一种双光子荧光探针及其制备方法与应用与流程

本发明涉及有机功能分子荧光探针成像的技术领域，尤其涉及一种双光子荧光探针及其制备方法与应用。

背景技术：

生物成像技术特别是生物荧光成像技术在生命科学研究中得到了广泛的应用。其中，开发具有高分辨率、低毒性的生物荧光探针材料是当前在生物成像领域的研究热点。传统的单光子荧光探针激发波长通常在可见光区，这导致其用于生物成像时容易产生光漂白现象，也会受生物体系自发荧光的干扰，同时具有较小的组织穿透深度(<100μm)。其次，由于短波长的光在生物体内的透过率较低使得成像的分辨率相对较低，从而影响了这些单光子荧光探针在三维高分辨成像方面的应用。相比传统的单光子共聚焦荧光探针来说，双光子荧光探针在生物成像领域有着更大的优势；双光子荧光探针则是以近红外等长波长光激发，具有大的穿透深度，可降低荧光背景，减小瑞利散射和组织损伤，同时也增强了光的透过率，因而大大提高了其三维高分辨成像能力。

氟是一种非金属元素，也是人体必需的微量元素，少量的氟可以代替磷构筑牙齿，使牙齿更坚固，饮用水和牙膏中含有适量的氟离子可以有效的预防龋齿，人体内氟含量过多会导致氟斑牙、氟骨病，人体内氟含量过少会导致骨质疏松，龋齿等。因此，定性定量的检测氟离子具有十分重要的意义。现有报道的用于细胞中氟离子检测的荧光探针多为单光子荧光探针，其存在不利于生物成像的观察，所适合的激发波长对生物体有一定的伤害作用，且细胞内物质的自发荧光会发生干扰缺点；而现有报道的用于细胞中氟离子检测的双光子荧光探针功能单一、且不利于修饰。

硝基还原酶是一类依赖于黄素腺嘌呤二核苷酸或黄素单核苷酸的细胞质酶，广泛存在于各种细胞中。肿瘤细胞缺氧可引起细胞内的硝基还原酶的水平升高。在还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸等电子供体存在时，硝基还原酶能将含硝基的芳香族化合物有效地还原成相应的化合物。这种还原反应可以被应用于含硝基的芳香族化合物的生物降解以及药物的激活。与此同时，该还原反应也可用来设计含硝基的荧光探针并检测实体瘤细胞的缺氧状况。近几年，科研工作者开发了许多硝基还原酶的荧光探针，但所述大部分探针是激发光波长处于见光区的单分子荧光探针，应用时多有背景干扰、散射干扰等缺陷，灵敏度不高；但检索发现有关检测缺氧区域硝基还原酶的双光子荧光探针还很稀缺，未见广泛报道。

线粒体作为真核细胞内最重要的细胞器，是细胞内氧化磷酸化和合成三磷酸腺苷(atp)的主要场所，为细胞的活动提供了能量，细胞生命活动所需的能量95％来自线粒体。所以其又有“细胞动力工厂”之称。除了为细胞供能外，线粒体还参与诸如细胞分化、细胞信息传递和细胞凋亡等过程，并拥有调控细胞生长和细胞周期的能力。通过线粒体靶向标记、成像和长时间实时动态观测能够对细胞形态学研究、医学诊断等提供最直接、直观的研究手段。目前，现有的靶向线粒体荧光探针多为单光子荧光探针材料，其中较为常用靶向线粒体单光子荧光探针有：greenfm、orangecmtmros、redcmxros、redfm、deepredfm，激发波长范围大多位于可见光的非生物光学窗口，且双光子吸收相对很弱，因此不能实现长时间实时动态观测，使其很难应用在双光子三维成像中。

因此，现有技术还有待于改进和发展。

技术实现要素：

鉴于上述现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种双光子荧光探针及其制备方法与应用，旨在解决现有的双光子荧光探针用途单一，且不利于通过修饰增加扩大其应用的问题。

