本发明涉及天然肽的提取技术领域，尤其涉及一种鳖肽的提取方法。
背景技术：
中华鳖，是常见的养殖龟种，其肉味鲜美，营养丰富，其中的蛋白质含量高高达16％左右。鳖的常规加工方法主要是蒸煮和简单的酶解，对分子量没有控制，生物活性高的成分含量少，人体吸收率低。因此，如何从鳖中提取出一种人体更容易吸收利用、生产成本低、生物活性高的蛋白多肽，对人体的健康有着重要的意义。
技术实现要素：
针对现有的鳖肽生产提取方法不成熟，且工艺方法复杂、周期过长、生产成本高以及活性物质少等问题，本发明提供一种鳖肽的提取方法。
为达到上述发明目的，本发明实施例采用了如下的技术方案：
一种鳖肽的提取方法，包括以下工艺步骤：
a、将鳖肉绞碎，加入纯化水进行蒸煮；
b、降温至55～57℃，加入脂肪酶和糖化酶，搅拌反应0.5～1h；
c、调节ph值至7～8，加入硫酸钙，芽孢杆菌蛋白酶、胰蛋白酶、半胱氨酸蛋白酶和乳酸杆菌蛋白酶，搅拌反应3～4h；
d、升温灭酶；
e、分离和纯化，得到鳖肽。
相对于现有技术，本发明的鳖肽提取方法中使用芽孢杆菌蛋白酶和胰蛋白酶两种酶的结合作为蛋白质的主要水解酶，其中芽孢杆菌蛋白酶属于中性蛋白酶，可以将鳖肉中的蛋白质剪切为小分子的肽，但是如果单纯的加入芽孢杆菌蛋白酶，则鳖肉中只有少部分蛋白可以被水解成小肽，大部分蛋白因无法与芽孢杆菌蛋白酶充分接触不能被水解，因此，最终得到的小分子活性肽得率非常低，而将芽孢杆菌蛋白酶和胰蛋白酶同时加入，不仅可以加快蛋白水解进程，同时，胰蛋白酶的加入，可以促进芽孢杆菌蛋白酶与鳖肉中不易裸露出来的蛋白质充分接触，使鳖肉中90％以上的蛋白质被水解，大大提高了鳖肽的得率和小分子活性肽的含量。乳酸杆菌蛋白酶，可以将水解出的苦肽从多肽链上切除，去除苦味，虽然乳酸杆菌蛋白酶可以去除苦肽，但其水解度最高只有75％左右，仍然有部分苦肽不能去除，本发明在乳酸杆菌蛋白酶的基础上，加入半胱氨酸蛋白酶，可以加快苦肽的水解速度和水解程度，彻底去除鳖肽中的苦味，同时，两种酶结合使用还可以去除鳖肽中的特殊腥味，进一步提高水解产物的风味，提高产品的质量和药用价值。
优选地，所述步骤a中加入鳖肉质量的7～8倍纯化水，蒸煮6～7h。
优选地，所述步骤b中脂肪酶由黑曲霉发酵得到，加入质量占鳖肉质量的1～1.5％。
优选地，所述步骤b中糖化酶由米根霉发酵得到，加入质量占鳖肉质量的0.5～1％。
优选地，所述步骤c中硫酸钙的加入质量占鳖肉质量的0.1％，硫酸钙的加入可以有效提高蛋白酶的稳定性。
优选地，所述步骤c中芽孢杆菌蛋白酶由嗜热脂肪地衣芽胞杆菌发酵得到，加入质量占鳖肉质量的0.5～1％，可以将蛋白质剪切成小分子的肽段。
优选地，所述步骤c中胰蛋白酶的加入质量占鳖肉质量的0.5～1％；半胱氨酸蛋白酶的加入质量占鳖肉质量的0.1～0.2％；乳酸杆菌蛋白酶的加入质量占鳖肉质量的0.3～0.5％。
优选地，所述步骤e中的分离过程，先用卧螺离心机，3600r/min，离心过滤10～15min；再用三相离心机进行离心纯化。
优选地，所述步骤e中的纯化过程中，先用0.2纳米的纳滤膜脱盐后，将截留液浓缩至原体积的1/3～1/2，再用0.5纳米的纳滤膜分离纳滤液，得到的透过液浓缩至原体积的1/5～1/3。经过纳滤膜分离纯化，得到分子量在180～500道尔顿的肽。
优选地，所述步骤e中的干燥方法采用喷雾干燥。
通过本发明的提取方法得到的鳖肽，含有大量的高活性小分子肽，其分子量在180～500道尔顿之间，与人工合成的肽产品相比，制备过程简单、生产周期短、成本低，生产过程中不会产生污染，得到的产品的活性更高，使人体能更好的吸收，吸收率达100％，其产品口感好，无异味，无苦味，可广泛应用于食品、保健品、药品等领域
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
