大豆植株在接种bpmv后的两个时间点(15dpi和30dpi)，病毒含量与nt基本一致。由此可见，t4代转基因大豆植株对potyvirus(包括smv、bcmv、wmv)具有良好的广谱抗性，这与t3/t4代转基因大豆植株的表型观察及das-elisa分析结果相一致。序列表<110>南京农业大学<120>一种培育具有马铃薯y病毒属广谱病毒抗性的转基因大豆的方法<160>15<170>siposequencelisting1.0<210>1<211>348<212>dna<213>大豆(glycinemax(linn.)merr.)<400>1cccatctacactttcgccaccgttgaagagttttggagcatttacaataacattcaccac60ccgagcaagttgggtttgggggcggactttcactgcttcaagcacaagattgagccaaag120tgggaggaccctatctgcgccaatgggggaaagtggactatgaccttcccaaggggaaaa180tctgataccagttggttgtatacgttgttggcgatgattggagaacagtttgatcacgga240gatgaaatatgtggagctgttgtgaatgtcagaagtaggcaggataaaattgctatttgg300actaagaacgcttcaaatgaagctgctcaggtgagcattggaaagcag348<210>2<211>49<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>2ggggacaagtttgtacaaaaaagcaggctcccatctacactttcgccac49<210>3<211>49<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>3ggggaccactttgtacaagaaagctgggtctgctttccaatgctcacct49<210>4<211>21<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>4cgagacaagcacggtcaactt21<210>5<211>21<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>5aaacccacgtcatgccagttc21<210>6<211>20<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>6gacgcacaatcccactatcc20<210>7<211>20<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>7gctcaacacatgagcgaaac20<210>8<211>19<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>8cagatgggcgtggttatga19<210>9<211>20<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>9acaatgggtttcagcggata20<210>10<211>19<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>10ggagttcacagaggcagag19<210>11<211>20<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>11cacttacgcatcacatagca20<210>12<211>23<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>12aatgctgtgaaggctgagtatga23<210>13<211>19<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>13tgatttggcggagtgttgg19<210>14<211>23<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>14tcccacgactacagaagataaca23<210>15<211>22<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>15acacccatctgctcatcattaa22当前第1页12