本发明的技术方案如下：

一种双光子荧光探针，其中，所述双光子荧光探针的结构式为其中，r1、r2独立地选自氢原子、卤原子、烷基、烯基、炔基、羟基、烷氧基、氨基、二烷基氨基、硝基、氰基、酰基、磺酰基、苯基、苄基、芳基、取代芳基、杂环、芳香杂环、取代芳香杂环中的一种；r3选自氢原子、苄基、取代苄基、烷基硅、取代酰基、磺酰基、硫代酰基、烷基、烯丙基、炔丙基、芳基、芳香杂环中的一种。

所述的双光子荧光探针，其中，所述卤原子包括f、cl、br、i。

所述的双光子荧光探针，其中，所述烷基为c1～c12的烷基。

所述的双光子荧光探针，其中，r3选自氢原子、对硝基苯基中的一种。

一种如上任一所述的双光子荧光探针的制备方法，其中，包括步骤：

a、空气条件下，以湿的二甲基亚砜为溶剂，摩尔比为1：1-1.5的r1取代的邻氨基苯甲酰胺与r2取代的香豆素-3-甲醛100～120℃反应2～12h，将反应溶液中倒入水中，抽滤，得粗产物，重结晶得r3为氢原子的双光子荧光探针；

或，空气条件下，以n,n-二甲基乙酰胺为溶剂，r1取代的邻氨基苯甲酰胺与r2取代的香豆素-3-甲醛在nahso3存在下150℃进行反应，tlc监测，反应完全后，将反应溶液中倒入水中，抽滤，得粗产物，重结晶得r3为氢原子的双光子荧光探针；

或，空气条件下，以n,n-二甲基甲酰胺为溶剂，r1取代的邻氨基苯甲酰胺与r2取代的香豆素-3-甲醛在醋酸胺、i2、koh、靛红酸酐同时存在下85℃进行反应，tlc监测，反应完全后，将反应溶液倒入冰水中，萃取，浓缩，柱层析分离纯化，重结晶得r3为氢原子的双光子荧光探针；

b、空气条件下，以n,n-二甲基甲酰胺为溶剂，所述r3为氢原子的双光子荧光探针与br-r3在csco3存在下，先在冰浴中反应2-3h，接着在室温下反应24-26h，tlc监测，反应完全后，将反应混合液倒入冰水中，抽滤，烘干，柱层析分离纯化，得r3为苄基、取代苄基、烷基硅、取代酰基、磺酰基、硫代酰基、烷基、烯丙基、炔丙基、芳基或芳香杂环的双光子荧光探针。

所述的双光子荧光探针的制备方法，其中，步骤a中，所述r1取代的邻氨基苯甲酰胺、r2取代的香豆素-3-甲醛、nahso3的摩尔比为1：1:1.1-1.5。

所述的双光子荧光探针的制备方法，其中，步骤a中，所述r1取代的邻氨基苯甲酰胺、r2取代的香豆素-3-甲醛、醋酸胺、i2、koh、靛红酸酐的摩尔比为1：1-1.2：1：3-3.5：1：1。

所述的的双光子荧光探针的制备方法，其特征在于，步骤b中，所述r3为氢原子的双光子荧光探针、br-r3的摩尔比为1：1.5-2.5。

一种如上任一所述的双光子荧光探针的应用，其中，所述双光子荧光探针可用于双光子荧光细胞成像；以及识别细胞中的外源性氟离子。

所述的双光子荧光探针的应用，其中，所述双光子荧光探针用作硝基还原酶探针，用于检测细胞中的硝基还原酶；以及定位线粒体细胞双光子成像。

有益效果：本发明的双光子荧光探针以喹唑啉-香豆素结构为中心，提升了分子平面性，也大大增强了双光子荧光，提高了双光子成像的分辨率；通过对双光子荧光探针的简单修饰，使其具有定位线粒体细胞成像和检测细胞中硝基还原酶双重功能，从而扩大了双光子荧光探针的应用范围。