实施例1
一种鳖肽的提取方法，包括以下工艺步骤：
a、对鳖宰杀后去除壳和内脏，将鳖肉用绞肉机绞碎，取100g鳖肉，加入占鳖肉质量7倍的纯化水，在95℃条件下，蒸煮7h；该过程可以破坏细胞结构，暴露细胞中的蛋白质，同时使鳖肉中的蛋白质变性，利于蛋白酶的水解。
b、降温至57℃，加入占鳖肉质量1％的脂肪酶和占鳖肉质量0.5％的糖化酶，搅拌条件下，反应1h，其中脂肪酶由黑曲霉发酵得到，糖化酶由米根霉发酵得到；该过程可以降解鳖肉中的脂肪和多糖，以便提高活性肽的收率和质量。
c、氢氧化钠调节反应液ph值至7，加入占鳖肉质量0.1％的硫酸钙，钙离子的加入可以增加蛋白酶的稳定性，提高蛋白酶的活性，搅拌均匀后，加入分别占鳖肉质量0.5％的芽孢杆菌蛋白酶、0.5％的胰蛋白酶、0.1％的半胱氨酸蛋白酶和0.3％的乳酸杆菌蛋白酶，50r/min搅拌反应4h。其中芽孢杆菌蛋白酶为嗜热脂肪地衣芽胞杆菌发酵得到的内切蛋白酶。芽孢杆菌蛋白酶和胰蛋白酶的结合，使酶解反应温和，使分子量酶切均匀、能保持龟鳖骨肉中活性成分不被氧化，同时还能大大提高小分子产品收率；半胱氨酸蛋白酶和乳酸杆菌蛋白酶的加入，能酶解肽链上的苦味氨基酸，使产品口感更好，苦肽去除率可达到99％以上，提高产品的质量和药用价值。
d、升温至90℃，灭酶15min，使蛋白酶失活，终止酶解反应。
e、使用卧螺离心机，3600r/min离心过滤10min，留取过滤液，再采用三相离心机，进行离心过滤纯化，去除滤液中的脂肪和悬浮物；用0.2纳米的纳滤膜脱盐后，将截留液浓缩至原体积的1/3～1/2，再用0.5纳米的纳滤膜分离纳滤液，取透过液浓缩至原体积的1/5～1/3，喷雾干燥，得到成品鳖肽。采用不同孔径的纳滤膜可以脱除单个氨基酸和盐分以及大于500道尔顿的肽，干燥得到分子量在180～500道尔顿的高活性小分子肽产品，适用于药品及保健食品等针对不同人群健康产品的特殊要求。
经过实施例1的工艺步骤，得到11.3g的180～500道尔顿的小分子高活性鳖肽产品，该小分子高活性鳖肽产品的提取量达到鳖肉总蛋白含量的70％，溶于水后无腥味和苦味。
实施例2
一种鳖肽的提取方法，包括以下工艺步骤：
a、对鳖宰杀后去除壳和内脏，将鳖肉用绞肉机绞碎，取100g鳖肉，加入占鳖肉质量8倍的纯化水，在96℃条件下，蒸煮6h；该过程可以破坏细胞结构，暴露细胞中的蛋白质，同时使鳖肉中的蛋白质变性，利于蛋白酶的水解。
b、降温至56℃，加入占鳖肉质量1.5％的脂肪酶和占鳖肉质量1％的糖化酶，搅拌条件下，反应1h，其中脂肪酶由黑曲霉发酵得到，糖化酶由米根霉发酵得到；该过程可以降解鳖肉中的脂肪和多糖，以便提高活性肽的收率和质量。
c、氢氧化钠调节反应液ph值至7，加入占鳖肉质量0.1％的硫酸钙，钙离子的加入可以增加蛋白酶的稳定性，提高蛋白酶的活性，搅拌均匀后，加入分别占鳖肉质量0.8％的芽孢杆菌蛋白酶、0.8％的胰蛋白酶、0.15％的半胱氨酸蛋白酶和0.4％的乳酸杆菌蛋白酶，60r/min搅拌反应4h。其中芽孢杆菌蛋白酶为嗜热脂肪地衣芽胞杆菌发酵得到的内切蛋白酶。芽孢杆菌蛋白酶和胰蛋白酶的结合，使酶解反应温和，使分子量酶切均匀、能保持龟鳖骨肉中活性成分不被氧化，同时还能大大提高小分子产品收率；半胱氨酸蛋白酶和乳酸杆菌蛋白酶的加入，能酶解肽链上的苦味氨基酸，使产品口感更好，苦肽去除率可达到99％以上，提高产品的质量和药用价值。
d、升温至95℃，灭酶10min，使蛋白酶失活，终止酶解反应。
e、使用卧螺离心机，3600r/min离心过滤10min，留取过滤液，再采用三相离心机，进行离心过滤纯化，去除滤液中的脂肪和悬浮物；用0.2纳米的纳滤膜脱盐后，将截留液浓缩至原体积的1/3～1/2，再用0.5纳米的纳滤膜分离纳滤液，取透过液浓缩至原体积的1/5～1/3，喷雾干燥，得到成品鳖肽。采用不同孔径的纳滤膜可以脱除单个氨基酸和盐分以及大于500道尔顿的肽，干燥得到分子量在180～500道尔顿的高活性小分子肽产品，适用于药品及保健食品等针对不同人群健康产品的特殊要求。