附图说明

图1为本发明实施例1制得的双光子荧光探针的¹hnmr谱图。

图2为本发明实施例1制得的双光子荧光探针的¹³cnmr谱图。

图3为本发明实施例1制得的双光子荧光探针的晶体结构图。

图4为本发明实施例1制得的双光子荧光探针的双光子活性吸收截面积变化图。

图5为本发明实施例1制得的双光子荧光探针在含有不同浓度氟离子的乙腈中的荧光滴定发射光谱图。

图6为本发明实施例1制得的双光子荧光探针的选择性响应柱状图。

图7为氟离子对本发明实施例1制得的双光子荧光探针响应细胞成像图：(a)为只加探针2h孵育细胞成像图；(b)为加探针2h孵育后，再加氟离子孵育4h细胞成像图；c)为加入氟离子前后，细胞内总荧光强度变化柱状图。

图8为本发明实施例2制得的双光子荧光探针的¹hnmr谱图。

图9为本发明实施例2制得的双光子荧光探针的¹³cnmr谱图。

图10为本发明实施例2制得的双光子荧光探针的选择性响应柱状图。

图11为本发明实施例2制得的双光子荧光探针的双光子细胞成像图：(a)为正常氧气条件下加入硝基还原酶探针成像图；(b)无氧条件下加入硝基还原酶探针荧光成像图；(c)加入硝基还原酶抑制剂双羟基香豆素细胞成像图.

图12为本发明实施例2制得的双光子荧光探针线粒体共定位双光子细胞成像：(a)为无氧条件下加入硝基还原酶探针绿色通道荧光成像图；(b)为商业线粒体染料红色通道细胞成像图；(c)为蓝色通道和红色通道叠加图。

具体实施方式

本发明提供一种双光子荧光探针及其制备方法与应用，为使本发明的目的、技术方案及效果更加清楚、明确，以下对本发明进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

本发明提供

一种双光子荧光探针，其中，所述双光子荧光探针的结构式为其中，r1、r2独立地选自氢原子、卤原子、烷基、烯基、炔基、羟基、烷氧基、氨基、二烷基氨基、硝基、氰基、酰基、磺酰基、苯基、苄基、芳基、取代芳基、杂环、芳香杂环、取代芳香杂环中的一种；r3选自氢原子、苄基、取代苄基、烷基硅、取代酰基、磺酰基、硫代酰基、烷基、烯丙基、炔丙基、芳基、芳香杂环中的一种。进一步，所述卤原子包括f、cl、br、i；所述烷基为c1～c12的烷基。优选地，r3选自氢原子、对硝基苯基中的一种。

本发明的双光子荧光探针以喹唑啉-香豆素结构为中心，提升了分子平面性，大大增强了双光子荧光，增大了双光子活性吸收截面积，增大了双光子成像的明亮度，进而提高了双光子成像的分辨率；其可针对细胞外源性氟离子成像，从而实现对细胞中的外源性氟离子进行检测；通过对双光子荧光探针的简单修饰，使其具有定位线粒体细胞成像和检测细胞中硝基还原酶双重功能，从而扩大了双光子荧光探针的应用范围。

本发明提供一种如上任一所述的双光子荧光探针的制备方法，其中，包括步骤：

a、空气条件下，以湿的二甲基亚砜为溶剂，摩尔比为1：1-1.5(优选1:1)的r1取代的邻氨基苯甲酰胺与r2取代的香豆素-3-甲醛100～120℃(优选100℃)反应2～12h(优选10h)，将反应溶液中倒入水中，抽滤，得粗产物，重结晶得r3为氢原子的双光子荧光探针；

或，空气条件下，以n,n-二甲基乙酰胺为溶剂，r1取代的邻氨基苯甲酰胺与r2取代的香豆素-3-甲醛在nahso3存在下150℃进行反应，tlc监测，反应完全后，将反应溶液中倒入水中，抽滤，得粗产物，重结晶得r3为氢原子的双光子荧光探针；

或，空气条件下，以n,n-二甲基甲酰胺为溶剂，r1取代的邻氨基苯甲酰胺与r2取代的香豆素-3-甲醛在醋酸胺、i2、koh、靛红酸酐同时存在下85℃进行反应，tlc监测，反应完全后，将反应溶液倒入冰水中，萃取，浓缩，柱层析分离纯化，重结晶得r3为氢原子的双光子荧光探针；

b、空气条件下，以n,n-二甲基甲酰胺为溶剂，所述r3为氢原子的双光子荧光探针与br-r3在csco3存在下，先在冰浴中反应2-3h(优选3h)，接着在室温下反应24-26h(优选24h)，tlc监测，反应完全后，将反应混合液倒入冰水中，抽滤，烘干，柱层析分离纯化，得r3为苄基、取代苄基、烷基硅、取代酰基、磺酰基、硫代酰基、烷基、烯丙基、炔丙基、芳基或芳香杂环的双光子荧光探针。

需要说明的是，tlc监测是指薄层色谱(thinlayerchromatography，tlc)监测。进一步地，步骤a中，所述r1取代的邻氨基苯甲酰胺、r2取代的香豆素-3-甲醛、nahso3的摩尔比为1：1:1.1-1.5(优选1：1:1.1)；所述r1取代的邻氨基苯甲酰胺、r2取代的香豆素-3-甲醛、醋酸胺、i2、koh、靛红酸酐的摩尔比为1：1-1.2：1：3-3.5：1：1(优选1:1:1:3:1:1)。步骤b中，所述r3为氢原子的双光子荧光探针、br-r3的摩尔比为1：2。本发明的制备方法简单，制备条件不苛刻，适用于大规模的工业化生产。

本发明提供一种如上所述的双光子荧光探针的应用，其中所述双光子荧光探针可用于双光子荧光细胞成像；以及识别细胞中的外源性氟离子。

本发明还提供一种如上所述的双光子荧光探针的应用，其中所述双光子荧光探针可用作硝基还原酶探针，检测细胞中的硝基还原酶；以及定位线粒体细胞双光子成像。

本发明的双光子荧光探针经过修饰得到新的双光子荧光探针可被硝基还原酶还原生成双光子探针进而实现了对有氧和无氧条件下细胞内硝基还原酶的检测，同时该探针能够定位于线粒体，因此在生物领域具有广泛的应用前景，可以作为肿瘤细胞靶向线粒体前药用于临床诊断。

下面通过实施例对本发明进行详细说明。

实施例1双光子荧光探针7-(二乙基氨基)-3-(4-羟基喹唑啉-2-基)香豆素的制备、表征及性能测试。

(1)按反应式进行制备，具体步骤为：空气条件下，在100ml的圆底烧瓶中，加入邻氨基苯甲酰胺10mmol，7-(二乙氨基)香豆素-3-甲醛10mmol，再加入湿的二甲基亚砜(dmso)50ml，反应温度为100℃，10h后，将反应溶液中的物料倒入水中，静止分相、抽滤，得到的固体进一步用乙醇与水的混合溶剂进行重结晶，即得双光子荧光探针7-(二乙基氨基)-3-(4-羟基喹唑啉-2-基)香豆素，产率为80％。

(2)按反应式进行制备，具体步骤为：空气条件下，在100ml的圆底烧瓶中，加入邻氨基苯甲酰胺10mmol，7-(二乙氨基)香豆素-3-甲醛10mmol，再加入溶剂n,n-二甲基乙酰胺(dmac)，待全部溶解后，加入nahso3(11mmol)，反应温度为150℃，反应8h，tlc监测，直到反应完全后，将反应溶液中的物料倒入水中，静止分相、抽滤，得到的固体进一步用乙醇与水的混合溶剂进行重结晶，即得双光子荧光探针7-(二乙基氨基)-3-(4-羟基喹唑啉-2-基)香豆素。