经过实施例2的工艺步骤，得到11.8g的180～500道尔顿的小分子高活性鳖肽产品，该小分子高活性鳖肽产品的提取量达到鳖肉总蛋白含量的74％，溶于水后无腥味和苦味。
实施例3
一种鳖肽的提取方法，包括以下工艺步骤：
a、对鳖宰杀后去除壳和内脏，将鳖肉用绞肉机绞碎，取100g鳖肉，加入占鳖肉质量8倍的纯化水，在98℃条件下，蒸煮6h；该过程可以破坏细胞结构，暴露细胞中的蛋白质，同时使鳖肉中的蛋白质变性，利于蛋白酶的水解。
b、降温至55℃，加入占鳖肉质量1.5％的脂肪酶和占鳖肉质量1％的2糖化酶，搅拌条件下，反应0.5h，其中脂肪酶由黑曲霉发酵得到，糖化酶由米根霉发酵得到；该过程可以降解鳖肉中的脂肪和多糖，以便提高活性肽的收率和质量。
c、氢氧化钠调节反应液ph值至8，加入占鳖肉质量0.1％的硫酸钙，钙离子的加入可以增加蛋白酶的稳定性，提高蛋白酶的活性，搅拌均匀后，加入分别占鳖肉质量1％的芽孢杆菌蛋白酶、1％的胰蛋白酶、0.2％的半胱氨酸蛋白酶和0.5％的乳酸杆菌蛋白酶，50r/min搅拌反应3h。其中芽孢杆菌蛋白酶为嗜热脂肪地衣芽胞杆菌发酵得到的内切蛋白酶。芽孢杆菌蛋白酶和胰蛋白酶的结合，使酶解反应温和，使分子量酶切均匀、能保持龟鳖骨肉中活性成分不被氧化，同时还能大大提高小分子产品收率；半胱氨酸蛋白酶和乳酸杆菌蛋白酶的加入，能酶解肽链上的苦味氨基酸，使产品口感更好，苦肽去除率可达到99％以上，提高产品的质量和药用价值。
d、升温至95℃，灭酶10min，使蛋白酶失活，终止酶解反应。
e、使用卧螺离心机，3600r/min离心过滤15min，留取过滤液，再采用三相离心机，进行离心过滤纯化，去除滤液中的脂肪和悬浮物；用0.2纳米的纳滤膜脱盐后，将截留液浓缩至原体积的1/3～1/2，再用0.5纳米的纳滤膜分离纳滤液，取透过液浓缩至原体积的1/5～1/3，喷雾干燥，得到成品鳖肽。采用不同孔径的纳滤膜可以脱除单个氨基酸和盐分以及大于500道尔顿的肽，干燥得到分子量在180～500道尔顿的高活性小分子肽产品，适用于药品及保健食品等针对不同人群健康产品的特殊要求。
经过实施例3的工艺步骤，得到10.8g的180～500道尔顿的小分子高活性鳖肽产品，该小分子高活性鳖肽产品的提取量达到鳖肉总蛋白含量的68％，溶于水后无腥味和苦味。
对比例1
将实施例2步骤c中的胰蛋白酶用菠萝蛋白酶代替，最终得到4.7g的180～500道尔顿的小分子高活性鳖肽产品，该小分子高活性鳖肽产品的提取量占鳖肉总蛋白含量的29％，溶于水后无腥味和苦味。
对比例2
将实施例2步骤c中的芽孢杆菌蛋白酶用菠萝蛋白酶代替，最终得到1.2g的180～500道尔顿的小分子高活性鳖肽产品，该小分子高活性鳖肽产品的提取量占鳖肉总蛋白含量的7.5％，溶于水后无腥味和苦味。
对比例3
将实施例2步骤c中的半胱氨酸蛋白酶用米曲霉发酵得到的复合风味蛋白酶代替，最终得到8.2g的180～500道尔顿的小分子高活性鳖肽产品，该小分子高活性鳖肽产品的提取量占鳖肉总蛋白含量的51％，溶于水后有轻微的腥味。
通过对比实施例1～3和对比例1～3得到的鳖肽产品的得率和质量，可以发现，通过本发明的鳖肽提取方法，得到的小分子高活性鳖肽产品得率高且不含其它异味，使人体能更好的吸收，吸收率达100％，产品口感好，无异味，无苦味，可广泛应用于食品、保健品、药品等领域。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换或改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。