(3)按反应式进行制备，具体步骤为：空气条件下，在100ml的圆底烧瓶中，加入醋酸胺10mmol，7-(二乙氨基)香豆素-3-甲醛10mmol，i230mmol，koh10mmol，靛红酸酐10mmol，再加入溶剂n,n-二甲基甲酰胺(dmf)50ml，反应温度为85℃，反应6h，tlc检测，直到反应完全后，将反应混合液倒入冰水中，用乙酸乙酯萃取，蒸干有机相的溶剂，经过柱层析分离(淋洗剂：甲醇：ch2cl2＝1:20)，蒸干，得到的固体进一步用乙醇与水的混合溶剂进行重结晶，即得双光子荧光探针7-(二乙基氨基)-3-(4-羟基喹唑啉-2-基)香豆素。

(4)对该实施例制得的双光子荧光探针进行nmr测试，其¹hnmr谱如图1所示，¹³cnmr谱如图2所示；该双光子荧光探针的核磁数据具体为：¹hnmr(400mhz,cdcl3)δ＝11.97(brs,1h),9.03(s,1h),8.20(d,j＝8hz,1h),7.63-7.64(m,2h),7.42(d,j＝8hz,1h),7.32-7.34(m,2h),6.59-6.62(m,1h),6.41(s,1h)ppm。¹³cnmr(100mhz,cdcl3)δ＝162.42,161.48,157.61,152.93,149.23,148.91,146.26,134.32,131.33,127.06,126.64,125.94,121.37,110.43,108.81,107.73,96.68,45.21,12.46ppm。该双光子荧光探针的质谱数据为：hr-msm/z[m+h]⁺calcd:362.1499；found:362.1468。对该实施例制得的双光子荧光探针晶体进行测试，测得的晶体结构如图3所示，从其晶体结构图可以看出，该双光子荧光探针与为互变异构体，含有分子内n-h…o型的氢键。

(5)双光子荧光探针7-(二乙基氨基)-3-(4-羟基喹唑啉-2-基)香豆素的双光子活性吸收截面积的测定：配置1ml浓度为1μm的双光子荧光探针的pbs溶液，同时以1.0×10^-5μm罗丹明b甲醇溶液作为参比，在激发波长750-850nm范围内测定探针的双光子荧光光谱，测得结果如图4所示，双光荧光探针的最大吸收波长位于820nm处，其最大双光子活性吸收截面积为299gm。

(6)双光子荧光探针7-(二乙基氨基)-3-(4-羟基喹唑啉-2-基)香豆素的双光子荧光检测：配置5ml浓度为10μm的双光子荧光探针的乙腈溶液，向上述乙腈溶液不断滴加氟离子，每改变一次氟离子的含量，对含有溶液进行双光子荧光检测，设定激发波长范围(700～900nm)，测定500～600nm波长范围的发射情况；测得结果如图5所示，双光子荧光探针的乙腈溶液的荧光发射强度随着氟离子含量的增加而不断降低，氟离子的含量达到750μm时，双光子荧光探针的乙腈溶液的荧光发射强度几乎为零。

(7)双光子荧光探针7-(二乙基氨基)-3-(4-羟基喹唑啉-2-基)香豆素的双光子选择性检测：配置浓度为1μm的双光子荧光探针的溶液，依次加入浓度为1.5mm不同的离子测定加入干扰离子后荧光强度变化情况；测得结果如图6所示，1为so4^2-、2为clo^-、3为hso4^2-、4为br^-、5为no3^-、6为aco^-、7为f^-、8为hpo4^2-、9为cl^-、10为h2po4^-、11为i^-、12为co3^2-；显然，双光子荧光探针只有加入氟离子是才会发生荧光淬灭效应，而加入其他离子，荧光强度并没有发生改变，证明探针对氟离子具有很好的选择性。

(8)双光子荧光探针7-(二乙基氨基)-3-(4-羟基喹唑啉-2-基)香豆素针对细胞中外源性氟离子的细胞成像实验：1号培养皿中hela细胞用4μm的双光子荧光探针孵育2h作为对照；2号培养皿中hela细胞用4μm的双光子荧光探在孵育2h之后，用磷酸缓冲盐溶液(phosphatebuffersaline，pbs)洗三次，再加入750μm氟离子(f^-)继续孵育4h，处理固定。用820nm的激光激发，在明场可以观测到细胞轮廓；而在绿色通道(500～550nm)对细胞进行荧光成像，1号培养皿的细胞成像结果如图7(a)所示，2号培养皿的细胞成像结果如图7(b)所示；显然，1号培养皿固定后可以看到荧光成像图，然而2号培养皿中几乎观测不到荧光发射；此实验现象说明双光子荧光探针探针对细胞中外源性氟离子细胞成像。1号培养皿与2号培养皿的细胞内总荧光强度如图7(c)所示，表明加入氟离子后细胞内总荧光强度明显减弱。

实施例2双光子荧光探针7-(二乙基氨基)-3-(4-((4-硝基苄基)氧基)喹唑啉-2-基)香豆素的制备、表征及性能测试。

(1)按反应式对双光子荧光探针7-(二乙基氨基)-3-(4-羟基喹唑啉-2-基)香豆素简单修饰，即可制得7-(二乙基氨基)-3-(4-((4-硝基苄基)氧基)喹唑啉-2-基)香豆素，具体步骤为：在50ml的圆底烧瓶中，加入双光子荧光探针7-(二乙基氨基)-3-(4-羟基喹唑啉-2-基)香豆素(0.5mmo，180.7mg)，对硝基卞溴(1.0mmol，216mg)以及csco3(0.75mmol，244.4mg)，再加入溶剂n,n-二甲基甲酰胺(dmf)3ml，冰浴下搅拌3h，接着在室温下反应24h，tlc监测，直到反应完全后，将反应混合液倒入冰水中，抽滤，烘干，然后柱层析分离，得到双光子探针，产率为20％。

(2)对该实施例制得的双光子荧光探针进行nmr测试，其¹hnmr谱如图8所示，¹³cnmr谱如图9所示；该双光子荧光探针的核磁数据具体为：¹hnmr(400mhz,dmso-d6)δ8.20(d,j＝8.0hz,1h),8.11–8.04(m,3h),7.92(t,j＝7.4hz,1h),7.76(d,j＝8.1hz,1h),7.63(t,j＝7.5hz,1h),7.43(d,j＝9.0hz,1h),7.38(s,2h),6.75(dd,j＝8.9,2.3hz,1h),6.60(d,j＝2.3hz,1h),5.59(s,1h),5.19(s,1h),3.47(d,j＝7.1hz,4h),1.14(t,j＝7.0hz,6h)。¹³cnmr(100mhz,dmso-d6)δ161.66,159.96,157.36,152.45,152.12,147.57,146.91,145.88,145.39,135.46,130.88,128.18,127.90,126.93,123.93,120.85,114.93,110.11,107.40,96.83,48.27,44.68,12.79。该双光子荧光探针的质谱数据为：ms(ei)m/z497.0(m⁺)。

(3)双光子荧光探针7-(二乙基氨基)-3-(4-((4-硝基苄基)氧基)喹唑啉-2-基)香豆素对硝基还原酶选择性测试：配置浓度为5μm的双光子荧光探针的pbs溶液，测试加入不同的物质对探针响应情况；测得结果如图10所示，1为空白、2为kcl、3为nacl、4为谷氨酸(glutamicacid)、5为葡萄糖(glucose)、6为甘氨酸(glycine)、7为苯丙氨酸(phenylalanine)、8为色氨酸(tryptophan)、9为酪氨酸(tyrosine)、10为维生素c(vitaminc)、11为h2o2、12为naclo、13为硝基还原酶；显然，当加入其他生物分子时，并没出现信号响应，只有加入硝基还原酶时，双光子探针荧光强度显著增大。

(4)双光子荧光探针7-(二乙基氨基)-3-(4-((4-硝基苄基)氧基)喹唑啉-2-基)香豆素在不同氧气浓度下细胞成像实验：取3个培养皿，对培养皿进行编号，将1号培养皿放到正常氧气浓度(20％)下培育6h；将2、3号培养皿放在无氧培养箱中培育6h；再在3个培养皿中分别加入双光子荧光探针7-(二乙基氨基)-3-(4-((4-硝基苄基)氧基)喹唑啉-2-基)香豆素5μm培育1h，同时在3号培养皿中加入0.5mm双羟基香豆素做抑制剂。用820nm的激光激发，用820nm激光激发，在明场可以观测到细胞轮廓；而在绿色通道(500～50nm)对1、2、3号培养皿中双光子荧光探针7-(二乙基氨基)-3-(4-((4-硝基苄基)氧基)喹唑啉-2-基)香豆素的细胞进行荧光成像的结果分别如图11(a)、11(b)、11(c)所示，可知，1号培养皿基本观测不到荧光信号，2号培养皿中可以看到很强的荧光信号，3号培养皿与2号培养皿相比由于加了抑制剂荧光信号减弱；此实验现象证明了双光子荧光探针7-(二乙基氨基)-3-(4-((4-硝基苄基)氧基)喹唑啉-2-基)香豆素能够被细胞中硝基还原酶还原，生成双光子探针，即双光子荧光探针7-(二乙基氨基)-3-(4-((4-硝基苄基)氧基)喹唑啉-2-基)香豆素可成功应用于无氧条件下细胞中硝基还原酶的检测，是一种硝基还原酶探针。

(5)双光子荧光探针7-(二乙基氨基)-3-(4-((4-硝基苄基)氧基)喹唑啉-2-基)香豆素线粒体共定位双光子细胞成像实验：hela细胞在无氧条件下孵育5.5h，加入商业化线粒体染料(100nm)继续孵育0.5h，pbs洗三次，再加入5μm双光子荧光探针7-(二乙基氨基)-3-(4-((4-硝基苄基)氧基)喹唑啉-2-基)香豆素孵育1h；用820nm的激光激发，在明场可以观测到细胞轮廓；而在绿色通道(500～550nm)对细胞进行荧光成像时，可以看到荧光成像图；用561nm的激光激发时，可以用红色通道(570～620nm)对细胞进行荧光信号采集，此为商业化线粒体染料发出的红光，用软件处理可以得到两种染料的共定位系数为0.78；双光子荧光探针7-(二乙基氨基)-3-(4-((4-硝基苄基)氧基)喹唑啉-2-基)香豆素线粒体共定位双光子细胞成像如图12(a)所示，为无氧条件下加入双光子荧光探针7-(二乙基氨基)-3-(4-((4-硝基苄基)氧基)喹唑啉-2-基)香豆素绿色通道荧光成像图；如图12(b)所示，为商业线粒体染料红色通道细胞成像图，如图12(c)，为蓝色通道和红色通道叠加图，可知，双光子荧光探针7-(二乙基氨基)-3-(4-((4-硝基苄基)氧基)喹唑啉-2-基)香豆素能够共定位线粒体同时与硝基还原酶发生反应；该实验现象说明双光子荧光探针7-(二乙基氨基)-3-(4-((4-硝基苄基)氧基)喹唑啉-2-基)香豆素能够靶向线粒体，检测线粒体硝基还原酶活性。

综上所述，本发明提供一种双光子荧光探针及其制备方法与应用，本发明的双光子荧光探针以喹唑啉-香豆素结构为中心，提升了分子平面性，大大增强了双光子荧光，增大了双光子活性吸收截面积，其双光子活性吸收截面积高达299gm，由此增大了双光子成像的明亮度，进而提高了双光子成像的分辨率；其可针对细胞外源性氟离子成像，从而实现对细胞中的外源性氟离子进行检测；通过对双光子荧光探针的简单修饰，使其具有定位线粒体细胞成像和检测细胞中硝基还原酶双重功能，从而扩大了双光子荧光探针的应用范围。

应当理解的是，本发明的应用不限于上述的举例，对本领域普通技术人员来说，可以根据上述说明加以改进或变换，所有这些改进和变换都应属于本发明所附权利要求的保护范围。